Przeciwciała anty-HSP70 w surowicy chorych na toczeń rumieniowaty układowy

Wstęp
Przedwczesna miażdżyca u chorych na toczeń rumieniowaty układowy (systemic lupus erythematosus – SLE) została po raz pierwszy opisana przez Bulkleya i Robertsa w 1975 r. na podstawie badań autopsyj- nych [1]. Od tego czasu wielu autorów wykazało przedwczesne występowanie klinicznie jawnej lub subklinicznej miażdżycy u chorych na SLE. Zwiększone występowanie miażdżycy w tej grupie chorych nie daje się wytłumaczyć tylko klasycznymi czynnikami ryzyka Framingham [2], dlatego też coraz więcej uwagi poś-więca się wzajemnym interakcjom pomiędzy klasycznymi i nieklasycznymi czynnikami ryzyka rozwoju miażdżycy w populacji chorych na SLE.
Toczeń rumieniowaty układowy jest schorzeniem zapalnym o podłożu autoimmunologicznym, na które zapadają głównie kobiety w wieku rozrodczym. Chociaż dzięki zastosowaniu leczenia immunosupresyjnego przeżywalność chorych na SLE znacznie wzrosła, choroba nadal powoduje ok. 15-procentową śmiertelność w ciągu 10 lat od zachorowania. Główne przyczyny wczesnej śmiertelności chorych na SLE to niekontrolowana aktywność choroby podstawowej oraz powikłania infekcyjne, natomiast późne powikłania choroby mają najczęściej podłoże sercowo-naczyniowe (krążeniowe).
Na podstawie badań wykazano, że chorzy na SLE znacznie częściej zapadają na miażdżycę naczyń i jej powikłania, obarczeni są także większym ryzykiem wystąpienia zmian zakrzepowo-zatorowych. W badaniach autopsyjnych stwierdzono obecność zmian miażdżycowych w głównych naczyniach wieńcowych u 22–54% stosunkowo młodych chorych na SLE poddanych długotrwałej kortykoterapii [3]. Tradycyjne czynniki ryzyka miażdżycy naczyń, takie jak: nadciśnienie tętnicze, zaburzenia gospodarki lipidowej, cukrzyca czy otyłość, mogą stanowić powikłania choroby podstawowej, a także jej terapii. Bruce i wsp. wykazali, że u chorych na SLE nadciśnienie tętnicze i cukrzyca występowały istotnie częściej niż w dobranej pod względem wieku grupie kontrolnej [4]. Okazało się jednak, że po uwzględnieniu różnic w występowaniu klasycznych krążeniowych czynników ryzyka, ryzyko choroby wieńcowej i udaru mózgu wciąż było u chorych na SLE siedmiokrotnie wyższe niż w populacji kontrolnej, co świadczy o tym, że istnieją dodatkowe czynniki zwiększające u tych chorych zapadalność na choroby układu krążenia [2].
Miażdżyca naczyń jest chorobą, w której proces zapalny i zjawiska z autoagresji odgrywają istotną rolę. Proces zapalny towarzyszący SLE, uszkodzenie śródbłonka naczyń, zwiększone stężenie białka C-reaktywnego, a także licznych cytokin prozapalnych i homocysteiny, synteza autoprzeciwciał, takich jak przeciwciała antyfosfolipidowe i przeciwciała przeciwko utlenowanym cząsteczkom LDL (anty-oxLDL), wpływają na przedwczesny rozwój miażdżycy naczyń i ryzyko powikłań zatorowo-zakrzepowych.
Coraz więcej danych przemawia za udziałem białek wstrząsu cieplnego (heat-shock proteins – HSP) i skierowanych przeciwko nim przeciwciał w patogenezie rozwoju miażdżycy. Białka wstrząsu cieplnego są grupą białek syntetyzowanych w dużych ilościach w odpowiedzi na działanie bodźców uszkadzających, do których należą m.in. zapalenie, infekcje oraz stres oksydacyjny. W blaszce miażdżycowej zaobserwowano zwiększoną ekspresję białek HSP60 i HSP70 [5]. Ponadto, opisano związek obecności przeciwciał anty-HSP65 z pogrubieniem ściany tętnicy szyjnej oraz chorobą niedokrwienną serca [6, 7]. Stwierdzono także związek przeciwciał anty-HSP60 z obecnością i ciężkością choroby niedokrwiennej serca [8]. Rola przeciwciał anty-HSP70 w rozwoju zmian miażdżycowych pozostaje niewyjaśniona.
Celem pracy była ocena związku obecności przeciwciał anty-HSP70 z obecnością wczesnych zmian miażdżycowych ocenianych za pomocą pomiaru IMT w badaniu ultrasonograficznym tętnic szyjnych w grupie chorych na SLE.

Materiał i metody
Do badania zakwalifikowano 16 chorych (15 kobiet i 1 mężczyznę) w wieku 27–60 lat (średnia 44,4 roku) z ustalonym rozpoznaniem tocznia rumieniowatego trzewnego, spełniających kryteria klasyfikacyjne z 1982 r. [9]. Grupę kontrolną stanowiło 13 zdrowych kobiet (ochotniczek) dobranych pod względem wieku (24–57 lat; średnia 43,1 roku), u których wykluczono SLE oraz inne układowe choroby tkanki łącznej. U osób z grupy kontrol-nej nie stwierdzono choroby nowotworowej ani cech ostrej lub przewlekłej infekcji. Osoby te nie podawały chorób sercowo-naczyniowych w wywiadzie. W badaniu fizykalnym nie stwierdzono u nich istotnych odchyleń od normy ani podwyższonego ciśnienia tętniczego, a zapis EKG był prawidłowy.
Dane poddane analizie uzyskano z wywiadu, badania lekarskiego, dodatkowych badań laboratoryjnych oraz badania ultrasonograficznego tętnic szyjnych. Aktywność choroby w grupie pacjentów z SLE wyrażano za pomocą wskaźnika SLEDAI (systemic lupus erythematosous disease activity index).
Nadciśnienie rozpoznawano wówczas, gdy war- tości średnie co najmniej dwóch pomiarów wynosiły > 140 mm Hg dla ciśnienia skurczowego i/lub > 90 mm Hg dla ciśnienia rozkurczowego bądź osoba chora otrzymywała leki hipotensyjne.
Hipercholesterolemię rozpoznawano wówczas, gdy stężenie cholesterolu frakcji LDL w osoczu było większe niż 3,0 mmol/l lub osoba chora przyjmowała leki hipolipemizujące.

Badanie ultrasonograficzne tętnic szyjnych
Badanie ultrasonograficzne tętnic szyjnych wykonano w grupie badanej i grupie kontrolnej aparatem Vingmed System 5 za pomocą głowicy liniowej o częstotliwości 10 MHz. U każdego chorego dokonano obustronnie dwóch pomiarów grubości kompleksu błony środkowej i wewnętrznej tętnic szyjnych (intima--media thickness – IMT) w tętnicy szyjnej wspólnej (carotis communis arteria – CCA), tętnicy szyjnej wewnętrznej (interia carotis arteria – ICA) oraz opuszce tętnicy szyjnej wspólnej (OP).

Badania immunologiczne W obu grupach oznaczono metodą ELISA stężenia przeciwciał anty-HSP70 (EKS-750, Assay Designs). Do badania wykorzystano surowicę uzyskaną z pobrania krwi żylnej, którą przechowywano zamrożoną w temperaturze –20°C.

Metody statystyczne
Założenia normalności rozkładu analizowano za pomocą testu W Shapiro-Wilka i testu Lilieforsa, założenia jednorodności wariancji przy użyciu testu Levene’a i testu Browna-Forsytha. Analizowane cechy miały rozkłady normalne lub zbliżone do normalnych. Zastosowano następujące parametryczne metody statystyczne: test t-Studenta, jednoczynnikowe analizy wariancji (ANOVA) z powtórzeniami, wielowymiarową analizę wariancji (MANOVA z powtórzeniami) oraz dwuczynnikową analizę wariancji z powtórzeniami. W przypadku korelacji liniowej pomiędzy zmiennymi wyznaczono współczynnik korelacji liniowej Pearsona, a w pozostałych przypadkach zmienne poddano analizie testem Spearmana. Uzyskane wyniki uznano za istotne statystycznie, jeśli p ≤ 0,05. Z
godę na badanie wydała Komisja Bioetyczna przy Akademii Medycznej im. Piastów Śląskich we Wrocławiu.

Wyniki
Chorzy byli pacjentami Oddziału Chorób Wewnętrznych i Reumatologii Okręgowego Szpitala Kolejowego we Wrocławiu oraz Kliniki Reumatologii i Chorób Wewnętrznych Akademii Medycznej im. Piastów Śląskich we Wrocławiu. Charakterystykę badanej populacji przedstawiono w tabeli I. Wyniki podstawowych badań laboratoryjnych uzyskanych w grupie badanej przedstawiono w tabeli II, a wyniki badania ultrasonograficznego tętnic w tabeli III.
W grupie chorych na SLE stwierdzono obustronnie istotnie zwiększoną wartość IMT w tętnicy szyjnej wspólnej, tętnicy szyjnej wewnętrznej oraz opuszce tętnicy szyjnej wewnętrznej, co świadczy o istnieniu bardziej zaawansowanych zmian miażdżycowych w tej grupie. W grupie chorych na SLE IMT korelowało istotnie statystycznie z wiekiem (współczynnik korelacji wynosił dla Mean_R, Mean_L, Mean_ALL i Mean_OP odpowiednio RP = 0,61, RP = 0,58, RP = 0,62 i RP = 0,65; p < 0,05). Ponadto, w grupie chorych na SLE stwierdzono ujemną korelację pomiędzy stężeniem cholesterolu HDL a średnią IMT prawej tętnicy szyjnej wspólnej (RP = –0,54, p < 0,05). Grubość kompleksu intima-media w grupie chorych na SLE korelowała również istotnie statystycznie z dawką przyjmowanych glikokortykosteroidów (współczynnik korelacji wynosił dla Mean_R, Mean_L, Mean_ALL i Mean_OP odpowiednio RP = –0,69, RP = –0,60, RP = –0,65 i RP = –0,70; p < 0,05).
Stężenia przeciwciał skierowanych przeciwko białku wstrząsu cieplnego HSP70 nie różniły się w badanych grupach istotnie statystycznie (188,0 ±80,0 µg/ml w grupie chorych na SLE vs 150,4 ±81,2 g/ml w grupie kontrolnej; p > 0,05). Nie wykazano związku pomiędzy IMT a stężeniem przeciwciał anty-HSP70 w badanych grupach.


Dyskusja
Ostre incydenty wieńcowe, będące jednym z powikłań miażdżycy, występują niezwykle rzadko u kobiet < 50. roku życia. Wyjątek stanowią pacjentki z rodzinną hipercholesterolemią, przedwczesną menopauzą, reumatoidalnym zapaleniem stawów oraz SLE. Choroba niedokrwienna serca jest jedną z głównych przyczyn przedwczesnej umieralności kobiet chorych na SLE [10]. Badania przeprowadzone w populacji szwedzkiej przez Svenungssona i wsp., porównujące pacjentki chorujące na SLE ze współistniejącą chorobą niedokrwienną serca i bez niej, nie wykazały pomiędzy tymi subpopulacjami istotnych różnic w zakresie klasycznych czynników ryzyka, tj. ciśnienia tętniczego, wskaźnika masy ciała (body mass index – BMI), palenia papierosów oraz współistnienia cukrzycy [11]. Klinicznie jawna miażdżyca występuje u 6–12% chorych na SLE [12], jednak z uwagi na związaną z nią zwiększoną śmiertelność niezwykle ważne jest rozpoznanie tej choroby w okresie bezobjawowym.
W przedstawionym badaniu w celu identyfikowania wczesnych zmian w naczyniach wykonano badanie ultrasonograficzne tętnic szyjnych z oceną IMT, na podstawie którego stwierdzono, że w grupie chorych na SLE błona wewnętrzna w tętnicach szyjnych jest istotnie grubsza niż w grupie kontrolnej.
U ponad 60% chorych na SLE autorzy niniejszej pracy stwierdzili hiperlipidemię, definiowaną jako stęże-nie cholesterolu frakcji LDL w osoczu większe niż 3,0 mmol/l lub sytuację, gdy chory otrzymywał leki hipolipemizujące. Obserwowany w badanej grupie proaterogenny lipidogram, wyrażający się istotnie zwiększonym stężeniem cholesterolu frakcji LDL (średnia 3,6 mmol/l), triglicerydów (średnia 4,0 mmol/l) i cholesterolu całkowitego (średnia 5,9 mmol/l), mógł przyczynić się do zwiększenia IMT w tej grupie. Zwiększone stężenie cholesterolu całkowitego, cholesterolu frakcji LDL i triglicerydów u chorych na SLE opisali także inni autorzy [13, 14], chociaż za typowy „toczniowy profil lipidowy” uważa się zwiększenie stężenia triglicerydów, zmniejszenie stężenia cholesterolu frakcji HDL oraz prawidłowe lub nieznacznie zwiększone stężenie cholesterolu frakcji LDL [15]. W badanej grupie nie stwierdzono opisywanego przez innych autorów istotnego zmniejszenia stężenia cholesterolu frakcji HDL [15], co może wynikać ze zbyt małej liczebności badanej grupy. W badanej populacji poza ujemną korelacją stężenia cholesterolu frakcji HDL z wartością OB nie zaobserwowano opisywanego w piśmiennictwie związku zaburzeń lipidogramu z aktywnością tocznia rumieniowatego trzewnego [11, 15].
Białka wstrząsu cieplnego, pomimo znacznego podobieństwa międzygatunkowego, są silnie immunogenne i podejrzewa się, że mogą aktywować komórki prezentujące antygen. Przeciwciała anty-HSP (najczęściej anty-HSP60, anty-HSP70 i anty-HSP90) stwierdza się w przebiegu wielu chorób infekcyjnych. Są one także wykrywane w surowicy pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi, np. z SLE (anty-HSP60, anty- -HSP70 i anty-HSP90), reumatoidalnym zapaleniem stawów (anty-HSP60, anty-HSP70) i nieswoistymi zapaleniami jelit (anty-HSP60, anty-HSP70 i anty- -HSP90). Brak istotnej statystycznie różnicy stężeń przeciwciał anty-HSP70 w badanych grupach może wynikać z narażenia grupy kontrolnej na różne czynniki infekcyjne oraz z niewielkiej liczebności badanych grup. Stwierdzone w grupie kontrolnej stężenie przeciwciał anty-HSP70 (150,4 ±81,2 µg/ml) odpowiada stężeniu stwierdzonemu przez Child i wsp. (średnia 150 µg/ml; zakres 88–207 µg/ml) [16].
W przedstawionej pracy autorzy nie wykazali związku pomiędzy obecnością przeciwciał przeciwko białku wstrząsu cieplnego o masie cząsteczkowej 70 kDa a rozwojem miażdżycy u chorych na SLE. Może to świadczyć o tym, że w przeciwieństwie do przeciwciał anty-HSP60 i anty-HSP65 [6] nie uczestniczą one w patogenezie miażdżycy. Możliwe jest również, że zgodnie z hipotezą Dorii i wsp. stosowane leczenie zmniejsza udział przeciwciał skierowanych przeciwko białkom wstrząsu cieplnego w patogenezie miażdżycy u chorych na SLE [17]. Na uzyskany brak korelacji może także wpływać mała liczebność badanych grup.

Badania wykonano z grantu Akademii Medycznej we Wrocławiu.

Piśmiennictwo  
1. Bulkley B, Roberts W. The heart in SLE and changes induced init by corticosteroid therapy: a study of 36 necroscopy cases. Am J Med 1975; 53: 243-264.  
2. Esdaile J, Abrahamowicz M, Grodzicky T, et al. Traditional Framingham risk factors fail to fully account for accelerated atherosclerosis in systemic lupus erythematosous. Arthritis Rheum 2001; 44: 2231-2237.  
3. Nikpour M, Urowitz M, Gladman D. Premature atherosclerosis In systemic lupus erythematosus. Rheum Dis Clin North Am 2005; 31: 329-359.  
4. Bruce I, Urowitz M, Gladman D, et al. Risk factors for coronary heart disease in women with systemic lupus erythematosus: The Toronto Risk Factor Study. Arthritis Rheum 2003; 48: 3159-3167.  
5. Pockley G. Heat shock proteins, inflammation, and cardiovascular disease. Circulation 2002; 105: 1012-1017.  
6. Xu Q, Wick G, Willeit J, et al. Association of serum antibodies to heat-shock protein 65 with carotid atherosclerosis. Lancet 1993; 341: 255-259.  
7. Hoppichler F, Lechleitner M, Traweger C, et al. Changes of serum antibodies to heat-shock protein 65 in coronary heart disease and acute myocardial infarction. Atherosclerosis 1996; 126: 333-338.  
8. Zhu J, Quyyumi A, Rott D, et al. Antibodies to human heat-shock protein 60 are associated with the presence and severity of coronary artery disease. Evidence for an autoimmune component of atherogenesis. Circulation 2001; 103: 1071-1075.  
9. Tan E, Cohen A, Fries J, et al. The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1982; 25: 1271-1277.
10. Manger K, Kusus M, Forster C, et al. Factors associated with coronary artery calcification in young female patients with SLE. Ann Rheum Dis 2003; 62: 846-850.
11. Svenungsson E, Jensen-Urstad K, Heimburger M, et al. Risk factors for cardiovascular disease in systemic lupus erythematosus. Circulation 2001; 104: 1887-1893.
12. Urowitz M, Gladman D. Accelerated atheroma in lupus - background. Lupus 2000; 9: 161-165.
13. Leong K, Koh E, Feng P, et al. Lipid profiles in patients with systemic lupus erythematosous. J Rheumatol 1994; 21: 1264-1267.
14. Sari R, Polat M, Taysi S, et al. Serum lipoprotein(a) level and its clinical significance in patients with systemic lupus erythematosous. Clin Rheumatol 2002; 21: 520-524.
15. Frostegard J. Systemic lupus erythematosus and cardiovascular disease. Lupus 2008; 17: 364-367.
16. Child D, Hudson P, Hunter-Lavin C, et al. Birth defects and anti-heat shock protein 70 antibodies in early pregnancy. Cell Stress Chaperones 2006; 11: 101-105.
17. Doria A, Shoenfeld Y, Wu R, et al. Risk factors for subclinical atherosclerosis in a prospective cohort of patients with systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis 2003; 62: 1071-1077.