Występowanie pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzających β-laktamazy (ESβL i AmpC) izolowanych z zakażeń na terenie Instytutu Reumatologii w latach 2006–2008

W ostatnich latach obserwuje się gwałtowny wzrost lekooporności drobnoustrojów szpitalnych [1].
Wynika to z wielu przyczyn [2], z których najważniejsze stanowią:
• hospitalizacja bardzo ciężko chorych pacjentów z poważnymi zaburzeniami odporności,
• stosowanie inwazyjnych zabiegów i wydłużony czas hospitalizacji,
• bardzo duże zużycie antybiotyków, w tym o szerokim zakresie działania [3],
• nadmierna profilaktyka antybiotykowa, a wręcz niewłaściwe i niepotrzebne leczenie antybiotykami.
Głównym mechanizmem oporności pałeczek Gram--ujemnych (w tym pałeczek jelitowych z rodziny Enterobacteriaceae) na antybiotyki β-laktamowe (najczęściej stosowane w praktyce) jest wytwarzanie enzymów, tzw. β-laktamaz, które rozkładają te antybiotyki, hydrolizując pierścień β-laktamowy [4]. Do połączenia cząsteczki antybiotyku z enzymem dochodzi w przestrzeni okołoplazmatycznej komórki bakteryjnej, rezultatem czego jest hydroliza; po rozerwaniu wią-zania amidowego powstaje forma nieaktywna antybiotyku. Szczepy oporne na antybiotyki β-laktamowe w tym mechanizmie są szczególnie niebezpieczne, ponieważ wiele z nich wykazuje równoczesną opor-ność na kilka różnych chemicznie grup antybiotyków, a nierzadko niemal na wszystkie dostępne leki [5, 6].
Opisano wiele typów enzymów β-laktamaz, ale najwięcej problemów terapeutycznych stwarzają:
• enzymy o rozszerzonym spektrum substratowym, tzw. ESβL (extended spectrum β-lactamases), doprowadzające pałeczki Gram-ujemne do oporności na wszystkie penicyliny (bez połączeń z inhibitorami), cefalosporyny (z wyjątkiem cefamycyn, np. cefoksytyny i połączeń z inhibitorami) oraz monobaktamy, np. aztreonam [6–13]; są one przenoszone przez plazmidy,
• β-laktamazy (cefalosporynazy) typu AmpC, rozkładające wszystkie penicyliny i cefalosporyny, z wyjątkiem cefepimu (IV generacja); nie rozkładają też karbapenemów; enzymy te kodowane są chromosomalnie [7, 14],
• metalo-β-laktamazy (MBL – wykorzystujące jony Zn2+ jako kofaktory reakcji hydrolizy β-laktamów); rozkładają one wszystkie penicyliny, cefalosporyny i karbapenemy, stąd ich wykrywanie dotyczy zwłaszcza drobnoustrojów opornych na karbapenemy, tj. najczęściej pałeczek Gram-ujemnych niefermentu-jących, coraz częściej opornych na te antybiotyki [7, 15].
Wymienione enzymy są więc istotnym czynnikiem doprowadzającym do wielolekooporności, zwłaszcza że drobnoustroje wytwarzające je często wykazują oporność krzyżową na inne grupy chemiczne antybiotyków, np. aminoglikozydy, fluorochinolony, tetracykliny i chemioterapeutyk – kotrimoksazol [7].
Celem pracy była ocena częstości występowania na terenie Instytutu Reumatologii drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae, izolowanych z zakażeń w latach 2006–2008, które wytwarzały β-laktamazy ESβL oraz typu AmpC. Takie szczepy bakteryjne są niezwykle ­groźne dla pacjenta i środowiska szpitalnego z uwagi na ograniczone możliwości terapeutyczne oraz trudności w eradykacji.

Materiał i metody
Badane pałeczki Gram-ujemne z rodziny Enterobacteriaceae pochodziły z różnego rodzaju zakażeń, które stwierdzono wśród pacjentów hospitalizowanych w Instytucie Reumatologii w latach 2006–2008.
Liczba izolowanych drobnoustrojów z poszczególnych klinik kształtowała się następująco:
Klinika Reumatologii Wieku Rozwojowego (KRWR): 26 szczepów
Klinika Układowych Chorób Tkanki Łącznej (KChTŁ):
odcinek A: 40 szczepów
odcinek B/C: 179 szczepów
razem: 219

Klinika Reumatologii (KR):  85 szczepów
Klinika Reumoortopedii (KRO):164 szczepy

RAZEM: 494 szczepy

Łącznie badaniom na wytwarzanie β-laktamaz typu ESβL i AmpC poddano 494 szczepy, spośród których zdecydowanie dominowały szczepy pałeczki Escherichia coli (77,5% – 383 szczepy). Izolowane szczepy były bardzo różnorodne i kolejno przedstawiały się następująco: Proteus mirabilis – 31 szczepów, Klebsiella pneumoniae – 18, Enterobacter cloacae – 17, Salmonella enteritidis – 8, Proteus vulgaris, Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens – po 5, Morganella morganii, Pantonea agglomerans – po 4, Klebsiella oxytoca, Citrobacter freundii, C. koseri, Hafnia alvei – po 2, Proteus rettgeri, Enterobacter sakazaki, Escherichia fergusoni, Yersinia pseudotuberculosis, Providencia stuartii i Edwardsiella tarda – po 1 szczepie.
Oprócz rodzaju Escherichia, dominowały kolejno: Proteus sp. – 37, Enterobacter sp. – 23, Klebsiella sp. – 20 szczepów.
Wytwarzanie ESβL przez dany szczep wykrywano zgodnie z zaleceniami Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekooporności Drobnoustrojów (KORDL). Stosowano tzw. test dwóch krążków [7], wykrywający enzymy ESβL u wszystkich gatunków Enterobacteriaceae. W metodzie tej używa się krążków z ceftazydymem 30 μg i cefotaksymem 30 μg ułożonych w odległości 2 cm (pomiędzy środkami) od krążka z amoksycyliną z kwasem klawulonowym 20/10 μg (inhibitor). Jakiekolwiek zahamowanie wzrostu w strefach, do których dyfundował klawulanian, świadczyło o produkcji ESβL.
W niektórych przypadkach, zwłaszcza o cięższym charakterze, zakażeń o etiologii E. coli, Klebsiella sp. i Proteus mirabilis stosowano test przeglądowy wstępny (z cefpodoksymem 10 μg lub ceftazydymem 30 μg, aztreonamem 30 μg, cefotaksymem 30 μg, ceftriaksonem 30 μg), który potwierdzany był krążkami z ceftazydymem 30 μg i ceftazydymem z kwasem klawulonowym 30/10 μg [7]. Jeśli szczep wytwarza ESβL, to średnica strefy zahamowania wokół krążka zawierającego ceftazydym z kwasem klawulonowym jest większa o ≥ 5 mm od średnicy strefy zahamowania wokół krążka z samym ceftazydymem.
Obecność β-laktamaz typu AmpC stwierdzano za pomocą krążków z ceftazydymem 30μg i imipenemem (oddalonych o 2 cm od środka). Ponieważ ten typ enzymu rozkłada ceftazydym, a nie działa na imipenem (karbapenem), będący również induktorem tej β-laktamazy, to w przypadku wytwarzania przez dany szczep bakteryjny AmpC od strony krążka z imipenemem pojawiała się zwiększona strefa zahamowania wzrostu badanego drobnoustroju.

Wyniki
Na dość bogatym materiale, liczącym 494 szczepy drobnoustrojów Gram-ujemnych z rodziny Enterobacteriaceae, izolowanych w latach 2006–2008 z zakażeń (głównie dróg moczowych oraz zdecydowanie rzadziej z ran/ropni i innego materiału) pacjentów hospitalizowanych w 4 klinikach Instytutu Reumatologii, zbadano wytwarzanie β-laktamaz typu ESβL i AmpC.
Na rycinie 1 przedstawiono odsetek szczepów wytwarzających β-laktamazy przez wszystkie badane drobnoustroje oraz przez najliczniej reprezentowane gatunki z rodziny Enterobacteriaceae, jak również odsetek drobnoustrojów wielolekoopornych, tj. opornych co najmniej na 3 grupy chemiczne antybiotyków (chemioterapeutyków).
Analiza wykazała, że spośród wszystkich badanych szczepów zaledwie 5,6% wytwarzało ESβL i 1,4% β-laktamazę typu AmpC, ale już 15,8% wykazywało wielolekooporność. Biorąc pod uwagę najliczniej reprezentowane gatunki, dosyć istotnie odróżniał się od pozo- stałych Enterobacter cloacae, którego ok. 30% szczepów wytwarzało ESβL, a ok. 12% AmpC. Wysoki był również wśród nich (ok. 30%) odsetek wielolekooporności, która – jak widać – całkowicie wynikała z wytwarzania enzymu ESβL i/lub częściowo AmpC.
Analizując pozostałe gatunki pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae, okazało się, że dodatkowo wykazano wytwarzanie ESβL przez 7 gatunków, tj. u 2 spośród 4 P. agglomerans, 2/4 M. morganii, 2/5 E. aerogenes, 2/5 S. marcescens oraz 1/2 – K. oxytoca, C. freundii, H. alvei. U pozostałych badanych szczepów, tj. 9 gatunków Enterobacteriaceae, nie stwierdzono wytwarzania ESβL.
Zdecydowanie rzadziej wykrywano enzym typu AmpC, bo oprócz E. cloacae i E. coli (ryc. 1) stwierdzono jego obecność u 3/4 M. morganii i 1/2 S. marcescens.
Spośród badanych 20 gatunków rodziny Enterobacteriaceae (patrz „Materiał i metody”), oprócz 4 przedstawionych na rycinie 1 – dalszych 9 wykazywało wielolekooporność, co dość wyraźnie świadczyło, że na taki stan nie wpływało jedynie wytwarzanie hydrolitycznych β-laktamaz. Do tych gatunków zaliczały się: E. aerogenes (2/5), S. marcescens (2/5), P. agglomerans (2/4), M. morganii (1/4), K. oxytoca (1/2), C. freundii (1/2), H. alvei (1/2), P. rettgeri (1/1), E. tarda (1/1).
Interesujące wyniki dała analiza występowania szczepów wytwarzających oba enzymy i wielolekoopornych w poszczególnych klinikach/oddziałach Instytutu Reumatologii (ryc. 2). Okazało się, że drobnoustroje ESβL(+) najliczniej procentowo występowały na Oddziale A KChTŁ (12,5%), a zdecydowanie najrzadziej w KRO (1,2%). Z kolei szczepy AmpC(+) przede wszystkim, i to nielicznie, izolowane były w KR (3,5%) oraz w KRO (1,8%). Drobnoustroje wielolekooporne w dosyć wysokim odsetku występowały w badanym okresie w KR (23,5%) i na Oddziale A KChTŁ (20%), najrzadziej zaś w KRWR (7,7%) (ryc. 2). Zakładając, że wytwarzanie enzymów ESβL i AmpC doprowadza do całkowitej oporności na większość antybiotyków β-laktamowych i predysponuje do krzy-żowej oporności na inne grupy chemiczne chemioterapeutyków, dokonano analizy oceny procentowej ewentualnego udziału tych enzymów w powstawaniu wielolekooporności badanych szczepów bakteryjnych.
W tabeli I przedstawiono wyniki tej analizy, zwracając uwagę na znaczne różnice dotyczące procentowego udziału obu tych enzymów w indukcji wielolekooporności wśród ogółu badanych pałeczek Entero­- bacteriaceae (44,3%), poszczególnych wybranych ich gatunków (zaledwie 13,6% w przypadku E. coli, a 100% – P. mirabilis, K. pneumoniae i E. cloacae).
Różnice te zaznaczyły się również w procentowym udziale badanych enzymów w indukcji wielolekooporności wśród ogółu izolowanych pałeczek Enterobacteriaceae w poszczególnych klinikach, np. zaledwie 19% w KRO i ok. 60% w pozostałych analizowanych klinikach/oddziałach. Ta różnorodność sugerować może pewne prognostyczne znaczenie dokonanej analizy.

Dyskusja
Praca miała na celu zwrócić uwagę klinicystów na rozmiar występowania szczepów bakteryjnych z rodziny Enterobacteriaceae, izolowanych z różnych zakażeń, produkujących β-laktamazy, odpowiadające za powstawanie oporności na liczne antybiotyki β-laktamowe i na drodze krzyżowych oporności – za indukcję niezwykle groźnej dla pacjenta i środowiska wielolekooporności. Wydawało się, że wzięta pod uwagę placówka medyczna – Instytut Reumatologii, w której są przeważnie hospitalizowani pacjenci o stosunkowo nielicznych czynnikach ryzyka zakażeń bakteryjnych (poza KChTŁ i typowo zabiegowej KRO), będzie odbiegać od innych placówek „bogatych” w pacjentów zdecydowanie częściej narażonych na zakażenia o etiologii drobnoustrojów wielolekoopornych i produkujących groźne β-laktamazy.
Wykrycie takich szczepów powinno skłaniać do zwrócenia szczególnej uwagi na odpowiednie postępowanie epidemiologiczne i zwiększony reżim sanitarny, biorąc pod uwagę także fakt, że szczepy te sprawiają czasami ogromne kłopoty zarówno w terapii zakażeń, jak i eradykacji ze środowiska szpitalnego.
Ze względu na praktyczny cel pracy, która skupia uwagę na jednym z podstawowych mechanizmów powstawania i szerzenia się oporności na antybiotyki β-laktamowe wśród istotnej w wywoływaniu zakażeń grupy drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae – autorzy odsyłają czytelników zainteresowanych szczegółowymi informacjami np. dotyczącymi podziału β-laktamaz, ich powinowactwa z innymi mechanizmami doprowadzającymi do oporności itp. – do lektury obszernego piśmiennictwa [4, 6, 15]. Niewątpliwie z podstawowych informacji należy podkreślić, że wykrywane w przedstawionej pracy oba typy β-laktamaz ogólnie niewiele się różnią.
Chronologicznie [5] uważało się, że najczęstszą przyczyną oporności pałeczek Enterobacteriaceae na cefalosporyny, zwłaszcza III generacji, jest nadprodukcja kodowanych chromosomalnie β-laktamaz AmpC (klasy C lub grupy 1 wg różnych klasyfikacji). Opisano początkowo ich produkcję przez E. cloacae, C. freundii, S. marcescens, a następnie P. aeruginosa. Z kolei od 1980 r. stwierdzano oporność na cefalosporyny III generacji głównie u K. pneumoniae, E. coli i P. mirabilis. Oporność ta była przenoszona na plazmidach kodujących ESβL [4, 13, 18]. Enzymy ESβL wywodzą się od tzw. klasycznych β-laktamaz typu TEM i SHV i powstają w wyniku punktowej mutacji podstawowych aminokwasów ww. enzymów (TEM, SHV). W odróżnieniu od AmpC – β-laktamazy ESβL hamowane są przez inhibitory β-laktamaz, np. kwas klawulanowy, sulbaktam i tazobaktam – i ta cecha wykorzystywana jest w trakcie ich wykrywania [5, 7].
Stwierdzono, że plazmidy kodujące ESβL mogą również nosić geny oporności na aminoglikozydy i trimetoprim/sulfametoksazol, a ich chromosomalna oporność dotyczyła fluorochinolonów. Przenoszenie plazmidowe i oporność chromosomalna mogą zatem doprowadzać do horyzontalnego rozprzestrzeniania się szczepów wielolekoopornych na inne gatunki i odrębne grupy drobnoustrojów [5, 7], a także między pacjentami.
Należy podkreślić, że w wielu badaniach in vitro (oznaczanie wrażliwości antybiogramowej) stwierdzać można wrażliwość na β-laktamy, ale w przypadku wykrycia produkcji ESβL przez dany drobnoustrój należy go z definicji traktować jako oporny na wszystkie penicyliny (bez połączeń z inhibitorami), cefalosporyny (z wyjątkiem cefamycyn i połączeń z inhibitorami) i monobaktamy (aztreonam). Enzymy te nie rozkładają karbapenemów, co jest zjawiskiem korzystnym z uwagi na ich traktowanie jako leków ostatniej szansy. Wymagane jest zatem rutynowe oznaczanie wytwarzania ESβL u wszystkich pałeczek Enterobacteriaceae, których wykrycie diametralnie zmienia interpretację kliniczną określonego antybiogramu, do jakiej zobowiązany jest mikrobiolog wydający wynik. W takim przypadku skuteczność terapii β-laktamami jest ograniczona dodatkowo z uwagi na występującą krzyżową oporność na fluorochinolony, aminoglikozydy i trimetoprim/sulfametoksazol. Pozostaje niewiele opcji terapeutycznych, stąd niejednokrotnie występuje sytuacja zagrożenia życia pacjenta. Dlatego tak bardzo istotne dla właściwej terapii jest dokładne wykrywanie ESβL in vitro [16, 17].
Szczepy produkujące ESβL i AmpC są selekcjonowane od wielu lat w wyniku nadmiernego stosowania cefalosporyn o szerokim spektrum, np. ceftazydymu. Znajdywane są głównie wśród patogenów szpitalnych, zwłaszcza w środowisku oddziałów intensywnej terapii, onkologicznych, oparzeniowych, noworodkowych itp., a więc u pacjentów o obniżonej odporności i specjalnych czynnikach ryzyka. W Instytucie Reumatologii tacy pacjenci są hospitalizowani głównie w KChTŁ i KRO. Ale u pacjentów KRO dokonuje się, jak również dokonywało się w okresie niniejszych badań (2006–2008), posiewów przede wszystkim moczu (przed zabiegami) i częsta izolacja pałeczek E. coli ze stanów bezobjawowych zakażeń dróg moczowych wpływała na obniżenie ogólnego odsetka ESβL i AmpC (ryc. 2). Szczepy takie należały bowiem do kolonizujących pacjenta, a nie szpitalnych, które zwykle są bardziej oporne na antybiotyki. Inaczej przedstawiała się sprawa dotycząca innych klinik (np. KChTŁ i KR), których pacjenci częściej byli narażeni na zakażenia ciężkie, a zwłaszcza z powikłaniami w obrębie różnych układów i infekcjami tkanek miękkich (głównie w przypadku tocznia rumieniowatego układowego i reumatoidalnego zapalenia stawów). W tych przypadkach izolowano częściej inne niż E. coli gatunki Enterobacteriaceae, znacznie oporniejsze na antybiotyki.
W piśmiennictwie krajowym [2, 12, 13] i światowym [9, 10] podkreśla się możliwość izolacji szczepów ESβL i AmpC, zwłaszcza wśród E. coli i K. pneumoniae, ale w obecnych badaniach (patrz „Wyniki”) asortyment gatunków z rodziny Enterobacteriaceae, produkujących te enzymy, był znacznie szerszy i kazał zwracać uwagę Zespołu ds. Kontroli Zakażeń Szpitalnych na ewentualne potencjalne zagrożenie pojawienia się szczepów epidemicznych, a wręcz endemicznych.


Wnioski
1. Wykazano dużą różnorodność (11 spośród 20 izolowanych gatunków Enterobacteriaceae) szczepów produkujących β-laktamazy ESβL i AmpC, ale ogólnie ich niski odsetek (oprócz Enterobacter sp.), co jest zjawiskiem korzystnym z punktu widzenia terapii pacjentów i eradykacji ze środowiska klinik. Ich dość częsta wielolekooporność (ok. 16%) dotyczyła głównie innych grup antybiotyków niż β-laktamy. Na taki stan wpływały niskie odsetki izolatów E. coli ESβL(+) i AmpC(+) – gatunku zdecydowanie najczęściej hodowanego (w ok. 80% zakażeń objawowych i bezobjawowych). Niemniej w przypadku stosunkowo często izolowanych Proteus sp., Enterobacter sp. i Klebsiella sp. można było domniemywać nawet 100-procentową indukcję wielolekooporności przez produkowane β-laktamazy kodowane plazmidowo i chromosomalnie.
2. Szczegółowa analiza występujących szczepów pałeczek Enterobacteriaceae ESβL(+) i AmpC(+) i wielolekoopornych na terenie poszczególnych klinik/oddziałów Instytutu Reumatologii wykazała różnice wynikające z populacji hospitalizowanych pacjentów, ich predyspozycji do zakażeń o etiologii bardziej lub mniej lekoopornych drobnoustrojów. Stanowiło to czynnik prognostyczny i miało istotne znaczenie epidemiologiczne z uwagi na zagrożenie pacjentów i środowiska szpitalnego.
3. Śledzenie występowania szczepów pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae produkujących β-laktamazy wymaga niezwykłej precyzji i doświadczenia, ale ma ogromne znaczenie w ukierunkowywaniu terapii zakażeń wywoływanych przez te drobnoustroje. Wykrycie tych enzymów zmienia bowiem diametralnie kliniczną interpretację oporności na antybiotyki β-laktamowe, niezależnie od wyników uzyskanych w badaniach.

Piśmiennictwo  
1. Babini GS, Livermore DM. Antimicrobal resistance amongst Klebsiella spp. collected from intensive care units In Southern and Western Europe In 1997-1998. J Antimicrob 2000; 45: 183-189.  
2. Hryniewicz W. Lekooporność – czy mamy szansę wygrać z drobnoustrojem? Nowa Klinika 2004; 7: 704-707.  
3. Sulikowska A. Konsumpcja antybiotyków a narastanie oporności bakteryjnej. Nowa Medycyna. Medycyna Zakażeń 1999; 9: 32-34.  
4. Dzierżanowska D. Antybiotykoterapia praktyczna. α-medica Press, Bielsko-Biała 2005; 18-28.  
5. Geiss HK, Mack D, Seifen H. Konsensus dotyczący identyfikacji specjalnych mechanizmów oporności i interpretacji wyników badania antybiotykowrażliwości bakterii Gram(+) i Gram(–) (cz. II). Zakażenia 2005; 4: 93-99.  
6. Gramarellou H. Multidrug resistance in Gram-negative bacteria that produce extended-spectrum-lactamases (ESBLs). Clin Microbiol Infect 2005; 11: (suppl. 4), 1-16.  
7. Hryniewicz W, Sulikowska A, Szczypa K. Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki. Post Mikrobiol 2005; 44: 175-192.  
8. Stürenburg E, Mack D. Extended-spectrum beta-lactamases: Implication for the clinical microbiology laboratory, therapy and infection control. J Infect 2003; 47: 273-95.  
9. Bradford PA. Extended-spectrum beta-lactamases in the 21st centaury: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance thrent. Clin Microbiol Rev 2001; 14: 933-951.
10. Kim YK. Bloodstream infections by extended-spectrum beta-lactamases-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in children: epidemiology and clinical outcome. Antimicrob Agents Chemiother 2002; 46: 1481-1491.
11. Paterson DL. Outcome of cephalosporin treatment for serious infections due to apparently susceptible organisms producing extended-spectrum-beta-lactamases: implications for the clinical microbiology laboratory. J Clin Microbiol 2001; 39: 2206-2212.
12. Pszenna M, Rokosz A, Łuczak M. Występowanie Gram(–) pałeczek wytwarzających β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) w zakażeniach pacjentów szpitala SP ZOZ w Nidzicy. Zakażenia 2006; 2: 43-46.
13. Gniatkowski M. β-laktamazy u pałeczek Gram(–). Nowa Med (Bakteriol) 1997; 4: 20-26.
14. Laudy AE. Karbapenemazy – enzymy mogące hydrolizować szerokie spektrum β-laktamów. Zakażenia 2003; 4: 32-38.
15. Helfand MS, Bonomo RA. Current challenges in antimicrobal chemotherapy: the impact of extended-spectrum-β-lactamases and metallo-β-lactamases on the treatment of resistant Gram-negative pathogens. Curr Opin Pharmacol 2005; 5: 1-7.
16. Rokosz A, Sawicka-Grzelak A, Meszaros J, Łuczak M. Porównanie wyników krążkowo-dyfuzyjnych metod stosowanych do wykrywania ESBL-dodatnich szczepów pałeczek Gram(–). Med Dośw Mikrobiol 2004; 56: 49-55.
17. Gniatkowski M. Wykrywanie β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) w laboratoriach mikrobiologicznych: ocena testu Vitek ESBL. Diagn Lab 2001; 37: 197-206.
18. Jarlier V. Extended broad-spectrum-β-lactamases conferring transferable resistance to newer β-lactam agents in Enterobacteriaceae: hospital prevalence and susceptibility patterns. Rev Infect Dis 1988; 10: 867-878.