eISSN: 1897-4309
ISSN: 1428-2526
Contemporary Oncology/Współczesna Onkologia
Current issue Archive Manuscripts accepted About the journal Supplements Addendum Special Issues Editorial board Reviewers Abstracting and indexing Subscription Contact Instructions for authors Publication charge Ethical standards and procedures
Editorial System
Submit your Manuscript
SCImago Journal & Country Rank
5/2002
vol. 6
 
Share:
Share:

Biomarkers of oxidative DNA damage repair in urine

Krzysztof Roszkowski

Współcz Onkol (2002), vol. 6, 5, 272-276
Online publish date: 2003/03/26
Article file
- Biomarkery.pdf  [0.19 MB]
Get citation
 
 
WPROWADZENIE


Procesy, w wyniku których dochodzi do uszkodzeń DNA, sposoby jego naprawy i konsekwencje wynikające z zaburzeń w naprawie dotyczą całego świata ożywionego. Chociaż istnieją różnice w budowie i organizacji DNA, w budowie i specyficzności działania systemów naprawczych, ich schemat działania w bakteryjnych organizmach jednokomórkowych, komórkach diploidalnych roślin czy w tkankach ludzkich, jest podobny [1]. Walka o zachowanie i utrzymanie integralności genomu trwa nieustannie.
Mutacje nie tylko powodują destrukcję genomu, często były też motorem ewolucji, ułatwiając organizmom przeżycie w zmieniających się warunkach.



Jest powszechnie akceptowane, że uszkodzenia DNA, takie jak oksydacyjnie zmodyfikowane zasady i nukleotydy są przy sprawnych systemach naprawy wycinane i bez dalszych zmian metabolicznych wydzielane do moczu [2, 3, 4, 5]. Wśród wielu możliwych produktów reperacji w moczu zostały zidentyfikowane: 8-oksy-2'-deoksyguanozyna (8-oksydG), 8-oksyguanina (8-oksyGua), glikol tyminy (Tg), glikol tymidyny (dTg), 5-hydroksymetylouracyl (5-OHMU), 5-hydroksyuracyl (5-OHU) i 8-oksyadenina (8-oksyAde) [6, 7, 8, 9, 10, 11].

W aktualnym piśmiennictwie panuje zgodność co do zastosowania oznaczeń 8-oksydG i 8-oksyGua w moczu jako dobrego markera formowania uszkodzeń oksydacyjnych DNA in vivo. Uważa się, że poziom 8-oksy-2'-deoksyguanozyny w moczu jest zdeterminowany naprawą DNA in vivo przez wycinanie nukleotydów (NER) [4, 12]. Drugą możliwością pojawiania się 8-oksydG jest usuwanie oksydacyjnie zmodyfikowanych nukleotydów z ich puli komórkowej. 8-oksy-dGTP jest rozkładane przez 8-oksy-dGTPazę do 8-oksy-dGMP, po czym następuje defosforylacja przy udziale kinazy guanylowej do 8-oksydG i w takiej postaci jest wydzielana do moczu [13]. Przypuszcza się także, że do usunięcia oksydacyjnie zmodyfikowanego nukleozydu guaniny zdolna jest niespecyficzna endonukleaza, która wycina go w postaci 3',5',8-oksy-dGDP, a dalej podobnie jak w przypadku nuleotydów następuje hydroliza do 8-oksydG [13, 14].



Stężenie 8-oksydG w moczu zostało zaproponowane jako nieinwazyjny biomarker uszkodzeń oksydacyjnych DNA [4]. Loft podaje, że wydalanie 8-oksydG przez człowieka zdrowego wynosi 200-600 pmol/kg/24 godz., co odpowiada 168-504 oksydacyjnym modyfikacjom guaniny na dzień dla każdej z 5 x 1013 komórki organizmu [4].

Nie można wykluczyć, że 8-oksydG pojawia się w moczu w wyniku degradacji DNA, pochodzącego z martwych komórek, powstałych w wyniku apoptozy czy nekrozy.

Techniką HPLC analizowano również zawartość 8-oksyguaniny (8-oksyGua) w moczu. Stwierdzono, że stężenie tej cząsteczki w moczu jest podobne do zawartości 8-oksydG [7]. Opisano kilka glikozylaz, które w sposób szczególny rozpoznają i usuwają 8-oksyGua z komórek człowieka [15, 16].

Metoda, która byłaby w stanie określić ilość 8-oksydG i 8-oksyGua w tej samej próbce moczu byłaby szczególnie przydatna do poznawania mechanizmów reperacji oksydacyjnych uszkodzeń DNA u człowieka.

Zbadano wpływ różnych czynników, jak wiek, wysiłek fizyczny, palenie tytoniu, płeć, choroby nowotworowe na wydalanie 8-oksydG.



WIEK


Porównawcza analiza zawartości 8-oksydG w moczu ludzi zdrowych z kilku badań wskazuje, że poziom zmodyfikowanego nukleozydu może spadać wraz z wiekiem [12]. Można to tłumaczyć spowolnionym metabolizmem u osób starszych, jak również niewydolnością mechanizmów naprawy [4].
W aktualnym piśmiennictwie brakuje badań, które stwierdzałyby zależność poziomu 8-oksyGua w moczu człowieka od wieku.



METABOLIZM I WYSIŁEK
FIZYCZNY



Zależność między tempem metabolizmu a wydalaniem 8-oksydG została wykazana przez kilku badaczy [3, 17, 18]. Z przeprowadzonych badań wynika, że osoby otyłe wydalają mniej 8-oksydG niż osoby szczupłe. Mężczyźni wydalają ok. 30 proc. więcej 8-oksydG niż kobiety [19].

Ze względu na przyspieszony metabolizm tlenu, wysiłek fizyczny powinien generować oksydacyjne uszkodzenia DNA. Jednak krótkoterminowy wysiłek nie powodował znaczącego wzrostu w moczu 8-oksydG, natomiast 10 godz. po intensywnym wysiłku w warunkach maratonu stwierdzano wzrost w moczu 8-oksydG do 130 proc. stanu wyjściowego w przeliczeniu do poziomu kreatyniny w moczu [20]. Ponadto po okresie 30-dniowych intensywnych ćwiczeń od 8 do 11 godz. dziennie u żołnierzy, poziom 8-oksydG powiększał się znacząco [21].




TYTOŃ


Wpływ palenia tytoniu na podwyższenie zawartości w moczu oksydacyjnie zmodyfikowanego nukleozydu guaniny jest ewidentnie wykazany w licznych doświadczeniach. Stwierdzono, że palacze wydalają dziennie ok. 30 do 50 proc. więcej 8-oksydG [19, 22, 23] i ok. 100 proc. więcej 8-oksyG niż niepalący [7]. Ponadto 4 tyg. po zaprzestaniu palenia, wydalanie 8-oksydG zmniejszało się o 20 proc. u 65 osób poddanych kontrolowanemu badaniu [24].



WPŁYW DIETY


Przeprowadzono badanie, w którym monitorowano poziom tej pochodnej w moczu szczurów podzielonych na 2 grupy. Jedna była karmiona normalnie, a u drugiej zastosowano dietę nie zawierającą kwasów nukleinowych. Okazało się, że poziom zmodyfikowanej zasady 8-oksyGua w moczu szczurów karmionych normalną dietą był o wiele wyższy w porównaniu z wartościami w drugiej grupie. Poziom zmodyfikowanego nukleotydu 8-oksydG w tym przypadku był porównywalny w obu grupach [25].



Inni autorzy po podaniu szczurom dojelitowo znakowanej 8-oksydG oraz dożylnie dG nie stwierdzili w moczu znakowanej 8-oksydG, co sugeruje, że na jej poziom nie wpływa 8-oksydG pochodząca z pokarmu ani oksydacja dG podczas jej wydzielania do moczu [10]. Analiza w moczu 8-oksyGua przedstawiała jak dotychczas szczególne trudności metodyczne [4, 26] i aż do niedawna metody prezentowane przez autorów nie były godne zaufania.
Ostatnio opracowano metodę pozwalającą na oznaczenie w tej samej próbce moczu produktów reperacji DNA 8-oksydG i 8-oksyGua przy wykorzystaniu jednocześnie techniki HPLC i GC/MS [27].

W Katedrze i Zakładzie Biochemii Klinicznej Akademii Medycznej w Bydgoszczy przystosowano do wymogów odczynnikowych i sprzętowych metodę opracowaną przez Ravanata i wsp. Wykorzystując tę technikę przeprowadzono badania mające na celu ocenę wpływu diety na poziomy 8-oksy-dG i 8-oksy-Gua w moczu człowieka. Dla oceny dokładności pomiarów 8-oksy-dG i 8-oksy-Gua w dobowej zbiórce moczu (DZM), analizy były powtarzane 7 razy w tych samych próbkach moczu dla każdego z badanych. Ponieważ poprzednie badania [28] sugerowały, że ilość 8-oksyG w moczu szczura osiąga najniższą wartość w drugim lub trzecim dniu diety wolnej od kwasów nukleinowych, próbki moczu (dobowa zbiórka moczu) w tym badaniu zbierane były po trzech dniach stosowania diety wolnej od kwasów nukleinowych i od tych samych osób w trzy do pięciu dni po powrocie do normalnej nieograniczonej diety. Średnie poziomy 8-oksy-dG i 8-oksy-Gua analizowanych zestawień obu próbek moczu były porównywalne. Postawiono wniosek, że dobowa ilość 8-oksy-dG i 8-oksy-Gua wydalana z moczem u człowieka nie zależy od diety i może być kompletnym obrazem ilości tych oksydacyjnych pochodnych zasad azotowych pochodzących z komórkowego DNA [29].



CHOROBY NOWOTWOROWE


Porównywano zawartość 8-oksydG w moczu pacjentów chorych na chorobę nowotworową z zawartością tego związku w moczu ludzi zdrowych. Wyniki tych badań pokazuje tab.

Produkty naprawy uszkodzeń materiału genetycznego wydzielane są z moczem [17, 27, 35]. Przydatnym w odpowiedzi na wiele pytań o udziale oksydacyjnych zmian w DNA człowieka, w procesie powstawania nowotworów i zaburzeniach mechanizmów naprawy uszkodzonego DNA, mogłaby być metoda umożliwiająca pomiar ilości utlenionych zasad w DNA w materiale pobieranym w sposób nieinwazyjny. Materiałem klinicznym, który pobiera się od pacjentów w sposób nieinwazyjny jest mocz.



Poziom 8-oksy-dG i 8-oksy-Gua w moczu człowieka powinien odzwierciedlać z jednej strony poziom uszkodzeń oksydacyjnych w DNA i puli nukleotydowej komórek, a z drugiej sprawność mechanizmów naprawy DNA. Jednak prawdziwe relacje oraz różnorodność międzyosobnicza nie są jeszcze przebadane, ponieważ do niedawna nie istniała metoda jednoczesnego oznaczania tych związków w moczu.



Otwierająca się możliwość szacowania sprawności mechanizmów naprawczych w oparciu o analizę moczu jest niesłychanie pociągająca ze względu na całkowitą bezinwazyjność i może umożliwić opracowanie testów służących do indywidualizacji terapii.



PIŚMIENNICTWO

1. Janion C. Mutageneza - uszkodzenia i naprawa DNA. Kosmos 1999; 48 (4): 289-92.
2. Shigenaga MK, Gimeno CJ, Ames BN. Urinary 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine as a biological marker of in vivo oxidative DNA damage. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 86: 9697-701.
3. Loft S, Poulsen HE. Markers of oxidative damage to DNA: antioxidants and molecular damage. Methods in Enzymology 1995; 300: 166-84.
4. Loft S, Poulsen HE. Estimation of oxidative DNA damage in man from urinary excretion of repair products. Acta Biochem Pol 1998; 45: 133-44.
5. Ravanat JL, Guichert P, Tuce Z, Cadet J. Simultaneous determination of five oxidative DNA lesions in human urine. Chem Res Toxicol 1999; 12: 802-8.
6. Loft S, Poulsen HE. Cancer risk and oxidative DNA damage in man [published erratum appears in J Mol Med 1997 Jan; 75 (1): 67-8]. J Mol Med 1996; 74: 297-312.
7. Suzuki J, Inoue Y, Suzuki S. Changes in urinary excretion level of 8-hydroxyguanine by exposure to reactive oxygen-generating substances. Free Radicals Biol Med 1995; 18: 431-6.
8. Teixeira AJ, Ferreira MR, van Dijk WJ, van de Werken G, de Jong AP. Analysis of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in rat urine and liver DNA by stable isotope dilution gas chromatography/mass spectrometry. Anal Biochem 1995; 226: 307-19.
9. Faure H, Incardona MF, Boujet C, Cadet J, Ducros V, Favier A. Gas chromatographic-mass spectrometric determination of 5-hydroxymethyluracil in human urine by stable isotope dilution. J Chromatogr 1993; 616: 1-7.
10. Shigenaga MK, Gimeno CJ, Ames BN. Urinary 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine as a biological marker of in vivo oxidative DNA damage. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 86: 9697-701.
11. Cathcart R, Schwiers E, Saul RL, Ames BN. Thymine glycol and thymidine glycol in human and rat urine. A possible assay for oxidative DNA damage. Proc Natl Acad Sci USA 1984; 81: 5633-7.
12. Lunec J, Herbert K, Blount S, Griffiths HR, Emery P. 8-Hydroxydeoxyguanosine. A marker of oxidative DNA damage in systemic lupus erythematosus. FEBS. Lett. 1994; 348: 131-8.
13. Cooke MS, Evans MD, Herbert KE, Lunec J. Urinary 8-Oxo-2'-Deoxyguanosine - Source, Significance and Supplements. Free Rad Res 2000; 32: 381-97.
14. Tudek B. Mechanizmy naprawy utlenionych zasad DNA. Kosmos 1999; 245: 339-52.
15. Radicella JP, Dherin C, Desmaze CH, Fox MS, Boiteux S. Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Sacharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 8010-15.
16. Hazra TK, Izumi T, Maidt L, Floyd RA, Mitar S. The presence of two distinct 8-oxoguanine repair enzymes in human cells: their potential complementary roles in preventing mutations. Nucleic Acid Res 1998; 26: 5116-22.
17. Loft S, Fischer-Nielsen A, Jeding IB, Vistisen K, Poulsen HE. 8-Hydroxy-deoxyguanosine as a biomarker of oxidative DNA damage. J Toxicol Environ Health 1993; 40: 391-404.
18. Adelman R, Saul RL, Ames BN. Oxidative damage to DNA: Relation to species metabolic rate and life span. Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85: 2706-8.
19. Loft S, Vistisen K, Ewertz M, Tjonneland A, Overvad K, Poulsen HE. Oxidative DNA-damage estimated by 8-hydroxydeoxyguanosine excretion in humans: influence of smoking, gender and body mass index. Carcinogenesis 1992; 13: 2241-7.
20. Alessio HM. Exercise-induced oxidative stress. Med Sci Sports Exerc 1993; 25: 218-24.
21. Poulsen HE, Loft S, Vistisen K. Increased oxidative DNA damage after 30 days of vigorous exercise. J Sport Sci 1995; 14: 343-46.
22. Loft S, Astrup A, Buemann B, Poulsen HE. Oxidative DNA damage correlates with oxygen consumption in humans. FASEB J 1994; 8: 534-37.
23. Tagesson C, Kallberg M, Leanderson P. Determination of urinary 8-hydroxy-deoxyguanosine by coupled-column high-perfomance liquid chromatography with electrochemical detection: A noninvasive assay for in vivo oxidative DNA damage in humans. Toxicol Methods 1992; 1: 242-51.
24. Prieme H, Loft S, Klarlund M, Gronbaek K, Tonnesen P. Poulsen HE. Effect of smoking cessation on oxidative DNA damage estimated by 8-oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxy-guanosine. Carcinogenesis 1998; 19: 347-51.
25. Park E, Shigenaga MK, Degan P, Korn TS, Kitzler JW, Wehr CM, Kolachana P, Ames BN. Assay of excised oxidative DNA lesions: Isolation of 8-oxoguanine and its nukleoside derivatives from biological fluids with a monoclonal antibody column. Proc Natl Acad Sci (USA) 1992; 89: 3375-9.
26. Helbock HJ, Beckman KB, Shigenaga MK, Walter PB, Woodall AA, Yeo HC, Ames BN. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical detection assay of 8-oxo-deoxyguanosine and 8-oxoguanine. Proceedings of the National Academy of Science USA 1998; 95: 288-93.
27. Ravanat JL, Guichert P, Tuce Z, Cadet J. Simultaneous determination of five oxidative DNA lesions in human urine. Chem Res Toxicol 1999; 12: 802-8.
28. Park E, Shigenaga MK, Degan P, Korn TS, Kitzler JW, Wehr CM, Kolachana P, Ames BN. Assay of excised oxidative DNA lesions: Isolation of 8-oxoguanine and its nukleoside derivatives from biological fluids with a monoclonal antibody column. Proc Natl Acad Sci (USA) 1992; 89: 3375-9.
29. Gackowski D, Różalski R, Roszkowski K, Jawień A, Foksiński M, Oliński R. 8-Oxoguanine and 8-oxo-2'-deoxyguanosine levels in human urine do not depend on diet. Free Radicals Res 2001; 35: 825-32.
30. Cao EH, Wang JJ. Oxidative damage to DNA: Levels of thymine glycol and thymidine glycol in neoplastic human urines. Carcinogenesis 1993; 14: 1359-62.
31. Bergtold DS, Berg CD, Simic MG. Urinary biomarkers in radiation therapy of cancer. Adv Exp Med Biol 1990; 264: 311-16.
32. Faure H, Coudray C, Mousseau M, Ducros V, Douki T, Bianchini F, Cadet J, Favier A. 5-Hydroxymethyluracil excretion, plasma TBARS and plasma antioxidant vitamins in adriamycin-treated patients. Free Radicals Biol Med 1996; 20: 979-83.
33. Tagesson C, Kallberg M, Leanderson P. Determination of urinary 8-hydroxy-deoxyguanosine by coupled-column high-perfomance liquid chromatography with electrochemical detection: A noninvasive assay for in vivo oxidative DNA damage in humans. Toxicol Methods 1992; 1: 242-51.
34. Tagesson C, Kallberg M, Klintenberg C, Starkhammar H. Determination of urinary 8-hydroxydeoxyguanosine by automated coupled-column high performance liquid chromatography: A powerful technique for assaying in vivo oxidative DNA damage in cancer patients. Eur J Cancer 1995; 31A: 934-40.
35. Cooke MS, Evans MD, Herbert KE, Lunec J. Urinary 8-Oxo-2'-Deoxyguanosine - Source, Significance and Supplements. Free Rad Res 2000; 32: 381-97.



ADRES DO KORESPONDENCJI

dr med. Krzysztof Roszkowski

Katedra Biochemii Klinicznej

Akademia Medyczna

ul. Karłowicza 24

85-092 Bydgoszcz

tel. (052) 585 37 45

fax (052) 585 37 71

Roszkowskik@rco.pl





















Copyright: © 2003 Termedia Sp. z o. o. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International (CC BY-NC-SA 4.0) License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/), allowing third parties to copy and redistribute the material in any medium or format and to remix, transform, and build upon the material, provided the original work is properly cited and states its license.
Quick links
© 2024 Termedia Sp. z o.o.
Developed by Bentus.