The role of single nucleotide polymorphism Arg399Gln XRCC1 gene in endometrial cancer in Polish postmenopausal women

Wstęp

Rak endometrium to najczęstszy nowotwór złośliwy trzonu macicy. Rocznie na świecie stwierdza się ok. 150 000 nowych przypadków zachorowania, najczęściej w grupie wiekowej 65–75 lat [1]. Rak endometrium jest na czwartym miejscu wśród najczęstszych nowotworów złośliwych u kobiet w Polsce [2].

Komórki endometrium mogą podlegać stresowi oksydacyjnemu, np. podczas cyklu menstruacyjnego [3]. Tworzą się wtedy reaktywne formy tlenu, które uszkadzają różnorodne cząsteczki białek, a także DNA. Dochodzi do rozwoju mutacji w protoonkogenach i genach supresorowych oraz innych genach istotnych dla indukcji, promocji i progresji nowotworów, które kumulowane z czasem prowadzą do rozwoju raka [4].

Uszkodzenia oksydacyjne są usuwane w wyniku obecności mechanizmu naprawy przez wycinanie zasad azotowych (base excision repair – BER). Naprawa przez wycinanie zasad azotowych służy głównie usuwaniu nieskomplikowanych, lecz niebezpiecznych w skutkach uszkodzeń DNA, jakimi są utlenione i N alkilowane zasady azotowe (np. glikol tyminy, 8 oksoguanina, 7 metyloguanina, 3 metyloadenina), uracyl i miejsca AP [5]. Kluczowymi białkami systemu BER są dwa kodowane przez geny XRCC1 (X-ray repair cross-complementing 1) i hOGG1 (human oxoguanine glycosylase 1).

Gen XRCC1 położony jest na chromosomie 19 (19q13.2), zajmuje ok. 31,9 kpz i zawiera 17 eksonów. Ulega on ekspresji na wysokim poziomie w różnych tkankach. Gen XRCC1 jest genem polimorficznym. Dotychczas stwierdzono istnienie 37 miejsc polimorficznych w obrębie genu XRCC1, 14 z nich powoduje zmianę kodowanego aminokwasu, a 4 występują w populacji z częstością 3-procentową lub większą. Dwa bardzo istotne polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNPs) zlokalizowane są w kodonie 194 (podstawienie C  T w pozycji 26 304, ekson 6, Arg do Trp) i 399 (podstawienie G A w pozycji 28 152, ekson 10, Arg do Gln). Dane z piśmiennictwa sugerują, że polimorfizmy te mogą być związane z rozwojem różnych nowotworów, takich jak: rak piersi, prostaty, krtani, oraz mogą zmniejszać ryzyko rozwoju raka pęcherza moczowego [6–14].

Niewiele jednak wiadomo o znaczeniu polimorfizmów SNP genu XRCC1 w raku endometrium. Dostępne dane są bardzo nieliczne i nie wyjaśniają tego problemu [15–17]. W piśmiennictwie polskim nie ma w ogóle doniesień na ten temat.

Dlatego też w prezentowanej pracy podjęto próbę analizy polimorfizmu Arg399Gln genu XRCC1 u kobiet w wieku pomenopauzalnym z rakiem endometrium w Polsce.

Materiały i metody

Pacjentki

Badania objęły 450 pacjentek, u których stwierdzono raka endometrium. Średnia wieku pacjentek wynosiła

64 lata (58–83 lat). Charakterystykę pacjentek prezentuje tabela I. Materiał do badań stanowiły fragmenty guzów w postaci bloczków parafinowych przechowywanych w archiwum Zakładu Patomorfologii Klinicznej Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi z lat 2002–2009. Jako kontrolę zastosowano DNA z prawidłowego endometrium (n = 360).

Izolacja DNA

Kwas deoksyrybonukleinowy był izolowany z zastosowaniem komercyjnie dostępnego zestawu QIAmp Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) zgodnie z zaleceniami producenta.

Analiza polimorfizmu Arg399Gln genu XRCC1

Polimorfizm został określony poprzez reakcję łańcuchową polimerazy metodą analizy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism – PCR-RFLP). Zastosowano startery o sekwencjach: 5’-TTGTGCTTTCTCT­GTGT­CCA-3’ i 5’-TCCTCCAGCCTTTTCTGATA-3’. Reakcja łancuchowa polimerazy (polymerase chain reaction – PCR) została przeprowadzona w termocyklerze GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems). Mieszanina reakcyjna (25 µl) obejmowała 100 ng DNA, 12,5 pmol starterów, 0,2 mmol/l dNTP, 2 mmol/l MgCl2 i 1 U polimerazy Taq DNA. Warunki reakcji PCR: 94°C przez 30 s, 62°C przez 30 s i 72°C przez 30 s, w 35 cyklach. Produkt PCR był trawiony 10 U enzymu restrykcyjnego MspI w 37ºC. Allel dziki Arg odpowiadał długości 293 pz, allel zmutowany Trp długości pasma 313 pz.

Analiza statystyczna

Analiza statystyczna rozkładu genotypów oraz alleli w grupie badanej i kontrolnej przeprowadzona została po wcześniejszym potwierdzeniu, że otrzymane układy pozostają w stanie równowagi wg reguły Hardy’ego-

-Weinberga. Analizowano rozkłady genotypów i alleli oraz oceniono ich zgodność z rozkładem Hardy’ego-Weinberga przy użyciu testu 2. Różnice pomiędzy rozkładami w poszczególnych grupach oceniano, także stosując test 2. Wynik uznawano za istotny statystycznie przy poziomie istotności p < 0,05.

Ocenę genotypów i alleli pod względem ich związku z daną cechą, np. ryzykiem wystąpienia raka, przeprowadzano przez zastosowanie analizy ilorazu szans (odds ratio – OR) oraz 95-procentowego przedziału ufności (95% confidence interval – 95% CI), które obliczano wg modelu regresji logistycznej. Korzystano z pakietu Statistica v. 7.0 (StatSoft, Tulsa, OK, USA).

Wyniki

Tabela II przedstawia rozkład genotypów i częstości alleli polimorfizmu XRCC1 (Arg399Gln) w grupie badanej i kontrolnej. Stwierdzono obecność statystycznie istotnych różnic pomiędzy badanymi grupami (p < 0,05).

U kobiet z rakiem endometrium częstości genotypów Arg/Arg, Arg/Gln i Gln/Gln wynosiły odpowiednio 15, 20 i 65%, podczas gdy w grupie kontrolnej 26, 46, i 28%. W grupie chorych częstości genotypów różniły się znacząco od rozkładu przewidywanego przez prawo Hardy’ego-

-Weinberga (p < 0,05). Częstość homozygoty Gln/Gln

by­ła statystycznie znacząco wyższa w porównaniu z in-

nymi genotypami (OR = 2,22; 95% CI 1,51–3,27; p < 0001).

Polimorfizm został także określony w grupach o różnym stopniu zaawansowania nowotworu (tab. III). Stopień zaawansowania histologicznego został określony we wszystkich przypadkach (n = 450). Dwieście czterdzieści cztery przypadki były stopnia I, 180 stopnia II i 26 stopnia III. W celu dokładniejszej analizy statystycznej dwa ostatnie stopnie zsumowano.

Homozygota Gln/Gln około dwukrotnie zwiększała ryzyko rozwoju raka endometrium stopnia I (OR = 2,13; 95% CI = 2,02–2,75; p < 0,012).

Nie zaobserwowano statystycznie istotnych różnic pomiędzy polimorfizmem Arg399Gln genu XRCC1 a czynnikami ryzyka raka endometrium, jak wskaźnik masy ciała (body mass index – BMI), hormonalna terapia zastępcza (HTZ), krwawienia, cukrzyca czy nadciśnienie (tab. IV).

Dyskusja

W prezentowanej pracy podjęto próbę analizy związku pomiędzy polimorfizmem Arg399Gln genu XRCC1 a rozwojem raka endometrium u polskich kobiet.

Wiadomo, że polimorfizmy pojedynczych nukleotydów genu XRCC1 mogą wpływać na zdolności naprawcze kodowanego przez ten gen białka. Istotny jest zwłaszcza polimorfizm zlokalizowany w kodonie 399. Polimorfizm w pozycji 399 (ekson 10) związany jest z podstawieniem Arg  Gln w domenie BRCT I, wiążącej polimerazę poli(ADP-rybozy). Polimorfizm ten może mieć wpływ na ryzyko rozwoju choroby nowotworowej, powodując zarówno jego wzrost, jak i spadek, w zależności od typu i lokalizacji raka [18].

W piśmiennictwie światowym istnieją doniesienia, że polimorfizm XRCC1-Arg399Gln może być czynnikiem ryzyka rozwoju różnych nowotworów. XRCC1-Arg399Gln był związany ze wzrostem ryzyka raka płuc [19, 20], nowotworów głowy i szyi [21] oraz raka żołądka [22].

Takiej relacji nie zaobserwowano w przypadku raka pęcherza moczowego [23], przełyku [24] i czerniaka [25].

Prace obejmujące populację polskich kobiet chorych na raka piersi wykazały, że XRCC1-Arg399Gln nie jest niezależnym markerem w tym nowotworze [26]. Wyniki te pozostają w zgodzie z doniesieniami innych autorów badających ten aspekt [27–29].

Istnieje niewiele danych w piśmiennictwie o znaczeniu polimorfizmu XRCC1 Arg399Gln w raku endometrium. W Polsce zespół Krupy i wsp. nie wykazał związku pomiędzy polimorfizmem genu hOGG1, który podobnie jak XRCC1 bierze udział w naprawie DNA poprzez wycinanie zasad, a występowaniem raka endometrium [30]. Korelacja taka dotyczyła natomiast polimorfizmu 135G/C genu RAD51 (gen naprawy poprzez rekombinację homologiczną). Homozygota C/C zwiększała ryzyko rozwoju raka endometrium.

Zespół De Ruyck K i wsp. w raku endometrium badał następujące polimorfizmy genów naprawy DNA: XRCC1- -194Arg/Trp, 280Arg/His, 399Arg/Gln, 632Gln/Gln,

XRCC3-5’ UTR 4,541A>G, IVS5-14 17,893A>G, 241Thr/Met

oraz polimorfizm 326Ser/Cys genu hOGG1. Badania wykazały, że polimorfizmy SNP genu XRCC1 w kombinacji z innymi polimorfizmami genów naprawy (XRCC3 i hOGG1) mogą podwyższać czułość pacjentów z rakiem endometrium na radioterapię (RT) [15, 16].

Nasze badania wstępne na grupie 220 pacjentek sugerują, że polimorfizm XRCC1 Arg399Gln może być znacząco związany z rakiem endometrium [31]. Zauważono, że allel 399Gln występował ze statystycznie istotnie większą częstością u kobiet z rakiem endometrium w porównaniu z grupą kontrolną.

W prezentowanej pracy wykryto związek pomiędzy wystąpieniem raka endometrium a obecnością genotypu Gln/Gln. Około dwukrotnie zwiększał on prawdopodobieństwo wystąpienia raka endometrium stopnia I

(OR = 2,42, 95% CI = 2,12–2,72). Genotyp Gln/Gln może zatem być czynnikiem ryzyka raka endometrium stopnia I u kobiet w wieku pomenopauzalnym.

Wyniki te potwierdzałyby wcześniejsze badania sugerujące, że istnieje związek pomiędzy obecnością allelu 399Gln a poziomem uszkodzeń DNA i mutacji [32].

Podsumowując, prezentowana praca stanowi kolejny etap ułatwiający zrozumienie roli polimorfizmów SNP genu XRCC1 dla rozwoju raka endometrium.

Piśmiennictwo

1. Sorosky JI. Endometrial cancer. Obstet Gynecol 2008; 111: 436-47.

2. Wojciechowska U, Didkowska J, Zatoński W. Corpus uteri cancer. In: Zatoński W (ed.). Cancer in Poland in 2006. Department of Epidemiology and Cancer Prevention, Warsaw 2008; 30-2.

3. Sugino N. The role of oxygen radical-mediated signaling pathways in endometrial function. Placenta 2007; 28 Suppl A: S133-6.

4. Federico A, Morgillo F, Tuccillo C, et al. Chronic inflammation and oxi­da­tive stress in human carcinogenesis. Int J Cancer 2007; 121: 2381-6.

5. Wood RD, Mitchell M, Sgouros J, Lindahl T. Human DNA repair genes. Science 2001; 291: 1284-9.

6. Burri RJ, Stock RG, Cesaretti JA, et al. Association of single nucleotide polymorphisms in SOD2, XRCC1 and XRCC3 with susceptibility for the development of adverse effects resulting from radiotherapy for prostate cancer. Radiat Res 2008; 170: 49-59.

7. McWilliams RR, Bamlet WR, Cunningham JM, et al. Polymorphisms in DNA repair genes, smoking, and pancreatic adenocarcinoma risk. Cancer Res 2008; 15: 4928-35.

8. Fontana L, Bosviel R, Delort L, et al. DNA repair gene ERCC2, XPC, XRCC1, XRCC3 polymorphisms and associations with bladder cancer risk in

a French cohort. Anticancer Res 2008; 28: 1853-6.

9. Wang Z, Xu B, Lin D, et al. XRCC1 polymorphisms and severe toxicity in lung cancer patients treated with cisplatin-based chemotherapy in Chinese population. Lung Cancer 2008; 62: 99-104.

10. Sreeja L, Syamala VS, Syamala V, et al. Prognostic importance of DNA repair gene polymorphisms of XRCC1 Arg399Gln and XPD Lys751Gln in lung cancer patients from India. J Cancer Res Clin Oncol 2008; 134: 645-52.

11. Dufloth RM, Arruda A, Heinrich JK, et al. The investigation of DNA repair polymorphisms with histopathological characteristics and hormone receptors in a group of Brazilian women with breast cancer. Genet Mol Res 2008; 7: 574-82.

12. Yen CY, Liu SY, Chen CH, et al. Combinational polymorphisms of four DNA repair genes XRCC1, XRCC2, XRCC3, and XRCC4 and their association with oral cancer in Taiwan. J Oral Pathol Med 2008; 37: 271-7.

13. Yang Y, Tian H, Zhang ZJ. Association of the XRCC1 and hOGG1 poly­mor­phisms with the risk of laryngeal carcinoma. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi 2008; 25: 211-3.

14. Shen M, Hung RJ, Brennan P, et al. Polymorphisms of the DNA repair genes XRCC1, XRCC3, XPD, interaction with environmental exposures, and bladder cancer risk in a case-control study in northern Italy. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2003; 12: 1234-40.

15. De Ruyck K, Wilding CS, Van Eijkeren M, et al. Microsatellite polymor­phisms in DNA repair genes XRCC1, XRCC3 and XRCC5 in patients with gynecological tumors: association with late clinical radiosensitivity and cancer incidence. Radiat Res 2005; 164: 237-44.

16. De Ruyck K, Van Eijkeren M, Claes K, et al. Radiation-induced damage to normal tissues after radiotherapy in patients treated for gynecologic tumors: association with single nucleotide polymorphisms in XRCC1, XRCC3, and OGG1 genes and in vitro chromosomal radiosensitivity in lymphocytes. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2005; 62: 1140-9.

17. Krupa R, Sobczuk A, Popławski T, et al. DNA damage and repair in endo­metrial cancer in correlation with the hOGG1 and RAD51 genes polymorphism. Mol Biol Rep 2011; 38: 1163-70.

18. Goode EL, Ulrich CM, Potter JD. Polymorphisms in DNA repair genes and associations with cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2002; 11: 1513-30.

19. Divine KK, Gilliland FD, Crowell RE, et al. The XRCC1 399 glutamine allele is a risk factor for adenocarcinoma of the lung. Mutat Res 2001; 461: 273-8.

20. Zhou W, Liu G, Miller DP, et al. Polymorphisms in the DNA repair genes XRCC1 and ERCC2, smoking, and lung cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2003; 12: 359-65.

21. Kowalski M, Przybylowska K, Rusin P, et al. Genetic polymorphisms in DNA base excision repair gene XRCC1 and the risk of squamous cell carcinoma of the head and neck. J Exp Clin Cancer Res 2009; 28: 37.

22. Shen H, Xu Y, Qian Y, et al. Polymorphisms of the DNA repair gene XRCC1 and risk of gastric cancer in a Chinese population. Int J Cancer 2000; 88: 601-6.

23. Stern MC, Umbach DM, van Gils CH, et al. DNA repair gene XRCC1 poly­morphisms, smoking, and bladder cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2001; 10: 125-31.

24. Lee SG, Kim B, Choi J, et al. Genetic polymorphisms of XRCC1 and risk of gastric cancer. Cancer Lett 2002; 187: 53-60.

25. Nelson HH, Kelsey KT, Mott LA, Karagas MR. The XRCC1 Arg399Gln poly­morphism, sunburn, and non-melanoma skin cancer: evidence of gene-environment interaction. Cancer Res 2002; 62: 152-5.

26. Sobczuk A, Romanowicz-Makowska H, Fiks T, et al. XRCC1 and XRCC3 DNA repair gene polymorphisms in breast cancer women from the Lodz region of Poland. Pol J Pathol 2009; 60: 76-80.

27. Smith TR, Miller MS, Lohman K, et al. Polymorphisms of XRCC1 and XRCC3 genes and susceptibility to breast cancer. Cancer Lett 2003; 190: 183-90.

28. Figueiredo JC, Knight JA, Briollais L, et al. Polymorphisms XRCC1-R399Q and XRCC3-T241M and the risk of breast cancer at the Ontario site of the Breast Cancer Family Registry. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2004; 13: 583-91.

29. Han J, Hankinson SE, Ranu H, et al. Polymorphisms in DNA double-strand break repair genes and breast cancer risk in the Nurses’ Health Study. Carcinogenesis 2004; 25: 189-95.

30. Krupa R, Sobczuk A, Popławski T, et al. DNA damage and repair in endo­metrial cancer in correlation with the hOGG1 and RAD51 genes poly­morphism. Mol Biol Rep 2011; 38: 1163-70.

31. Romanowicz-Makowska H, Smolarz B, Góralczyk B i wsp. Polimorfizm hOGG1 Ser326Cys i XRCC1 Arg399Gln genów naprawy DNA przez wycinanie zasad azotowych (BER) u kobiet w wieku pomenopauzalnym chorych na raka endometrium. Przegl Menopauz 2010; 6: 366-70.

32. Hu JJ, Smith TR, Miller MS, et al. Amino acid substitution variants of APE1 and XRCC1 genes associated with ionizing radiation sensitivity. Carci­nogenesis 2001; 22: 917-22.