Analysis of the p14 and p16 mutations in cutaneous melanoma

Wprowadzenie

Czerniak skóry jest nowotworem wywodzącym się z melanocytów występujących przede wszystkim w obrębie skóry [1, 2], powstałym w wyniku długotrwałej ekspozycji na czynniki mutagenne i nieprawidłowego systemu naprawy DNA [3–5]. Transformacja nowotworowa to wynik zmian powstałych w obrębie 4 różnych klas genów, m.in. w obrębie genów supresorowych [6, 7]. W piśmiennictwie opisano ponad 100 genów supresorowych. Brak kontroli nad przebiegiem cyklu komórkowego sprzyja transformacji nowotworowej i dlatego w większości nowotworów człowieka występują mutacje w co najmniej jednym z genów regulujących cykl, czyli RB, TP53, CDK4 i CDKN2A [6].

Kompletny gen inhibitora kinazy cyklinozależnej 2A (CDKN2A) zlokalizowany jest na krótkim ramieniu chromosomu 9 w prążku cytogenetycznym 21.3. Gen ten ma niezwykłą zdolność kodowania całkowicie różnych białek z dwóch transkryptów splicingu alternatywnego [8]. Transkrypt  obejmuje eksony 1, 2 i 3, kodując białko p16INK4A, podczas gdy mniejszy transkrypt β zawierający eksony 1b, 2 i 3 koduje białko p14ARF. Jest to wynik translacji sekwencji eksonu 2 jako alternatywnej ramki odczytu w stosunku do eksonu 2 białka p16INK4A [8].

Białko p14ARF odgrywa rolę supresora nowotworowego, regulując cykl komórkowy podczas przejścia fazy G1 i G2 poprzez inhibicję HDM2 (ang. human double minute) [9]. Białko p16 należy do rodziny białek INK4, które blokują aktywność zależnych od kinaz cyklin D (CDK) oraz odgrywają istotną rolę w kontroli cyklu komórkowego w fazie G1/S [10–12].

Od wielu lat wiele zespołów badawczych analizuje podłoże genetyczne czerniaków [13]. W liniach hodowlanych tego nowotworu w 90% stwierdzono nieprawidłowości w zmutowanym genie. Do najczęstszych mutacji zalicza się delecje fragmentu genu bądź locus (50% czerniaków), hipermetylację wysp CpG w odcinku promotorowym (20–75% czerniaków), mutacje punktowe (9% czerniaków) i niestabilność odcinków mikrosatelitarnych [13, 14]. Większość nieprawidłowości w genie CDKN2A stanowi substytucję pojedynczych par zasad. Mutacje w loci tego genu dotyczą obu białek przez nie kodowanych – p14 i p16 [15]. Innym typem mutacji CDKN2A są mutacje w rejonach niekodujących. Należą do nich: 5’UTR, miejsca splicingowe, sekwencje intronowe oraz 3’UTR. W genie CDKN2A występują również polimorfizmy, do których najczęściej zalicza się 148Ala/Thr oraz dwa w odcinku 3’UTR 500 C/G i 540 C/T [13].

Cel pracy

Celem pracy była analiza występowania mutacji białek p16 i p14 genu CDKN2A w czerniaku złośliwym.

Materiał i metodyka

Materiał do badań stanowiły zarchiwizowane, utrwalone w parafinie wycinki skóry z rozpoznaniem czerniaka potwierdzonym w badaniu histopatologicznym i immunomorfologicznym. Materiał otrzymano z Katedry i Zakładu Patomorfologii Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego. Próbki poddane badaniom pochodziły od 40 chorych.

W celu detekcji mutacji CDKN2A zastosowano metodę polimorfizmu konformacji pojedynczych nici DNA (ang. polymerase chain reaction – single strand conformation polimorphism – PCR-SSCP). W pierwszym etapie dokonano odparafinowania wycinków czerniaka w sposób typowy jak w przypadku przygotowania preparatu histopatologicznego, a następnie przeprowadzono izolację DNA przy użyciu zestawu Genomic Mini firmy A&A Biotechnology według załączonego protokołu.

Metoda PCR-SSCP

Technika ta polegała na amplifikacji wyizolowanego materiału genetycznego klasyczną metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (ang. polymerase chain reaction – PCR). Skład mieszaniny reakcyjnej na jedną probówkę jest następujący: Polimeraza Taq 100 U/µl 0,2 µl, jony magnezu 10 mM 1,2 µl, bufor reakcyjny 4 µl, dNTP 0,4 µl, starter F 2 µl, starter R 2 µl, woda 9,2 µl i DNA pacjenta 1 µl. Wykorzystano następujące pary starterów: 1) dla eksonu 1: 1/16F 5’-GGG AGC AGC ATG GAG CCG-3’, 1/16R 5’-AGT CGC CCG CCA TCC CCT-3’; 2) dla eksonu 2: 2A/16F 5’-AGC TTC CTT TCC GTC AGT-3’ dla formy dzikiej DNA, 2A/16R 5’-CCA GGT CCA CCG GCA GA-3’ dla formy dzikiej DNA, 2B/16F 5’-AGC CCA ACT GCG CCG AC-3’, 2B/16R 5’-CCA GGT CCA CCG GCA GA-3’, 2C/16F 5’-TGG ACG TGC GCG ATG C-3’, 2C/16R 5’-GGA AGC TCT CAG GGT ACA AAT TC-3’; 3) dla eksonu 3: 3/13F 5’-CCG GTA GGG ACG GCA AGA GA-5’, 3/16R 5’-CTG TAG GAC CCT CGG TGA CTG ATG A-3’. Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 20 µl. Reakcja PCR obejmowała 3 cykliczne, powtarzające się 35 razy etapy poprzedzone wstępną denaturacją DNA w temperaturze 94°C. Uzyskany produkt amplifikacji był denaturowany termicznie w buforze obciążającym z dodatkiem formamidu do jednoniciowego ssDNA, a następnie poddawany 10-godzinnej elektroforezie w 10% żelu poliakrylamidowym, w temperaturze 8°C, przy napięciu 200 V w warunkach niedenaturujących.

Barwienie srebrem

Żel inkubowano w azotanie srebra (0,2-procentowy roztwór, 30 minut) z dodatkiem formaldehydu, a następnie płukano w wodzie dejonizowanej. W celu uwidocznienia uzyskanych prążków żel inkubowano w 3-procentowym roztworze węglanu sodu. Po wybarwieniu żelu reakcję zatrzymywano 200 ml 10-procentowego roztworu kwasu octowego. Wyniki wstępnie odczytywano, analizowano i archiwizowano przy zastosowaniu oprogramowania Doc-ItLS.

Wyniki

W preparatach DNA izolowanego ze zmian czerniakowych pochodzących od 40 pacjentów zaobserwowano różnice migracji konformerów w elektroforezie SSCP (ryc. 1.–3.). W 38 z 40 badanych wycinków (95%) stwierdzono mutacje w genie CDKN2A. W 2 tkankach (5%) nie ujawniono żadnej mutacji w obrębie tego genu.

U 8 z 40 badanych pacjentów (20%) zaobserwowano mutacje tylko w eksonie 1, 26 chorych (65%) miało mutacje w eksonie 2 – wariant A, u 8 (20%) wystąpiły mutacje w eksonie 2 – wariant B, a u 32 pacjentów (80%) wykryto mutacje w eksonie 3 (tab. I).

U 6 z 40 badanych osób (15%) obecne były mutacje w eksonie 1 i 2, a u 3 (7,5%) w eksonie 1 i 2B. Mutacje w eksonie 3 i 2A stwierdzono u 21 pacjentów (52,5%), w eksonie 3 i 2B u 8 chorych (20%), a w eksonie 1 i 3 u 8 badanych (20%) (tab. II). W niektórych guzach stwierdzono więc przynajmniej 2 mutacje (2A i 3), ale na pewno w części guzów mutacje były liczniejsze.

Spośród 40 (100%) badanych próbek rozpoznanego czerniaka w 38 (95%) zaobserwowano mutacje w genie CDKN2A. W 2 tkankach (5%) nie wykazano żadnej mutacji w obrębie tego genu.

Omówienie

Czerniak stanowi około 2% wszystkich nowotworów i jest przyczyną około 1% ogółu zgonów z przyczyn nowotworowych. Udział genu CDKN2A w regulacji cyklu komórkowego jest znaczący. Prawidłowy przebieg tego cyklu kontrolują białka p16 i p14ARF. Mutacje obecne w genie CDKN2A mogą w sposób istotny zaburzyć funkcje biologiczne tych białek, powodować ich nadmierną bądź niewystarczającą ekspresję.

Rola białka p16 jako inhibitora kinaz cyklu komórkowego oraz udział białka p14ARF w stabilizacji białka p53 sugerują, że zmiany w budowie lub funkcji tych białek będące wynikiem mutacji mogą się przyczynić do powstania różnych nowotworów.

W wielu przeprowadzonych badaniach molekularnych, których celem była analiza zależności pomiędzy mutacjami w genie CDKN2A a różnymi nowotworami, wykazano ich związek z nowotworami żołądka, trzustki, jelit, skóry, układu nerwowego, głowy, szyi, jajnika oraz piersi. Autorzy badań wśród przyczyn inaktywacji genu CDKN2A wymieniają: utratę locus p21, hipermetylację wysp CpG w odcinku promotorowym, homozygotyczne delecje, mutacje w obrębie części kodującej genu, niestabilność odcinków promotorowych oraz polimorfizmy genetyczne [11, 12, 16–23]. Według Piepkorna [24] zmiany dotyczące p16 są powszechne w hodo­wli czerniaka i dotyczą około 70% badanych komórek. Delecje p16 występują znacznie częściej niż mutacje punktowe. Z kolei Kaczmarek i wsp. [22] badali mechanizmy inaktywacji p16 w czerniakach skóry i oka. Stosując technikę PCR-SSCP, stwierdzili w dwóch przypadkach substytucję C/T, która nie powoduje jednak zmiany kodowanego aminokwasu. Chin i wsp. [25] wskazują na występowanie intragenicznych mutacji u krewnych osób chorych na czerniaka rodzinnego, w szczególności p16INK4A, przy zachowaniu prawidłowej funkcji p14ARF. Sugerują ponadto, że u 25–40% rodzin podatnych na czerniaka oraz 0,2–2% chorych na czerniaka sporadycznego występują mutacje INK4A w regionach kodujących oraz polimorfizm 5’ i 3’ UTR. Straume i wsp. [26] badali mutacje w CDKN2A czerniaka skóry. Tylko w 2 spośród 50 przypadków, tj. u 4%, wystąpiły zmiany sekwencji genu, wszystkie w eksonie 2. Monzon i wsp. [27] analizowali występowanie mutacji w genie CDKN2A u osób z czerniakiem wielopostaciowym. Stosując analizę SSCP, zaobserwowali różnice migracji konformerów u 5 spośród 33 pacjentów (15%), 2 mutacje zlokalizowali w eksonie 1 oraz 2 w eksonie 2. Freedberg i wsp. [28], badając mechanizmy zaburzenia ekspresji p14ARF i p16 w liniach komórkowych czerniaka, wykazali, że głównym mechanizmem inaktywującym oba białka jest delecja obejmująca region między eksonem 1b ARF a eksonem 1 p16. Oceniając częstość zmian p16 i p14ARF, ci sami badacze wykorzystali guzy przerzutowe czerniaka i wykazali, że 68% guzów ma delecję obejmującą eksony 1, 1b i 2, 58% guzów charakteryzuje się trwałą utratą eksonu 1b, natomiast 31% ma całkowicie nieaktywne regiony kodujące p16. Metylacja promotora ARF wystąpiła w 57% guzów, metylacja odcinka promotorowego p16 w 27%, natomiast 12% przypadków charakteryzowało się metylacją promotorów obu białek.

W badaniu własnym wszystkie tkanki pochodziły od 40 chorych na czerniaka. Mutację stwierdzono u 38 pacjentów, co stanowi 95% wszystkich badanych. Zastosowana metoda PCR-SSCP nie pozwoliła jednoznacznie określić częstości występowania poszczególnych mutacji p16 i p14, gdyż w badaniu nie użyto markerów dla analizowanych mutacji.

Rola p16 w rozwoju czerniaka skóry jest dobrze poznana i opisana w piśmiennictwie, jednak udział w tym procesie ARF w dalszym ciągu pozostaje kontrowersyjny. Aby rozwiązać ten problem, w różnych ośrodkach nadal trwają badania nad zmianami genetycznymi i epigenetycznymi w locus 9p21 oraz poszukiwania genów zaangażowanych w transformację nowotworową czerniaka.

Wnioski

W badaniach własnych odsetek czerniaków skóry, w których występują mutacje p16 i p14 genu CDKN2A, jest bardzo duży i wynosi 95%. Świadczy to o dużej swoistości mutacji w obrębie białek strażników genomu p14 i p1 genu CDKN2A.

Piśmiennictwo

 1. Bień S.: Czerniak złośliwy w obrębie głowy i szyi. Otorynolaryngol Pol 2005, 4, 113-120.  

2. Iżycki D.: Współczesne poglądy na czynniki ryzyka i profilaktykę czerniaka złośliwego. Zakład Immunologii Nowotworów, Katedra Biotechnologii, Uniwersytet Medyczny w Poznaniu.  

3. Kordek R.: Onkologia. Podręcznik dla studentów i lekarzy. Via Medica, Gdańsk, 2007.  

4. Starska K., Łukomski M.: Rola limfocytów Th i Tc w powstawaniu i progresji nowotworów głowy i szyi. Otorynolaryngol Pol 2005, 4, 59-63.  

5. Wideł M.S., Wideł M.: Mechanizmy przerzutowania i markery progresji nowotworów złośliwych. I. Rak jelita grubego. Post Hig Med Dośw 2006, 60, 453-470.  

6. Domagała W.: Molekularne podstawy karcynogenezy i ścieżki sygnałowe niektórych nowotworów ośrodkowego układu nerwowego. Pol Przegl Neurol 2007, 3, 127-141.  

7. Pławski A., Podralska M., Krokowicz P., Paszkowski J., Lubiński J., Słomski R.: Rodzinna polipowatość gruczolakowata jelita grubego. Post N Med 2008, 7, 463-471.  

8. Laud K., Marian C., Avril M.F., Barrois M., Chompred A., Goldstein A.M.: Comprehensive analysis of CDKN2A (p16INK4A/p14ARF) and CDKN2B genes in 53 melanoma index cases considered to be at heightened risk of melanoma. J Med Genet 2006, 43, 39-47.  

9. Soufir N., Lacapere J.J., Bertrand G., Matichard E., Meziani R., Mirebeau D. i inni: Germline mutations of the INK4A-ARF gene in patients with suspected genetic predisposition to melanoma. Br J Cancer 2004, 90, 503-509.

10. Rhind N., Russell P.: Checkpoints: it takes more than time to heal some wounds. Curr Biol 2000, 10, R908-R911.

11. Robertson K.D., Jones P.A.: Tissue-specific alternative splicing in the human INK4A/ARF cell cycle regulatory locus. Oncogene 1999, 18, 3810-3820.

12. Rocco J.W., Sindransky D.: p16 (MTS-1/CDKN2/INK4A) in cancer progression. Exp Cell Res 2001, 264, 42-55.

13. Lamperska K., Przybyła A., Kaczmarek A., Leporowska E., Mackiewicz A.: Podłoże genetyczne czerniaka – badania własne i przegląd piśmiennictwa. Współ Onkol 2006, 10, 297-302.

14. Sekulic A., Haluska P., Miller A.J., Genebriera De Lamo J., Ejadi S., Pulido J.S. i inni: Maliganat melanoma in the 21st century: the emerging molecular landscape. Mayo Clin Proc 2008, 83, 825-846.

15. Harland M., Goldstein A.M., Kukalizch K., Taylor C., Hogg D., Puig S. i inni: A comparison of CDKN2A mutation detection within the Melanoma Genetics Consortium. Eur J Cancer 2008, 44, 1269-1274.

16. Ayrault O., Andrique L., Larsen C.J., Seite P.: Human Arf tumor suppressor specifically interacts with chromatin containing the promoter of rRNA genes. Oncogene 2004, 23, 8097-8104.

17. Bartsch D.K., Sina-Frey M., Lang S., Wild A., Gerdes B., Barth P. i inni: CDKN2A germline mutations in familial pancreatic cancer. Ann Surg 2002, 236, 730-737.

18. Eymin B., Karayan L., Seite P., Brambilla C., Brambilla E., Larsen C.J. i inni: Human ARF binds E2F1 and inhibits its transcriptional activity. Oncogene 2001, 20, 1033-1041.

19. Eymin B., Leduce C., Coll J.L., Brambilla E., Gazzeri S.: p14ARF induces G2 arrest and apoptosis independently of p53 leading to regression of tumours established in nude mice. Oncogene 2003, 22, 1822-1835.

20. Karayan L., Riou J.F., Seite P., Migeon J., Cantereau A., Larsen C.J.: Human ARF protein interacts with topoisomerase I and stimulates its activity. Oncogene 2001, 20, 836-848.

21. Lamperska K., Karazewska A., Kwiatkowska E., Mackiewicz A.: Analysis of mutation in the p16/CDKN2A gene in sporadic and familial melanoma in the Polish population. Acta Biochim Pol 2002, 49, 369-376.

22. Kaczmarek A., Romanowska B., Kwiatkowska E., Heitzman J., Mackiewicz K., Lamperska K. i inni: Analiza ekspresji białka oraz mutacji i metylacji wysp CpG p16 w komórkach pierwotnego sporadycznego czerniaka oka. Współcz Onkol 1999, 6, 231-233.

23. Peters G.: Tumor suppression for ARFicionados: the relative contributions of p16INK4A and p14ARF in melanoma. JNCI 2008, 100, 757-759.

24. Piepkorn M.: Melanoma genetics: an update with focus on the CDKN2A(p16)/ARF tumor suppressor. J Am Acad Dermatol 2000, 42, 705-726.

25. Chin L., Garraway L.A., Fisher D.E.: Malignant melanoma: genetics and therapeutics in the genomic era. Genes Dev 2006, 20, 2149-2182.

26. Straume O., Smeds J., Kumar R., Hemminki K., Akslen L.A.: Significant impact of promoter hypermethylation and the 540 C>T polimorphism of CDKN2A in cutaneous melanoma of the vertical growth phase. Am J Pathol 2002, 161, 229-237.

27. Monzon J., Liu L., Brill H., Goldstein A.M., Tucker M., From L. i inni: CDKN2A mutations in multiple primary melanoma. N Engl J Med 1998, 338, 879-887.

28. Freedberg D., Rigas S.H., Russak J., Gai W., Kaplow M., Osman I. i inni: Frequent p16-independent inactivation of p14ARF in human melanoma. JNCI 2008, 100, 784-795.





Otrzymano: 25 III 2011 r.

Zaakceptowano: 26 IV 2011 r.