Diagnostic and prognostic value of O-linked N-acetylglucosamine transferase transferase in bladder neoplastic transformation in postmenopausal women

Wstęp

N-acetyloglukozamina transferazy z wiązaniem

O-glikozydowym (O-linked N-acetylglucosamine transferase – OGT) jest jednym z dwóch enzymów związanych z potranslacyjną modyfikacją białek komórkowych

(O-GlcNAcylacją), która polega na przyłączeniu do seryny lub treoniny wiązaniem O-glikozydowym (O-GlcNAc),

pojedynczych reszt N-acetyloglukozoaminy [1]. Wyniki wielu badań wskazują, że O-GlcNAcylacja odgrywa ważną rolę w procesach związanych z nowotworzeniem, takich jak metabolizm, transkrypcja, regulacja cyklu komórkowego i reorganizacja cytoszkieletu [2].

O-GlcNAcylacja jest modyfikacją wykazującą cechy predestynujące ją do odgrywania roli w przekazywaniu sygnału w komórce. Po pierwsze, jest to modyfikacja bardzo dynamiczna. Okres połowicznego zaniku reszt cukrowych jest znacznie krótszy niż ten sam czas dla polipeptydu. Po drugie, poziom O-GlcNAcylacji białek zmienia się w zależności od dostępności składników odżywczych, stymulacji komórek czynnikami wzrostu i insuliną, a także zależy od fazy cyklu komórkowego. Po trzecie, istnieje ścisły związek pomiędzy

O-GlcNAcylacją i fosforylacją białek komórkowych. W wielu wypadkach reszty O-GlcNAc i fosforanowe rywalizują ze sobą o miejsce wiązania [3].

Szereg doniesień wskazuje na zaburzenia

O-GlcNAcylacji w procesie nowotworzenia. W przypadku niektórych raków, np. tarczycy, piersi, płuc i jelita grubego, stwierdzono znaczne zmiany w poziomie

O-GlcNAcylacji białek komórkowych, w porównaniu z tkanką prawidłową lub nowotworami łagodnymi

[4–10]. Zmiany O-GlcNAcylacji skorelowane były ze zmianami aktywności lub ekspresji enzymów zaangażowanych w O-GlcNAcylację, czyli O-GlcNAc transferazy oraz β-N-acetylo-D-glukozaminidazy (OGA), enzymu odłączającego reszty O-GlcNAc.

Wcześniejsze badania dotyczące oceny przydatności oznaczania ekspresji genu kodującego β-N-acetylo-

-D-glukozaminidazę (MGEA5) w moczu kobiet chorych na nowotwory pęcherza moczowego dały bardzo obiecujące wyniki ze względu na wysoką czułość (85,2%) i swoistość (95,0%) tego markera molekularnego. Wyznaczona wartość progowa 98,3 pozwoliła na precyzyjne oddzielenie od siebie populacji kobiet chorych na nowotwory pęcherza moczowego od grupy kobiet zdrowych [11]. Biorąc pod uwagę te wyniki, jak również coraz liczniejsze dane sugerujące zaangażowanie O-GlcNAcylacji w procesy związane z powstawaniem i progresją nowotworów, interesujące wydaje się zbadanie u pacjentek z nowotworami pęcherza moczowego również ekspresji OGT. W związku z powyższym, celem badań była ocena ekspresji OGT na poziomie matrycowego kwasu rybonukleinowego (mRNA) w czasie rzeczywistym

(real-time) metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (polimerase chain reaction – PCR) oraz ocena przydatności diagnostycznej i prognostycznej badanego genu jako markera transformacji nowotworowej pęcherza moczowego u kobiet w wieku pomenopauzalnym.

Materiał i metody

Materiał do badań stanowiły preparaty moczu pozyskanego od 52 kobiet ze zdiagnozowanymi nowotworami pęcherza moczowego. Średnia wieku w tej grupie wynosiła 56,8 ±13,4. U 46 kobiet zdiagnozowano raka pęcherza moczowego, natomiast u 6 brodawczakowaty nowotwór przejściowonabłonkowy o niskim potencjale złośliwości (papillary urothelial neoplasm of low malignant potential – PUNLMP). Charakterystyka kliniczno-patologiczna preparatów przedstawiona została w tabeli I. Materiał kontrolny stanowiły preparaty moczu pozyskanego od 37 kobiet, u których w badaniu ultrasonograficznym (USG) nie zdiagnozowano zmian nowotworowych. Złuszczone komórki nabłonkowe izolowano z ok. 50 ml moczu. Bezpośrednio po pobraniu próbki moczu przechowywano w temperaturze 4oC do chwili wykonywania oznaczeń, a następnie wirowano przy 2000 obr./min przez 15 min. Otrzymany osad przemywano dwukrotnie zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej (pH 7,6) i przechowywano w temperaturze –80oC do dalszych oznaczeń.

Izolowanie kwasu rybonukleinowego i synteza komplementarnego kwasu deoksyrybonukleinowego

Całkowity kwas rybonukleinowy (RNA) izolowano przy użyciu odczynnika TRI Reagent® (Sigma-Aldrich Corp, St. Louis, MO, USA) zgodnie z zaleceniami producenta. Czystość otrzymanych preparatów RNA określano metodą spektrofotometryczną poprzez pomiar absorbancji przy długości fali 260 nm i 280 nm. Przyjętym kryterium czystości kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) była wartość A260/A280 mieszcząca się w granicach 1,8–2,0. Reakcję odwrotnej transkrypcji przeprowadzano przy użyciu zestawu PCR Kit ver. 3.0 (Takara Bio Inc. Japonia) zgodnie z zaleceniami producenta. Komplementarny DNA (complementary DNA – cDNA) przechowywano w temperaturze –20°C.

Analiza ilościowa produktu amplifikacji w czasie rzeczywistym

Otrzymany RNA stanowił matrycę w reakcji real-

time PCR dla oznaczenia liczby kopii mRNA dla genu OGT. Użyta mieszanina reakcyjna zawierała: 0,5 µl cDNA, 5 µl TaqMan® Universal PCR MasterMix, 0,5 µl 20 × TaqMan® Gene Expression Assays i 4 µl H2O. Reakcję łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym prowadzono w urządzeniu Mastercycler®ep realplex (Eppendorf). Początkowa ilość matrycy wyznaczana była na podstawie parametru Ct (teoretyczny numer cyklu, przy którym wartość fluorescencji jest wyższa niż przyjęta arbitralnie wartość graniczna). Pomiar wartości Ct wykonano w dwóch powtórzeniach, jako gen referencyjny wykorzystano GAPDH. Do badań zastosowano następujące sondy TaqMan® Gene Expression Assays (Applied Biosystems, USA): OGT – Hs00269228, GAPDH – Hs00266705_g1.

Analizy statystycznej wyników dokonano przy użyciu programu komputerowego STATISTICA wersja 9.0 (StatSoft, Poland) i MedCalc wersja 6.14 (MedCalc

Software, Belgia). Za statystycznie istotną przyjęto wartość p < 0,05. Diagnostyczną wartość progową dla OGT wyznaczono na podstawie krzywej charakterystyki odbiornika (receiver operating characteristic – ROC). Dla wartości tej obliczano czułość i swoistość. W oparciu o obliczone parametry utworzono wykres zależności czułości od wartości (100-procentowa swoistość). Wykres ten (krzywa ROC) posłużył do oceny zdolności rozdzielczej testów diagnostycznych. Pole pod krzywą (area under curve – AUC) ROC było sprawdzianem zdolności rozdzielczej testu. Za optymalną wartość graniczną dla OGT uznano wartość 416,93.

Wyniki

Ekspresję mRNA dla genu OGT stwierdzono w 36 z 46 (78,2%) preparatów moczu pozyskanego od kobiet ze zdiagnozowanym rakiem pęcherza moczowego, natomiast uwzględniając wyznaczoną normę – w 19 z 46 (41,3%). W grupie kontrolnej ekspresja ta wynosiła odpowiednio 18 z 37 (48,6%) i zgodnie z wyznaczoną normą 1 z 37 (2,7%).

Czułość OGT wynosiła 100%, a swoistość 88,9%. Pole pod krzywą ROC wynosiło 0,946 (ryc. 1.). Rozkład wartości relatywnych charakteryzujących ekspresję mRNA dla genu OGT w odniesieniu do wartości progowej przedstawia rycina 2.

Dyskusja

Funkcja O-GlcNAcylacji w powstawaniu i progresji nowotworów nie została jednoznacznie określona. Wyniki badań wskazują jednak, że analiza ekspresji i aktywności enzymów zaangażowanych w tę modyfikację może mieć bardzo istotne znaczenie w diagnostyce nowotworów. Duże natężenie O-GlcNAcylacji skorelowane z dużą ekspresją OGT wydaje się dobrym markerem progresji nowotworów piersi [6, 10]. Wykazano, że ekspresja OGT jest znacznie większa w rakach piersi słabo zróżnicowanych, o wyższym stopniu złośliwości niż w rakach dobrze zróżnicowanych. Z kolei małe stężenie mRNA dla OGA jest skorelowane z występowaniem przerzutów do węzłów chłonnych [10]. Stwierdzono także, że mała ekspresja OGA może być niezależnym czynnikiem rokowniczym w przypadku nawrotu raka wątrobowokomórkowego [9].

W prezentowanej pracy dokonano oceny przydatności diagnostycznej ekspresji OGT w moczu kobiet chorych na nowotwory pęcherza moczowego. Uzyskane wyniki wskazują, że oznaczanie ekspresji OGT na poziomie mRNA może się stać użytecznym wskaźnikiem w diagnostyce nowotworów pęcherza moczowego u kobiet w wieku pomenopauzalnym, ponieważ przy progowej wartości OGT 416,93 czułość testu wynosiła 100%, a swoistość 88,9%.

W piśmiennictwie naukowym coraz częściej podkreśla się konieczność wytypowania grupy markerów molekularnych, tak dobranych, aby w najlepszy sposób charakteryzowały one proces nowotworowy toczący się w obrębie dróg moczowych i które można by wykorzystać do poprawy diagnostyki raka pęcherza moczowego [12]. Wyniki badań autorów niniejszej pracy sugerują, że zarówno OGT, jak i analizowany wcześniej gen kodujący β-N-acetylo-D-glukozaminidazę mogą być włączone do panelu markerów, których oznaczenie w moczu kobiet w wieku pomenopauzalnym chorych na nowotwory pęcherza moczowego ma wartość diagnostyczną i prognostyczną. Dalsze badania na odpowiednio licznych grupach są niezbędne do stwierdzenia, czy proponowane przez autorów markery mogą być w przyszłości pomocne w podejmowaniu decyzji klinicznych.



Praca wykonana z funduszy działalności statutowej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi nr 503/0-157-01/503-01.

Praca wykonana z funduszy działalności statutowej Uniwersytetu Łódzkiego.

Piśmiennictwo

1. Hart GW, Slawson C, Ramirez-Correa G, Lagerlof O. Cross talk between O-GlcNAcylation and phosphorylation: roles in signaling, transcription, and chronic disease. Annu Rev Biochem 2011; 80: 825-58.

2. Slawson C, Hart GW. O-GlcNAc signalling: implications for cancer cell biology. Nat Rev Cancer 2011; 11: 678-84.

3. Hanover JA, Krause MW, Love DC. The hexosamine signaling pathway: O-GlcNAc cycling in feast or famine. Biochim Biophys Acta 2010; 1800: 80-95.

4. Krzeslak A, Pomorski L, Lipinska A. Elevation of nucleocytoplasmic beta-N-acetylglucosaminidase (O-GlcNAcase) activity in thyroid cancers. Int J Mol Med 2010; 25: 643-8.

5. Caldwell SA, Jackson SR, Shahriari KS, et al. Nutrient sensor O-GlcNAc transferase regulates breast cancer tumorigenesis through targeting of the oncogenic transcription factor FoxM1. Oncogene 2010; 29: 2831-42.

6. Gu Y, Mi W, Ge Y, et al. GlcNAcylation plays an essential role in breast cancer metastasis. Cancer Res 2010; 70: 6344-51.

7. Mi W, Gu Y, Han C, et al. O-GlcNAcylation is a novel regulator of lung and colon cancer malignancy. Biochim Biophys Acta 2011; 1812: 514-9.

8. Shi Y, Tomic J, Wen F, et al. Aberrant O-GlcNAcylation characterizes chronic lymphocytic leukemia. Leukemia 2010; 24: 1588-98.

9. Zhu Q, Zhou L, Yang Z, et al. O-GlcNAcylation plays a role in tumor recurrence of hepatocellular carcinoma following liver transplantation. Med Oncol 2011; 24: 567-71.

10. Krześlak A, Forma E, Bernaciak M, et al. Gene expression of O-GlcNAc cycling enzymes in human breast cancers. Clin Exp Med 2011; DOI 10.1007/s10238-011-0138-5.

11. Różański W, Lipiński M, Woźniak P i wsp. Ocena przydatności β-N-

-acetylo-D-dlukozaminidazy i endogliny jako markerów molekularnych w diagnostyce nowotworów pęcherza moczowego u kobiet w wieku pomenopauzalnym. Przegl Menopauz 2011; 3: 197-201.

12. Yutkin V, Nisman B, Pode D. Can urinary biomarkers replace cystoscopic examination in bladder cancer surveillance? Expert Rev Anticancer Ther 2010; 10: 787-90.