The influence of progesterone and 17β-estradiol on the activity of peripheral blood mononuclear cells

Wstęp

W regulacji funkcji układu odpornościowego bierze udział wiele czynników, m.in. hormony płciowe, szczególnie progesteron i 17β-estradiol. Warunkuje to różną reaktywność komórek biorących udział w odpowiedzi immunologicznej [1]. Limfocyty i monocyty, zaliczane do jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (peripheral blood mononuclear cell – PBMC), to jedne z najważniejszych komórek biorących udział zarówno w odporności nieswoistej, jak i swoistej. Dane z piśmiennictwa ostatnich lat potwierdzają obecność na powierzchni tych komórek receptorów zarówno dla estrogenów, jak i progesteronu, co wskazuje, że komórki te są wrażliwe na działanie hormonów płciowych [2]. Estrogeny stymulują różnicowanie limfocytów T w kierunku limfocytów T pomocniczych typu 2 (Th2), wzmagają odpowiedź humoralną, a tym samym produkcję przeciwciał. Z kolei progesteron wykazuje właściwości immunosupresyjne, co ma na celu ułatwienie implantacji zarodka [3, 4]. Wpływ tych hormonów na aktywność PBMC ma ogromne znaczenie, szczególnie w sytuacji, gdy są one dostarczane do organizmu w postaci preparatów terapeutycznych stosowanych jako składniki środków antykoncepcyjnych, oraz w zaburzeniach hormonalnych w okresie menopauzy, pierwotnej niedoczynności jajników, hormonalnej terapii zastępczej (HTZ) czy profilaktyce osteoporozy.

Markerem aktywności PBMC jest m.in. produkowany przez te komórki transformujący czynnik wzrostu (transforming growth factor β – TGF-β). Jest to wielofunkcyjna cytokina, należąca do rodziny dimerycznych polipeptydowych czynników wzrostu [5]. Bierze udział w regulacji cyklu komórkowego oraz wpływa na wzrost i różnicowanie zarówno komórek układu odpornościowego, jak i komórek narządowo swoistych [6, 7].

Cel pracy

Celem pracy było zbadanie w warunkach hodowli komórkowej wpływu progesteronu i 17β-estradiolu na aktywność PBMC osoby zdrowej. Miarą aktywności było stężenie produkowanego przez te komórki TGF-β.

Materiał i metody

Materiał do badań stanowiły PBMC izolowane z krwi 25 dawców w wieku 25–37 lat (średnia wieku 32,04 ±5,81 roku). Mężczyźni oddawali krew w Regionalnym Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa w Katowicach. Wszyscy badani byli zdrowi i na podstawie badania ankietowego i lekarskiego oraz wyników badań laboratoryjnych zostali zakwalifikowani do oddania krwi. Od każdego dawcy pobrano 10 ml krwi żylnej na heparynę w systemie zamkniętym. Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej izolowano poprzez wirowanie na gradiencie gęstości (LinfoSep, Biomedics, Spain), a następnie zawieszano w medium hodowlanym (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Bio Wittaker, Belgium), które zawierało mieszaninę antybiotyków (Penicillin-Streptomycin Solution, Sigma, USA) oraz 10-procentową płodową surowicę cielęcą (Fetal Bovine Serum, BioWittaker, Belgium). Komórki hodowano przez 48 godz. w temperaturze 37°C i atmosferze 5-proc. CO2 w samym podłożu (hodowla podstawowa) oraz w podłożu z dodatkiem różnych stężeń (1 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml) progesteronu i 17β-estradiolu (Sigma, USA). Po zakończonej inkubacji supernatant zebrano i przechowywano w temperaturze –80°C. Stężenie TGF-β w supernatancie z hodowli PBMC oznaczano metodą immunoenzymatyczną ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (TGF-β ELISA, DRG Instruments GmbH, Germany). Czułość testu wynosiła 10 pg/ml.

Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach. Wszyscy badani zostali poinformowani o celu prowadzonych badań i wyrazili zgodę na pobranie krwi.

Wyniki opracowano statystycznie za pomocą programu Statistica v. 8. Do oceny rozkładu normalności wykorzystano test Shapiro-Wilka oraz jednoczynnikowy test ANOVA w celu oceny istotności różnic. Za istotny statystycznie przyjmowano wartość p ≤ 0,05.

Wyniki

Uzyskane wyniki przedstawiono w tabeli I i na rycinie 1. Analiza otrzymanych danych wykazała, że po stymulacji zarówno progesteronem, jak i 17β-estradiolem aktywność sekrecyjna PBMC zmieniała się. Wraz ze zwiększeniem stężenia progesteronu stężenie TGF-β było istotnie statystycznie większe w porównaniu z hodowlą komórek niestymulowanych (p < 0,0001). Natomiast zwiększoną istotnie statystycznie sekrecję badanego parametru przez PBMC obserwowano dopiero po stymulacji komórek 17β-estradiolem o stężeniu 5 ng/ml (p < 0,0001).

Dyskusja

Prawidłowa odpowiedź immunologiczna uzależniona jest od aktywności komórek układu odpornościowego – zarówno od limfocytów, jak i monocytów. Czynnikami, które mogą modulować aktywność tych komórek i wpływać na przebieg odpowiedzi immunologicznej, są hormony płciowe, takie jak progesteron i 17β-estradiol. Prowadzone badania miały na celu ustalenie, jaki wpływ wywierają te hormony na aktywność PBMC u zdrowych ludzi. W tym celu komórki te izolowano od zdrowych mężczyzn, co pozwoliło na uniknięcie endogennego wpływu hormonów na badane komórki, jaki niewątpliwie występowałby w przypadku komórek izolowanych z krwi kobiet. Aktywność PBMC oznaczano poprzez pomiar stężenia TGF-β produkowanego przez te komórki. Analiza otrzymanych wyników wykazała, że zarówno po stymulacji progesteronem, jak i 17β-estradiolem aktywność sekrecyjna PBMC zmieniała się. Wraz ze zwiększeniem stężenia progesteronu, którym stymulowano komórki, zwiększała się sekrecja TGF-β. Natomiast wzrost wydzielania badanego czynnika po stymulacji 17β-estradiolem obserwowano dopiero po zastosowaniu większych stężeń hormonu.

Transformujący czynnik wzrostu beta to ważna cytokina biorąca udział w regulacji procesów komórkowych, m.in. proliferacji, różnicowaniu i apoptozie. Ponadto odgrywa ważną rolę w mikrośrodowisku jamy macicy, biorąc udział w przebudowie i przygotowaniu endometrium do przyjęcia zapłodnionej komórki jajowej, co umożliwia prawidłowy przebieg ciąży [8, 9]. Produkcja i sekrecja TGF-β w endometrium jest ściśle związana z wydzielaniem hormonów płciowych i fazą cyklu menstruacyjnego. Dowodzi to, że TGF-β zaangażowany jest w rozpoczęcie procesu menstruacji oraz bierze udział w wytworzeniu lokalnego stanu zapalnego, któremu towarzyszy napływ komórek układu odpornościowego [10]. Dostępne badania dowodzą także, że nieprawidłowa sekrecja TGF-β może zwiększać ryzyko utraty ciąży, a także być związana z niepłodnością u kobiet [11]. Badania wskazują również, że źródłem TGF-β mogą być komórki endometrialne oraz doczesna, co potwierdza rolę tego czynnika w implantacji i tworzeniu łożyska [12]. Ponadto Omwandho i wsp. [13] zaobserwowali duże stężenie TGF-β u kobiet w okresie menopauzy, co może sugerować, że bierze on udział w pomenopauzalnej regeneracji endometrium.

Z dostępnych danych piśmiennictwa wynika, że do tej pory nie badano stężenia TGF-β jako markera aktywności PBMC stymulowanych hormonami płciowymi. W piśmiennictwie dostępne są natomiast informacje, które potwierdzają zmiany aktywności tych komórek pod wpływem stymulacji progesteronem i 17β-estradiolem, jednak wyniki tych badań są niejednoznaczne.

Jain i wsp. [14] wykazali, że 17β-estradiol powoduje zahamowanie wydzielania interleukiny 6 (IL-6) przez monocyty i makrofagi, natomiast progesteron może powodować wzrost sekrecji czynnika martwicy nowotworu (tumor necrosis factor – TNF). Zwiększenie stężenia prozapalnych cytokin we krwi może być związane ze zwiększeniem ryzyka chorób serca u kobiet po menopauzie. Asai i wsp. [15] stwierdzili, że 17β-estradiol nie wpływał na sekrecję IL-6 i TNF, natomiast hamował wydzielanie IL-10 przez PBMC. Z kolei badania prowadzone przez Boumana i wsp. [16] wykazały, że na aktywność monocytów i wydzielanie przez nie IL-1β i TNF nie ma istotnego wpływu zarówno stymulowanie progesteronem, jak i 17β-estradiolem. Nie wykazali oni także żadnej korelacji między sekrecją tych cytokin a stężeniem hormonów płciowych. Ich zdaniem, nadmierna aktywacja receptorów estrogenowych zlokalizowanych na makrofagach otrzewnowych może powodować zaburzenia w szlaku przekazywania sygnału zależnego od białek Smad, co z kolei może być związane z brakiem efektu biologicznego wywoływanego przez TGF-β [17, 18].

Hormony płciowe w zależności od dawki wykazują różne działanie modulujące aktywność PBMC. Potwierdzają to również badania autorek artykułu, w których zarówno po stymulacji progesteronem, jak i 17β-estradiolem obserwowano tzw. efekt dawki. Podobne badania prowadzili Morishita i wsp. [19]. Stwierdzili oni jednak, że estradiol tylko w małych stężeniach zwiększa produkcję IL-1, jednak po stymulacji większymi dawkami sekrecja tej cytokiny malała. Również większe stężenia progesteronu wpływają hamująco na sekrecję IL-1.

Dane z piśmiennictwa pozwalają także na stwierdzenie, że progesteron i 17β-estradiol wpływają na procesy różnicowania limfocytów Th1 i Th2, co znajduje odbicie w ogólnoustrojowej zmianie odporności kobiet. Hormony te powodują hamowanie odpowiedzi komórkowej typu Th1, która wiąże się z wydzielaniem prozapalnych cytokin. Stymulują natomiast różnicowanie limfocytów w kierunku komórek Th2, które wytwarzają cytokiny przeciwzapalne, takie jak IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 oraz IL-13, warunkujące dojrzewanie pęcherzyka jajnikowego, funkcjonowanie ciałka żółtego oraz implantację, a w konsekwencji prawidłowy przebieg ciąży [20].

Wielu badaczy zajmuje się oceną aktywności komórek układu odpornościowego u kobiet po menopauzie stosujących HTZ. Stopińska-Głuszak i wsp. [21] oceniali, jak estrogen i medroksyprogesteron, stosowane w HTZ, wpływają na aktywność cytotoksyczną komórek NK (natural killer) oraz aktywność sekrecyjną PBMC. Z przeprowadzonych badań wynika, że u kobiet, które stosowały te czynniki, obserwuje się spadek cytotoksyczności komórek NK oraz zmniejszone wydzielanie IL-2 i interferonu γ, a także zmiany sekrecji TNF. Niemniej jednak uzyskane wyniki wskazują, że estrogenowo-progesteronowa terapia hormonalna może mieć wpływ na zmiany w funkcjonowaniu komórek układu odpornościowego i nadzór immunologiczny, przez co może sprzyjać rozwojowi chorób autoimmunologicznych i nowotworowych [21]. Inni autorzy sugerują natomiast, że niedostateczna produkcja estrogenów u kobiet po menopauzie jest przyczyną wzrostu sekrecji cytokin prozapalnych oraz zmniejszenia liczby limfocytów Th CD4+ i limfocytów B. Ponadto, zwiększona sekrecja IL-6 jest przyczyną aktywacji osteoklastów i zwiększonej resorpcji kości. Dlatego też suplementacja egzogennymi hormonami płciowymi może zapobiec tym procesom [22, 23]. Niestety, konieczne są dodatkowe badania, które pozwolą na dokładne wyjaśnienie tego problemu.

Podsumowując, przedstawione dane wskazują, że zarówno progesteron, jak i 17β-estradiol wpływają modulująco na komórki układu odpornościowego, szczególnie na aktywność limfocytów i monocytów. Wykazano, że działanie tych hormonów uzależnione jest od ich stężenia. Poznanie zarówno czynników, jak i mechanizmów, które mogą wpływać na aktywność tych komórek, pozwoli na wprowadzenie nowych środków terapeutycznych, które regulując aktywność komórek układu odpornościowego, będą bardziej skuteczne i bezpieczne w użyciu.

Wnioski

Progesteron i 17β-estradiol wykazują wpływ na aktywność PBMC, co manifestuje się zwiększoną sekrecją TGF-β przez te komórki.

Hormony płciowe w zależności od dawki wykazują różne działanie modulujące aktywność PBMC.

Zwiększoną aktywność tych komórek obserwuje się po stymulacji większymi stężeniami hormonów, co znacznie wpływa na sekrecję TGF-β.



Badania zostały sfinansowane ze środków Umowy Własnej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach.

Piśmiennictwo

1. Bouman A, Heineman MJ, Faas MM. Sex hormones and the immune response in humans. Hum Reprod Update 2005; 11: 411-23.

2. Wira CR, Fahey JV, Ghosh M, et al. Sex hormone regulation of innate immunity in the female reproductive tract: the role of epithelial cells in balancing reproductive potential with protection against sexually transmitted pathogens. Am J Reprod Immunol 2010; 63: 544-65.

3. Cunningham M, Gilkeson G. Estrogen receptors in immunity and autoimmunity. Clin Rev Allergy Immunol 2011; 40: 66-73.

4. Szekeres-Bartho J, Halasz M, Palkovics T. Progesterone in pregnancy; receptor-ligand interaction and signaling pathways. J Reprod Immunol 2009; 83: 60-4.

5. Tandon A, Tovey JC, Sharma A, et al. Role of transforming growth factor Beta in corneal function, biology and pathology. Curr Mol Med 2010;

10: 565-78.

6. Meulmeester E, Ten Dijke P. The dynamic roles of TGF-β in cancer. J Pathol 2011; 223: 205-18.

7. Gordon KJ, Blobe GC. Role of transforming growth factor-beta superfamily signaling pathways in human disease. Biochim Biophys Acta 2008; 1782: 197-228.

8. Jones RL, Stoikos C, Findlay JK, Salamonsen LA. TGF-beta superfamily expression and actions in the endometrium and placenta. Reproduction 2006; 132: 217-32.

9. Komiyama S, Aoki D, Komiyama M, Nozawa S. Local activation of TGF-beta1 at endometriosis sites. J Reprod Med 2007; 52: 306-12.

10. Gaide Chevronnay HP, Cornet PB, Delvaux D, et al. Opposite regulation of transforming growth factors-beta2 and -beta3 expression in the human endometrium. Endocrinology 2008; 149: 1015-25.

11. Skrzypczak J, Wirstlein P, Mikołajczyk M, et al. TGF superfamily and MMP2, MMP9, TIMP1 genes expression in the endometrium of women with impaired reproduction. Folia Histochem Cytobiol 2007; 45 (Suppl 1): S143-8.

12. McIntire RH, Ganacias KG, Hunt JS. Programming of human monocytes by the uteroplacental environment. Reprod Sci 2008; 15: 437-47.

13. Omwandho CO, Konrad L, Halis G, et al. Role of TGF-betas in normal human endometrium and endometriosis. Hum Reprod 2010; 25: 101-9.

14. Jain SK, Kannan K, Prouty L, Jain SK. Progesterone, but not 17beta-estradiol, increases TNF-alpha secretion in U937 monocytes. Cytokine 2004; 26: 102-5.

15. Asai K, Hiki N, Mimura Y, et al. Gender differences in cytokine secretion by human peripheral blood mononuclear cells: role of estrogen in modulating LPS-induced cytokine secretion in an ex vivo septic model. Shock 2001; 16: 340-3.

16. Bouman A, Schipper M, Heineman MJ, Faas M. 17beta-estradiol and progesterone do not influence the production of cytokines from lipopolysaccharide-stimulated monocytes in humans. Fertil Steril 2004; 82 (Suppl 3): 1212-9.

17. Khan KN, Masuzaki H, Fujishita A, et al. Estrogen and progesterone receptor expression in macrophages and regulation of hepatocyte growth factor by ovarian steroids in women with endometriosis. Hum Reprod 2005; 20: 2004-13.

18. Cherlet T, Murphy LC. Estrogen receptors inhibit Smad3 transcriptional activity through Ap-1 transcription factors. Mol Cell Biochem 2007;

306: 33-42.

19. Morishita M, Miyagi M, Iwamoto Y. Effects of sex hormones on production of interleukin-1 by human peripheral monocytes. J Periodontol 1999; 70: 757-60.

20. Lea RG, Sandra O. Immunoendocrine aspects of endometrial function and implantation. Reproduction 2007; 134: 389-404.

21. Stopińska-Głuszak U, Waligóra J, Grzela T, et al. Effect of estrogen/progesterone hormone replacement therapy on natural killer cell cytotoxicity and immunoregulatory cytokine release by peripheral blood mononuclear cells of postmenopausal women. J Reprod Immunol 2006; 69: 65-75.

22. Gameiro C, Romao F. Changes in the immune system during menopause and aging. Front Biosci (Elite Ed) 2010; 2: 1299-303.

23. Bhavnani BR. Estrogens and menopause: pharmacology of conjugated equine estrogens and their potential role in the prevention of neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s. J Steroid Biochem Mol Biol 2003; 85: 473-82.