Activity of β-galactosidase and α-mannosidase in the serum of patients with colon adenocarcinoma

Wstęp
β-galaktozydaza (GAL) i α-mannozydaza (MAN) to egzoglikozydazy lizosomalne [1, 2], które uczestniczą w katabolizmie glikokoniugatów. β-galaktozydaza hydrolizuje reszty galaktozy od nieredukcyjnego końca oligosacharydów glikoprotein i proteoglikanów, natomiast α-mannozydaza odszczepia resztę mannozy od nieredukcyjnego końca N-wiązanych łańcuchów oligosacharydowych glikoprotein. Działanie MAN jest końcowym etapem katabolizmu glikokoniugatów [1, 3]. W naszych poprzednich publikacjach wykazaliśmy wzrost aktywności egzoglikozydaz lizosomalnych w tkankach i płynach biologicznych pacjentów z nowotworami [4–6].
Celem obecnej pracy jest ocena aktywności GAL i MAN w surowicy krwi chorych z gruczolakorakiem jelita grubego i stwierdzenie zasadności dalszych badań w celu ustalenia czy GAL i MAN mogą być biochemicznymi markerami gruczolakoraka tego odcinka przewodu pokarmowego.

Materiał i metody
Krew pobrano od 14 pacjentów (9 kobiet i 5 mężczyzn) w wieku od 39 do 81 lat (średnia 67±12,09 lat) z rozpoznanym histopatologicznie gruczolakorakiem (adenocarcinoma) jelita grubego, operowanych w I Klinice Chirurgii Ogólnej i Endokrynologicznej AM w Białymstoku. Grupę kontrolną stanowiło 14 osób zdrowych (5 kobiet i 9 mężczyzn) w wieku od 22 do 62 lat (średnia 35±10,67 lat). Stwierdzono zgodnie z klasyfikacją kliniczno-histopatologiczną u chorych z gruczolakorakiem jelita grubego stopień zróżnicowania komórkowego nowotworu G2 i stopnie zaawansowania klinicznego pT1 (n=1), pT2 (n=6), pT3 (n=5) i pT4 (n=2). Badanie wykonano za zgodą Komisji Bioetycznej Akademii Medycznej w Białymstoku (Nr zgody: R-I-003/153/2005).
Surowicę z wykrzepionej krwi otrzymano przez wirowanie przy 4000 x g w ciągu 10 min. Egzoglikozydazy lizosomalne GAL i MAN w surowicy krwi oznaczono metodą Zwierza i wsp. [2] w modyfikacji Szajdy i wsp. [4]. Pomiaru aktywności GAL i MAN dokonano przy użyciu czytnika płytek EL_X800 i programu komputerowego KC junior firmy BIO-TEK. Absorbancję powstałego kompleksu o barwie żółtej mierzono przy długości fali 405 nm. Aktywność GAL i MAN została wyrażona w pKat/ml (stężenie aktywności) i pKat/mg białka (aktywność specyficzna).
Białko całkowite w surowicy krwi oznaczano metodą Lowry [7]. Absorbancję powstałego kompleksu o barwie niebiesko-purpurowej mierzono przy użyciu spektrofotometru Specol 11 przy długości fali 750 nm. Stężenie białka wyrażano w mg/ml. Do analizy statystycznej testem Manna-Whitneya wykorzystano pakiet statystyczny SPSS® 8.0 for Windows PL (SPSS, Chicago, IL, USA). Za poziom istotności statystycznej przyjęto p <0,05.

Wyniki
Stężenie aktywności GAL i MAN w surowicy krwi chorych z gruczolakorakiem jelita grubego odpowiednio wynosiło 114,51±32,05 pKat/ml i 130,61±32,05 pKat/ml, a u osób zdrowych 80,86±17,98 pKat/ml i 102,87±23,72 pKat/ml (ryc. 1.).

Stężenie aktywności GAL (p=0,002) i MAN (p=0,02) w surowicy krwi chorych z gruczolakorakiem jelita grubego było istotnie wyższe w porównaniu do aktywności badanych enzymów w surowicy krwi osób zdrowych.
Brak było istotnych statystycznie różnic (p=0,9511) w stężeniu białka całkowitego w surowicy krwi chorych z gruczolakorakiem jelita grubego i surowicy krwi osób zdrowych (ryc. 2.).

Aktywność specyficzna GAL i MAN w surowicy krwi chorych z gruczolakorakiem jelita grubego wynosiła odpowiednio 2,46±0,69 pKat/mg białka i 2,80±0,74 pKat/mg białka, a w surowicy krwi osób zdrowych 1,73±0,41 pKat/mg białka i 2,19±0,53 pKat/mg białka. Jak wynika z ryc. 3., aktywność specyficzna GAL (p=0,003) i MAN (p=0,03) w surowicy krwi pacjentów z gruczolakiem jelita grubego jest istotnie wyższa od aktywności specyficznej badanych enzymów w surowicy krwi osób zdrowych.

Omówienie wyników
Glikokoniugaty podlegają ciągłym przemianom związanym z rozkładem starych i syntezą nowych cząsteczek. Degradacja glikokoniugatów zachodzi głównie w lizosomach przy udziale lizosomalnych enzymów hydrolitycznych, do których należą GAL i MAN [1, 3]. Genetycznie uwarunkowany brak GAL jest przyczyną spichrzania siarczanu keratanu, fragmentów glikoprotein i gangliozydów. W przypadku wrodzonego braku GAL dochodzić może do rozwoju choroby Krabbego, charakteryzującej się tendencją do odkładania się galaktozyloceramidu [8]. Wadliwa struktura MAN jest przyczyną mannozydozy, lizosomalnej choroby spichrzeniowej [9]. Bez prawidłowej aktywności MAN rozkład N – wiązanych oligosacharydów – zatrzymuje się na mannozie. Prowadzone przez nasz zespół badania wskazują na istotny wzrost stężenia aktywności i aktywności specyficznej GAL i MAN w surowicy krwi chorych z gruczolakorakiem jelita grubego (ryc. 1. i 3.). Takie stwierdzenie może być podstawą do rozważań, czy różnice w aktywności badanych egzoglikozydaz lizosomalnych mogą być wykorzystane w rozpoznaniu i monitorowaniu przebiegu gruczolakoraka jelita grubego. Prowadzone przez nasz zespół badania aktywności egzoglikozydaz lizosomalnych w raku nerki [5], trzustki [4] czy mózgu [6] sugerują możliwość wykorzystania badania tych enzymów w diagnostyce onkologicznej.

Wnioski
1. Oznaczenie aktywności GAL i MAN w surowicy krwi może mieć zastosowanie w diagnostyce gruczolakoraka jelita grubego. Wymaga jednak dalszych wnikliwych badań celem potwierdzenia wartości diagnostycznej egzoglikozydaz lizosomalnych.

Piśmiennictwo
1. Czartoryska B. Glikozydazy lizosomalne w katabolizmie heteropolisacharydów. Postępy Biochem 1977; 23: 229-66.
2. Zwierz K, Gindzieński A, Głowacka D, Porowski T. The degradation of glycoconjugates in the human gastric mucous membrane. Acta Med Acad Hung 1981; 38: 145-52.
3. Zwierz K, Gindzieński A, Ostrowska L, Stankiewicz-Choroszucha B. Metabolism of glycoconjugates in human gastric mucosa a review. Acta Med Hung 1989: 46; 275-88.
4. Szajda SD, Snarska J, Kamiński F, Siedlecka K, Waszkiewicz N, Knaś M, Zwierz K. The activity of N-acetyl-beta-D-hexosaminidase in serum and urine of patients with pancreatic cancer. Współcz Onkol 2006; 10: 92-5.
5. Borzym-Kluczyk M, Darewicz B, Knaś M, Szajda SD, Sulik M, Olszewska E, Zwierz K. The activity of N-acetyl-b-glucosaminidase and its isoenzymes in the renal tissue, serum and urine of patients with renal cancer. Współcz Onkol 2005; 9: 287-90.
6. Wielgat P, Walczuk U, Szajda S, Bien M, Zimnoch L, Mariak Z, Zwierz K. Activity of lysosomal exoglycosidases in human gliomas. J Neurooncol 2006; 80: 243-9.
7. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall R. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 1951; 193: 265-75.
8. Murray RK, Granner DK, Mayes PA. Biochemia Harpera. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 1994.
9. Beccari T, Stinchi S, Orlacchio A. Lysosomal alpha-D-mannosidase. Biosci Rep 1999; 19: 157-62.

Adres do korespondencji
dr med. Sławomir D. Szajda Zakład Biochemii Farmaceutycznej Akademia Medyczna ul. Mickiewicza 2A 15-230 Białystok tel. +48 85 748 56 90, +48 85 748 56 91 e-mail: spoak@amb.edu.pl