Activity of cancer procoagulant and cathepsin D in breast cancer

WSTĘP
Tkanki nowotworowe wytwarzają immunogenne substancje wydzielane do krwi lub innych płynów ustrojowych, nazwane biochemicznymi markerami nowotworowymi [1]. Oznaczanie tych markerów wykorzystywane jest do wykrywania, rozpoznawania nowotworu oraz monitorowania leczenia chorych [2]. Rolę markerów nowotworowych mogą pełnić enzymy: prokoagulant nowotworowy (cancer procoagulant CP) i katepsyna D.
Prokoagulant nowotworowy (CP) jest proteinazą cysteinową, która występuje w surowicy krwi i w tkankach rakowych osób chorych na nowotwory, a nie występuje u ludzi zdrowych [3]. Wysoką aktywność CP stwierdzono w surowicy krwi chorych z rakiem szyjki macicy i trzonu macicy [4], rakiem jajnika [4, 5] oraz rakiem piersi [6, 7].
Katepsyna D jest proteinazą aspartylową, która wchodzi w skład kaskady proteolitycznej, biorącej udział w inwazji nowotworowej i tworzeniu przerzutów [8]. Wysoką aktywność tego enzymu zaobserwowano u chorych z rakiem endometrium i rakiem szyjki macicy [9] oraz u chorych z rakiem jajnika [10].

Celem pracy było określenie aktywności prokoagulanta nowotworowego (CP) i katepsyny D w surowicy krwi i w tkankach nowotworowych pobranych od kobiet z rakiem sutka oraz w odpowiednim materiale kontrolnym, jak również próba oceny przydatności tego badania w diagnostyce onkologicznej sutka.

MATERIAŁ I METODY
Materiał badany – krew i tkanki, pobrano od kobiet z rozpoznanym histopatologicznie rakiem sutka, przed wdrożeniem chemioterapii oraz radioterapii. Krew pobierano z żyły łokciowej w sposób typowy, przed zabiegiem operacyjnym. Tkanki raka sutka i fragmenty zdrowych tkanek sąsiadujących z nowotworem pobrano w czasie zabiegu operacyjnego. Badaniem objęto 8 pacjentek w wieku od 38 do 82 lat oraz 10 kobiet zdrowych (wolontariuszek) w wieku od 21 do 33 lat, które stanowiły grupę kontrolną.
Aktywność CP w surowicy krwi oznaczano metodą Gordona i Bensona [11] i wyrażono ją czasem krzepnięcia w sekundach (s). Aktywność CP w 10-proc. homogenatach tkankowych oznaczano specyficzną dla tego enzymu metodą spektrofotometryczną wg Colucci i wsp. [12] i wyrażano ją ilością uwolnionej p-nitroaniliny w nmol pNa/ml. Aktywność katepsyny D oznaczano metodą Folina-Ciocalteau w modyfikacji miedziowej [13], wyrażając ją ilością uwolnionej tyrozyny w nM Tyr/ml/24 godz. w surowicy krwi i w nM Tyr/ml/2 godz. w przypadku badania aktywności katepsyny D w tkankach. Wyniki opracowano statystycznie przy użyciu testu Manna-Whitneya. Za poziom istotności statystycznej różnic przyjęto p<0,05.

WYNIKI
Z przeprowadzonych badań wynika, że aktywność prokoagulanta nowotworowego (CP) mierzona czasem krzepnięcia w surowicy krwi chorych na raka sutka wynosi 144±17,0 s, natomiast aktywność tego enzymu w surowicy krwi zdrowych kobiet wynosi 279,3±31,7 s. Procentowy wzrost aktywności CP w raku sutka wynosi 94 proc. (tabela). Aktywność katepsyny D mierzona przyrostem tyrozyny kwasorozpuszczalnej w surowicy krwi chorych z rakiem sutka wynosi 175,6±35,9 nM Tyr/ml/24 godz., a kobiet zdrowych 76,8±17,9 nM Tyr/ml/24 godz., co świadczy o wzroście aktywności o 129 proc. w porównaniu z grupą kontrolną. Aktywność CP w homogenatach tkanek raka sutka ma wartość 50,2±13,5 nmol pNa/ml, a w homogenatach tkanki prawidłowej 20±2,1 nmol pNa/ml. Wzrost aktywności CP wynosi w tym przypadku 151 proc. wartości uzyskanych w grupie kontrolnej. Aktywność katepsyny D w homogenatach tkanki raka sutka wynosi 299,1±28,3 nM Tyr/ml/2 godz., a w homogenatach tkanki zdrowej sutka 61,4±9,0 nM Tyr/ml/2 godz. Wzrost aktywności katepsyny D wynosi 387 proc. w porównaniu do aktywności stwierdzonej w grupie kontrolnej. We wszystkich badanych przypadkach różnice między aktywnością CP i aktywnością katepsyny D w materiale badanym i kontrolnym są istotne statystycznie (p<0,001).

OMÓWIENIE WYNIKÓW
Badane enzymy: prokoagulant nowotworowy (CP) i katepsyna D biorą udział w rozwoju choroby nowotworowej. Oznaczanie ich aktywności może mieć w onkologii dużą wartość diagnostyczno-prognostyczną.
Aktywność prokoagulacyjną wykazuje badana surowica krwi i tkanki raka sutka. Stwierdzono, że aktywność CP w surowicy krwi chorych z rakiem sutka rośnie prawie 2-krotnie, a w tkankach zmienionych nowotworowo ponaddwukrotnie w porównaniu do materiału kontrolnego. Tkanki nowotworowe wytwarzają substancje o charakterze prokoagulantów [14]. Obserwowane znaczne skrócenie czasu krzepnięcia osocza bez czynnika VII sugeruje, że badany prokoagulant nowotworowy bezpośrednio aktywuje czynnik X bez udziału czynnika VII [11]. Prokoagulant niezależny od czynnika VII i bezpośrednio aktywujący czynnik X występuje również w doświadczalnym raku płuca Lewisa, w czerniaku B16, mięsaku J.W., włókniakomięsaku mF56 [15] i raku Walkera [16]. Mielicki i wsp. [17] badali CP w nowotworze Guerin epithelioma i zaobserwowali związek między poziomem prokoagulanta nowotworowego a masą guza. Wykazano wzrost aktywności CP w okresie intensywnego wzrostu guza i spadek w fazie terminalnej.
Donatii i wsp. [18] stwierdzili w białaczkach zależność pomiędzy przebiegiem choroby a aktywnością CP. Prokoagulant nowotworowy nie był obecny w komórkach szpiku w okresie remisji, natomiast jego obecność ujawniła się w przypadku nawrotu choroby, w okresie jeszcze przed wystąpieniem objawów, co może sugerować możliwość wykorzystania badania CP do monitorowania przebiegu choroby i wczesnego ujawnienia wznowy [18, 19]. Kożuszko i wsp. [2] stwierdzili, że aktywność CP u chorych na raka przełyku, raka żołądka i raka jelita grubego po radykalnym zabiegu operacyjnym wyraźnie obniżała się, natomiast w przypadku zabiegu nieradykalnego lub stwierdzenia przerzutów nie ulegała zmianie.
Z uzyskanych danych eksperymentalnych wynika, że aktywność katepsyny D w surowicy krwi pacjentek z rakiem sutka jest przeszło 2-krotnie wyższa w porównaniu do aktywności tego enzymu w surowicy krwi zdrowych kobiet. Natomiast aktywność katepsyny D w homogenatach tkanki raka sutka jest prawie 5-krotnie wyższa od aktywności tego enzymu w homogenatach tkanki zdrowej sutka. Wyniki badania wskazują na wyraźny związek między poziomem aktywności tego enzymu a występowaniem choroby nowotworowej. Istnieje wiele danych literaturowych potwierdzających udział enzymów proteolitycznych w rozroście tkanek nowotworowych [1, 8]. Katepsyna D jest jednym z enzymów kaskady proteolitycznej, zaangażowanej w proces inwazji nowotworowej i tworzenie przerzutów [8]. Duża aktywność proteolityczna katepsyny D powoduje degradację białek substancji międzykomórkowej i błony podstawnej, a także aktywację, przez ograniczoną proteolizę, proenzymów katepsyny B i L [8]. Katepsyna D bierze udział w uwalnianiu czynników wzrostu, np. b FGF (czynnik wzrostu fibroblastów) [20]. Procesy te odgrywają istotną rolę w kancerogenezie dzięki stymulacji neoangiogenezy. Na aktywność proteolityczną katepsyny D może wpływać wiele czynników, takich jak wewnątrzkomórkowe pH, produkty metabolizmu, hormony, czynniki wzrostu, inhibitory [21]. Nie można wykluczyć, że większa aktywność katepsyny D w homogenatach tkanek raka sutka jest spowodowana przez niekontrolowane działanie jednego z tych czynników, który w procesie nowotworzenia wpływa na aktywność enzymu.

Katepsyna D jest enzymem lizosomalnym, obecnym w prawidłowych komórkach. Wydzielana jest w nadmiarze przez komórki raka sutka na skutek indukcji estrogenami [22]. Przy użyciu różnych technik (immunohistochemia, hybrydyzacja in situ, ELISA, blotting) wykazano 2-50-krotny wzrost ekspresji katepsyny D w komórkach nowotworowych sutka w porównaniu z komórkami fizjologicznej tkanki sutka lub fibroblastami [22]. Wzrost ekspresji katepsyny D zaobserwowano także w komórkach nowotworowych endometrium i szyjki macicy [10], wątrobiaka, czerniaka [23] i nowotworach innych tkanek [21].
Wyniki przeprowadzonych badań aktywności CP i katepsyny D w przypadkach raka sutka potwierdzają, że enzymy te można uważać za biochemiczne markery nowotworowe, które mogą być przydatne w diagnostyce onkologicznej.

WNIOSKI
1. Aktywność CP i katepsyny D w surowicy krwi kobiet z rakiem sutka oraz w homogenatach tkanek raka sutka jest znacznie wyższa niż w surowicy krwi kobiet zdrowych i w tkankach niezmienionych nowotworowo.
2. Oznaczania aktywności CP i katepsyny D w surowicy krwi kobiet z rakiem sutka mogą być wykorzystane w diagnostyce onkologicznej.
PIŚMIENNICTWO
1. Szymendera J, Góźdź SS. Rola krążących markerów nowotworowych w diagnostyce i monitorowaniu leczenia chorych na nowotwory. Nowotwory 1995; 45: 369-83.
2. Kożuszko B, Skrzydlewska E, Snarska J, et al. Cancer procoagulant as a marker in monitoring the therapy in cases of oesophageal, stomach and colorectal cancer. Folia Histochem Cytobiol 2001, 39, (supl. 2): 104-5.
3. Mielicki W. Biochemistry of cancer procoagulant. Haemostasis 2001; 31 (suppl. 1): 8-10.
4. Szajda SD, Jóźwik M, Wiśniewski R, Skrzydlewski Z. Aktywność prokoagulanta nowotworowego (CP) w surowicy krwi w przypadkach nowotworów narządów płciowych u kobiet. Współcz Onkol 2002; 6: 571-4.
5. Snarska J, Szajda S, Skrzydlewski Z, Kożuszko B. Ocena wartości diagnostycznej prokoagulanta nowotworowego w przypadkach raka trzustki, wątroby i jajnika. Pol Merkuriusz Lek 2003; 15: 123-4.
6. Mielicki WP, Tenderenda M, Rutkowski P, Chojnowski K. Activation of blood coagulation and the activity of cancer procoagulant in breast cancer patients. Cancer Lett 1999; 146: 61-6.
7. Rucińska M, Furman M, Skrzydlewski Z, Zaremba E. Activity of cancer procoagulant (CP) in serum of patients with cancer of lung, breast, oesophagus and colorectum. Acta Biochem Pol 1997; 44: 109-12.
8. Tomaszewski JJ, Tomaszewski T. Enzymy lityczne w proliferacji nowotworowej. Diagn Lab 1991; 27: 56-62.
9. Scambia G, Benedetti Panici P, Ferrandina G, et al. Significance of cathepsin-D expression in uterine tumours. Eur J Cancer 1995; 31: 1449-54.
10. Scambia G, Brnedetti P, Ferrandina G, et al. Cathepsin D assay in ovarian cancer: correlation with pathological features and receptors for oestrogen, progesterone and epidermal growth factor. Br J Cancer 1991; 64: 182-4.
11. Gordon SG, Benson B. Analysis of serum cancer procoagulant activity and its potential as a tumor marker. Thromb Res 1989; 56: 431-40.
12. Colucci M, Curatolo L, Donati MB, Semeraro N. Cancer cell procoagulant activity: evaluation by an amidolytic assay. Thromb Res 1980; 18: 589-95.
13. Barret AJ. Proteinases in mammalian cells in tissues. North-Holland Publishing Company, Amsterdam, New York, Oxford 1977; 46-135.
14. Żurawski P, Grygoruk M, Worowski K. Prokoagulant nabłoniaka Guerin. Acta Hemat Pol 1985; 16: 52-64.
15. Roncaglioni MC, Falanga A. Enzymatic and immunologic characterization of a cysteine proteinase procoagulant in serveray murine metasstasizing tumors. XIth International Congress on Thrombosis and Haemostasis. Thromb Hemost 1978; 58: 234.
16. Gordon SG, Sloane B, Cross B, et al. Purification and characterization of two procoagulants from Walker 256 carcinosarcoma tumors. XIth International Congress on Thrombosis and Haemostasis. Thromb Hemost 1987; 58: 235.
17. Mielicki WP, Wierzbicki R. CP in serum of rats during development of experimental epithelioma. Int J Cancer 1990; 45: 125-6.
18. Donati MB, Falanga A, Consonni R. CP in acute non lymphoid leukemia relationship of enzyme detection to disease activity. Thromb Hemost 1990; 64: 1116-9.
19. Falanga A, Alessio MG, Donati MB, Barbui T. A new procoagulant in acute leukemia. Blood 1988; 71: 870-5.
20. Ensoli B, Markham P, Kao V. Block of AIDS-Kaposi’s sarcoma (KS) cell growth, angiogenesis, and lesion formation in nude mice by antisense oligonucleotide targeting basic FGF. A novel strategy for the therapy of KS. J Clin Invest 1994; 94: 1736-46.
21. Leto G, Gebbia N, Rausa L, Tumminello FM. Cathepsin D in the malignant progression of neoplastic disease. Anticancer Res 1992;
12: 235-48.
22. Cavailles V, Rochefort H. Cathepsin D gene of human MCF 7 cells contains estrogen-responsive sequences in its 5 proximal flanking region. Biochem Biophys Res Commun 1991; 174: 816-24.
23. Maguchi S, Taniguchi N, Makita A. Elevated activity and increased mannose-6-phosphate in the carbohydrate moiety of cathepsin D from human hepatoma. Cancer Res 1988; 48: 362-67.
ADRES DO KORESPONDENCJI
dr n. med. Sławomir Dariusz Szajda
Samodzielna Pracownia Biofarmacji
Akademia Medyczna
ul. Mickiewicza 2c
15-089 Białystok
tel./faks + 48 85 748 56 07
e-mail: spoak@amb.edu.pl