Advances in allogeneic stem cell transplantation in the combined immunotherapy of the hematological malignances and solid tumors

PLURIPOTENCJALNE KOMÓRKI MACIERZYSTE


Wzrastająca liczba danych dotyczących swoistych właściwości i funkcji hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) sprawiła, że stały się one atrakcyjnym obiektem zainteresowań badaczy, nie tylko w modelu allogenicznych przeszczepów szpiku, ale również w kombinowanej immunoterapii nowotworów. Ostatnie osiągnięcia biologii molekularnej, pozwalające lepiej zrozumieć biologię HSC, szczególnie w kontekście ich wrażliwości na działanie czynników biologicznie aktywnych oraz programowanej interakcji z komórkami zrębu, pozwoliło na stworzenie naturalnego, przeciwnowotworowego modelu terapeutycznego, opartego na dostarczeniu autologicznych lub allogenicznych komórek macierzystych. Jej celem jest - poprzez szybkie odtworzenie wszystkich linii komórkowych - odwrócenie stanu immunosupresji, spowodowanego intensywną chemioterapią lub progresją nowotworu oraz nasilenie przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej poprzez zaangażowanie komórek efektorowych allotransplantu. Analiza fenotypowa wyizolowanych komórek szpiku pozwoliła na dokładne określenie antygenów powierzchniowych ekspresjonowanych na komórkach macierzystych. Aktualnie przyjmuje się, że u ludzi wczesna postać wieloliniowej komórki macierzystej charakteryzuje się: CD34+, MDR-1+, c-kit+ i CD45RO+ oraz CD38-, HLA-DR- oraz LDM- (Lieneage-Differentiation Marker) [1]. Obecnie znane są 4 źródła komórek macierzystych:

1) szpik kostny (BMSC) [2],

2) wątroba płodu [3],

3) krew obwodowa (PMSC) [4],

4) krew pępowinowa płodu [5].



Ze względu na łatwą dostępność oraz możliwość efektywnej modulacji cytokinami zastosowanie wyizolowanych komórek macierzystych z krwi obwodowej oraz szpiku kostnego ma w chwili obecnej najszersze zastosowanie kliniczne. Liczba komórek HSC w szpiku kostnym (BM) jest 16-krotnie większa niż liczba krążących HSC w krwi obwodowej. Jednak po stymulacji rekombinowanymi czynnikami wzrostu i/lub cytokinami w warunkach in vivo liczba uwalnianych komórek HSC z BM do krwi obwodowej rekompensuje te różnice. Głównymi czynnikami indukującymi proliferację i uwalnianie HSC ze szpiku są G-CSF, GM-CSF oraz Flt3. Wszystkie mogą być stosowane osobno lub w kombinacjach, jakkolwiek równoczesne podawanie rhG-CSF oraz rhGM-CSF znajduje się w zaawansowanych badaniach przedklinicznych [6], a dostarczenie ligandu Flt3 znajduje się dopiero w pierwszej fazie badań klinicznych [7]. Podanie zdrowym ochotnikom rhG-CSF przez 3 dni w dawce 12 mg/kg/dzień powoduje dynamiczny, 16-krotny wzrost liczby krążących CD34+ HSC z 3,8 x 10⁹/L do 61,9 x 10⁹/L i ponad 22,5-krotny wzrost liczby wczesnych CD34+CD38- komórek progenitorowych w krwi obwodowej.



Ostatnie doniesienia wskazują na duże zróżnicowanie biologiczne pomiędzy HSC pochodzącymi z różnych źródeł. Może to mieć istotne następstwa kliniczne w terapii allotransplantologicznej chorób rozrostowych krwi, zarówno w kontekście oceny skuteczności prowadzonej terapii (remisja), jak i czynników prognostycznych związanych z pojawieniem się powikłań (choroba przeszczep przeciw gospodarzowi - GVHD) oraz nawrotem choroby. Wieloośrodkowe, randomizowane testy kliniczne, poparte wnikliwą analizą immunologiczną przeprowadzoną u chorych, którym przeszczepiono PBSC oraz BMSC allogenicznych dawców wykazały istotny wzrost długości przeżycia bez nawrotu choroby u chorych na przewlekłą białaczkę szpikową (CML), którym podano PBSC, zwiększony efekt przeszczep praeciw guzowi (GVT) oraz wyższą dynamikę odtwarzania się poszczególnych subpopulacji limfocytów B, T oraz monocytów po całkowitej lub częściowej mieloablacji [8].



Allogeniczny przeszczep komórek macierzystych jako metoda
immunoterapii w chorobach
rozrostowych układu
krwiotwórczego

Znaczenie reakcji
przeszczep przeciw białaczce (GVL)


Allogeniczne przeszczepy komórek macierzystych były pierwotnie wykorzystywane jako metoda pozwalająca na zachowanie funkcji hematopoetycznych szpiku u chorych poddanych intensywnej chemio- i radioterapii. Początkowo efekt terapeutyczny allogenicznego przeszczepu szpiku przypisywano efektywności leczenia cytotoksycznego mającego na celu - przede wszystkim - zniszczenie wszystkich elementów hematopoetycznych włącznie z niepożądanymi klonogennymi komórkami nowotworowymi. Jednak późniejsze badania Weidena i wsp. [9] wykazały, że nie tylko intensywna chemio- lub radioterapia odgrywa istotną rolę w długotrwałej remisji większości chorób rozrostowych układu krwiotwórczego. Zaobserwowano, że wystąpienie reakcji GVHD u chorych po allogenicznym przeszczepie szpiku korelowało ze zmniejszonym ryzykiem nawrotu choroby. Zwiększone ryzyko nawrotu choroby wystąpiło u chorych na CML, którym przeszczepiono szpik allogeniczny, pozbawiony limfocytów T, jak i u tych, którzy otrzymali szpik syngeniczny, a nie HLA - dopasowany szpik allogeniczny. Powyższe spostrzeżenia doprowadziły do wniosku, że istnieje mechanizm przeciwnowotworowy, w którym istotną rolę mogą odgrywać komórki układu immunologicznego dawcy. Obecność efektu GVL i jego potencjał terapeutyczny potwierdzili w badaniach Kolb i wsp. [10], którzy wykazali, że pojedynczy, dożylny wlew limfocytów (DLI) od dawcy szpiku doprowadził do trwałej remisji u pacjentów CML z nawrotem choroby. Podobne wyniki leczenia, związane z obecnością efektu GVL uzyskano w terapii innych nowotworów układu krwiotwórczego, takich jak ostra białaczka szpikowa, przewlekła białaczka limfatyczna, chłoniaki ziarnicze i nieziarnicze oraz szpiczak mnogi [11-14] (tab.). Ze względu na możliwość wystąpienia GVHD procedura DLI musi być poprzedzona allogenicznym przeszczepem szpiku lub komórek macierzystych dawcy w celu uzyskania swoistego, mieszanego chimeryzmu, odgrywającego kluczową rolę w indukcji tolerancji potransplantacyjnej. Warunkiem niezbędnym do uzyskania swoistego chimeryzmu dawcy jest poszerzenie okna immunologicznego biorcy poprzez całkowitą lub częściową deplecję komórek szpikowych biorcy lub czasową immunosupresję. Ostatnie, przedkliniczne i kliniczne dane doświadczalne wykazały możliwość przyjęcia się przeszczepu allogenicznych komórek macierzystych dawcy bez konieczności stosowania wyniszczającej procedury ablacji szpiku biorcy. Cytometryczna analiza immunofenotypowa komórek krwi obwodowej biorców wykazała obecność wieloliniowego chimeryzmu, charakteryzującego się ekspresją HLA dawcy. Wysoki i stabilny poziom mieszanego chimeryzmu u biorców warunkuje nie tylko możliwość uniknięcia GVHD, ale tworzy platformę do wykorzystania adoptywnej immunoterapii nowotworów, opartej na DLI. Sugeruje się, że konwersja stanu mieszanego chimeryzmu w stan całkowitego chimeryzmu biorcy koreluje pozytywnie z nasileniem odpowiedzi GVL. Wśród mechanizmów immunologicznych, które mogą mieć decydujący wpływ na zahamowanie pojawienia się reakcji GVHD po DLI wymienia się:

1) uniknięcie szoku cytokinowego indukowane immunosupresją i cytoredukcją przed BMT,

2) obniżoną liczbę lub całkowity brak komórek dendrytycznych biorcy,

3) pojawienie się immunoregulatorowej subpopulacji limfocytów T w czasie DLI.



Zachęcające wyniki, jakie uzyskano w terapii chorób rozrostowych krwi stworzyły podstawę do terapeutycznego wykorzystania allogenicznego przeszczepu szpiku oraz efektu przeszczep przeciw guzowi (GVT) w nowotworach litych. Prace Moscovitcha i Slavina [15], wykorzystujące mysi model raka sutka (adenocarcinoma) wykazały, że allogeniczne komórki T były w stanie wyindukować swoistą odpowiedź przeciwnowotworową przeciwko alloantygenom mniejszego układu zgodności tkankowej, ekspresjonowanym na komórkach mysiego raka sutka. Powyższe doświadczenia wykazały możliwość wzbudzenia efektywnej odpowiedzi przeciwnowotworowej w modelu allogenicznego przeszczepu komórek macierzystych szpiku, w którym dostarczone komórki dawcy są w stanie swoiście rozpoznać i wyeliminować komórki guza ekspresjonujące alloantygeny. Przełożenie efektu GVT z modelu przedklinicznego na próby kliniczne pozostaje ciągle odległym celem. Nieliczne dane literaturowe dotyczące klinicznego wykorzystania allogenicznego przeszczepu komórek macierzystych szpiku oraz DLI w terapii nowotworów epitelialnych potwierdziły terapeutyczny potencjał odpowiedzi GVT w raku sutka oraz w raku nerki [16, 17]. Głównymi powikłaniami, związanymi z zastosowaniem omawianej strategii przeciwnowotworowej jest możliwość wystąpienia GVHD oraz związana z tym konieczność stosowania preparatów hamujących aktywność potencjalnie alloreaktywnych komórek biorcy (takich jak cyklosporyna czy mycophenolate motefil) prowadzących do niepożądanego stanu immunosupresji.



Wykorzystanie BMT/HSCT i DLI w kombinowanej immunoterapii nowotworów

Szczególne wykorzystanie BMT/HSCT oraz DLI w kombinowanej immunoterapii nowotworów związane jest z ich unikalnymi właściwościami przeciwnowotworowymi, które aktualnie są obiektem szczególnie intensywnych badań w modelach doświadczalnych i klinicznych. Nowe koncepcje terapii nowotworów zakładają wykorzystanie mechanizmów efektorowych uczulonego genetycznie modyfikowaną szczepionką komórkową (GMTV) allogenicznego dawcy w celu indukcji oraz wzmocnienia odpowiedzi przeciwnowotworowej u biorcy, któremu wcześniej przeszczepiono BM dawcy. Większość dotychczas prowadzonych prób terapii genowej nowotworów wykorzystuje GMTV, których głównym źródłem stymulacji układu immunologicznego gospodarza są komórki nowotworowe, zmienione genetycznie w ten sposób, aby mogły produkować czynniki immunoregulujące, takie jak cytokiny oraz cząsteczki kostymulujące. W związku z tym, że większość antygenów nowotworowych związanych z efektywną immunomodulacją układu odpornościowego nie została dotychczas poznana, wydaje się, że GMTV oraz BMT/HSCT mogą służyć jako idealny donor przeciwnowotworowej potencji terapeutycznej, która może być wynikiem zaangażowania swoistych mechanizmów efektorowych, obejmujących indukcję swoistych klonów komórek cytotoksycznych oraz komórek pamięci immunologicznej.



Pionierskie prace, wykorzystujące model allotransplantacji szpiku oraz DLI uczulonego GMTV dawcy w celu indukcji przeciwczerniakowej odpowiedzi immunologicznej u biorcy zostały opublikowane przez Teshima i wsp. [18]. Autorzy, wykorzystując mysi model odrzucania czerniaka założyli możliwość infekcji nietolerancji nowotworu z uczulonego GMTV dawcy szpiku oraz izolowanych limfocytów na biorcę z zaawansowanym procesem nowotworowym. W pierwszym etapie doświadczenia dokonano allotransplantacji szpiku kostnego w warunkach częściowej mieloablacji biorcy oraz modyfikacji szpiku dawcy. Celem było osiągnięcie stabilnego mieszanego chimeryzmu biorcy, który jest koniecznym warunkiem zapobiegającym pojawieniu się GVHD i zapewniającym dalsze powodzenie terapii opartej na DLI. W drugiej fazie doświadczenia szczepiono naświetlonymi, genetycznie modyfikowanymi GM-CSF komórkami czerniakowymi (B-16/GM-CSF) allogenicznego dawcę szpiku w celu inicjacji przeciwnowotworowych mechanizmów obronnych oraz indukcji fazy efektorowej odpowiedzi przeciwnowotworowej. Ostatni etap badania polegał na wstrzyknięciu komórek B16/GM-CSF biorcy szpiku oraz dożylnym podawaniu allogenicznych limfocytów dawcy w celu wzmocnienia odpowiedzi przeciwnowotworowej poprzez indukcję mechanizmu GVT (ryc.). Wyniki badań wykazały, że DLI izolowane od uczulonego dawcy nasiliły działanie terapeutyczne GMTV bez wywołania GVHD. Kluczową rolę w mechanizmie odrzucenia guza odegrały limfocyty CD4+ dawcy, które w testach in vitro wykazały nasiloną odpowiedź proliferacyjną oraz wzmożoną produkcję cytokin w mieszanych hodowlach z komórkami B16, sugerującą swoiste rozpoznanie antygenów ekspresjonowanych na komórkach czerniakowych.



Perspektywy wykorzystania HSCT w terapii nowotworów


Wyniki badań w zwierzęcym modelu odrzucania guza oraz rezultaty prób klinicznych, potwierdzające wzmocnienie efektywnej odpowiedzi przeciwnowotworowej po zastosowaniu HSCT oraz DLI stanowią podstawę do rozwoju kombinowanej immunoterapii nowotworów w przyszłości. Przyszłe badania powinny skoncentrować się na zmniejszeniu toksyczności związanej z procedurą allotransplantacji komórek macierzystych szpiku oraz na swoistym ukierunkowaniu odpowiedzi immunologicznej przeciw antygenom nowotworowym. Głównym wyzwaniem dla badaczy pozostaje wciąż zapobieganie wystąpieniu efektu GVHD, za który odpowiedzialne są limfocyty T dawcy. Nowe strategie, pozwalające na uniknięcie wystąpienia GVHD zakładają indukcję anergii potencjalnie alloreaktywnych limfocytów T poprzez zastosowanie humanizowanych przeciwciał monoklonalnych przeciwko CTLA-4, blokujących cząsteczkę kostymulującą CD28 na powierzchni komórek T [19]. Podstawowym celem naukowców pozostaje wciąż wybiórcze blokowanie powikłania potransplantacyjnego, jakim jest GVHD bez zahamowania efektu GVT. Efekt ten można nasilić również poprzez dożylne, adoptywne wlewy efektorowych limfocytów dawcy, modyfikowanych ex vivo w ten sposób, aby swoiście rozpoznawały antygeny nowotworowe. Rozwiązanie powyższych zadań wymaga zarówno dynamicznego rozwoju immunologii nowotworów, jak również wykorzystania najnowszych osiągnięć biologii molekularnej i terapii genowej.



PIŚMIENNICTWO

1. Burt RK. Clinical utility in maximizing CD34+ cell count in stem cell grafts. Stem Cells 1999; 17: 373-6.
2. Thomas ED, Storb R. Technique for human marrow grafting. Blood 1970; 36: 507-15.
3. Thomas DB. The infusion of human fetal liver cells. Stem Cells 1993; 11 Suppl 1: 66-71.
4. Korbling M, Burke P, Braine H, Elfenbein G, Santos G, Kaizer H. Successful engraftment of blood derived normal hemopoietic stem cells in chronic myelogenous leukemia. Exp Hematol 1981; 9: 684-90.
5. Gluckman E, Broxmeyer HA, Auerbach AD, et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi’s anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med 1989; 321: 1174-8.
6. Lane TA, Ho AD, Bashey A, Peterson S, Young D, Law P. Mobilization of blood-derived stem and progenitor cells in normal subjects by granulocyte-macrophage- and granulocyte-colony-stimulating factors. Transfusion 1999; 39: 39-47.
7. Lebsac ME, McKenna HJ, Hoek JA, et al. Safty of FLT-3 ligand in healthly volunteers [abstract]. Blood 1997; 90 (suppl. 1): 170.
8. Kolb HJ, Schattenberg A, Goldman JM, et al. Graft-versus-leukemia effect of donor lymphocyte transfusions in marrow grafted patients. European Group for Blood and Marrow Transplantation Working Party Chronic Leukemia. Blood 1995; 86: 2041-50.
9. Weiden PL, Flournoy N, Thomas ED, Prentice R, Fefer A, Buckner CD, Storb R. Antileukemic effect of graft-versus-host disease in human recipients of allogeneic-marrow grafts. N Engl J Med 1979; 300: 1068-73.
10. Kolb HJ, Mittermuller J, Clemm C, Holler E, Ledderose G, Brehm G, Heim M, Wilmanns W. Donor leukocyte transfusions for treatment of recurrent chronic myelogenous leukemia in marrow transplant patients. Blood 1990; 76 (12): 2462-5.
11. van Besien KW, de Lima M, Giralt SA, et al. Management of lymphoma recurrence after allogeneic transplantation: the relevance of graft-versus-lymphoma effect. Bone Marrow Transplant 1997; 19: 977-82.
12. Lokhorst HM, Schattenberg A, Cornelissen JJ, van Oers MH, Fibbe W, Russell I, Donk NW, Verdonck LF. Donor lymphocyte infusions for relapsed multiple myeloma after allogeneic stem-cell transplantation: predictive factors for response and long-term outcome. J Clin Oncol 2000; 18: 3031-7.
13. Heslop HE, Brenner MK, Rooney CM. Donor T cells to treat EBV-associated lymphoma. N Engl J Med 1994; 331: 679-80.
14. Khouri IF, Keating M, Korbling M, et al. Transplant-lite: induction of graft-versus-malignancy using fludarabine-based nonablative chemotherapy and allogeneic blood progenitor-cell transplantation as treatment for lymphoid malignancies. J Clin Oncol 1998; 16: 2817-24.
15. Moscovitch M, Slavin S. Anti-tumor effects of allogeneic bone marrow transplantation in (NZB X NZW) F1 hybrids with spontaneous lymphosarcoma. J Immunol 1984; 132: 997-1000.
16. Eibl B, Schwaighofer H, Nachbaur D, et al. Evidence for a graft-versus-tumor effect in a patient treated with marrow ablative chemotherapy and allogeneic bone marrow transplantation for breast cancer. Blood 1996; 88: 1501-8.
17. Childs R, Chernoff A, Contentin N, et al. Regression of metastatic renal-cell carcinoma after nonmyeloablative allogeneic peripheral-blood stem-cell transplantation. N Engl J Med 2000; 343: 750-8.
18. Teshima T, Liu C, Lowler KP, Dranoff G, Ferrara JL. Donor leukocyte infusion from immunized donors increases tumor vaccine efficacy after allogeneic bone marrow transplantation. Cancer Res 2002; 62: 796-800.
19. Guinan EC, Boussiotis VA, Neuberg D, Brennan LL, Hirano N, Nadler LM, Gribben JG. Transplantation of anergic histoincompatible bone marrow allografts. N Engl J Med 1999; 340: 1704-14.


Wykaz skrótów używanych w pracy

BM - bone marrow - szpik kostny

BMSC - bone marrow stem cells - komórki macierzyste szpiku kostnego

BMT - bone marrow transplantation - przeszczep szpiku kostnego

CML - chronic myelogenous leukemia - przewlekła białaczka szpikowa

DLI - donor lymphocyte infusion - dożylny wlew limfocytów

EBV - Epstein-Barr Virus - wirus Epsteina-Barra

GMTV - gene modified tumor vaccines - genetycznie modyfikowane szczepionki komórkowe

GVHD - graft versus host disease - choroba przeszczep przeciw gospodarzowi

GVL - graft versus leukemia - reakcja przeszczep przeciw białaczce

GVT - graft versus tumor - reakcja przeszczep przeciw guzowi

HSC - hematopoietic stem cell - komórka macierzysta szpiku

HSCT - hematopoietic stem cells transplantation - przeszczep komórek macierzystych szpiku

PBSC - peripheral blood stem cells - komórki macierzyste krwi obwodowej



ADRES DO KORESPONDENCJI

prof. dr hab. med. Andrzej Mackiewicz

Zakład Immunologii Nowotworów

Wielkopolskie Centrum Onkologii

ul. Garbary 15

61-866 Poznań

e-mail: amac@amu.edu.pl