Cathepsin D activity in cases of uterine leiomyoma

WSTĘP
Katepsyna D jest proteinazą lizosomalną, która pełni w organizmie wiele różnych funkcji, m.in. bierze udział w trawieniu białek, dokonuje ograniczonej proteolizy biologicznie czynnych peptydów, enzymów i hormonów [1]. Jako enzym kaskady proteolitycznej czynnie uczestniczy w procesie inwazji nowotworowej poprzez miejscowe naciekanie i tworzenie przerzutów [2]. Katepsyna D jest zdolna do degradacji macierzy międzykomórkowej [3] oraz do aktywacji innych proteaz (katepsyny B, katepsyny L i kolagenazy), odpowiedzialnych za progresję guzów nowotworowych [4]. Katepsyna D może być uznana za jeden z markerów nowotworowych. Wzrost jej aktywności stwierdzono w przypadku raka piersi [5], raka narządów rodnych kobiety [6, 7] i raka przewodu pokarmowego [8]. Katepsyna D w wyniku choroby nowotworowej przechodzi do krwi, moczu, płynu mózgowo-rdzeniowego, przez co oznaczanie aktywności tego enzymu nabiera znaczenia diagnostycznego. Dotychczas brak jest doniesień o badaniu aktywności katepsyny D w przypadkach mięśniaków macicy.
Celem pracy było określenie aktywności katepsyny D w homogenatach mięśniaków macicy oraz tkanek prawidłowych, jak również w surowicy krwi pacjentek z mięśniakami macicy i kobiet zdrowych.

MATERIAŁ I METODY
Materiał badany stanowiły tkanki mięśniaków macicy oraz tkanki zdrowego mięśnia macicy sąsiadujące z nowotworem, pobrane w czasie chirurgicznego zabiegu usunięcia mięśniaków macicy, potwierdzone badaniem histopatologicznym, pobrane od 18 kobiet (w wieku od 38 do 61 lat). Uzyskane tkanki cięto na drobne fragmenty, zawieszano w oziębionym 0,25 M roztworze sacharozy zawierającym 0,2 proc. tritonu X-100 w stosunku wagowo-objętościowym 1: 9 i homogenizowano. W czasie homogenizacji przygotowane do badania próby poddano chłodzeniu lodem. Homogenaty doprowadzano do pH 5,0 przy użyciu 0,1 M HCl, następnie poddawano wirowaniu w temp. 4oC. Pozbawiony struktur komórkowych płyn nadosadowy doprowadzano do pH 4,0 przy użyciu 0,1 M HCl. W tak przygotowanych 10-proc. homogenatach badano aktywność katepsyny D. Krew do badań od kobiet z mięśniakami macicy oraz od 18 zdrowych kobiet – wolontariuszek (w wieku od 22 do 41 lat) pobierano z żyły łokciowej w sposób typowy.
Aktywność katepsyny D, zarówno w homogenatach badanych tkanek, jak i w surowicy krwi, badano metodą Folina-Ciocalteau w modyfikacji miedziowej [9] i wyrażono ją ilością uwolnionej tyrozyny w nM Tyr/ml/2 godz. Analizę statystyczną wykonano testem Manna-Whitneya.

WYNIKI
Wyniki badania aktywności katepsyny D w homogenatach mięśniaków macicy i zdrowych tkanek mięśnia macicy oraz w surowicy krwi przedstawia tab. 1. Z przeprowadzonych badań wynika, że aktywność katepsyny D, mierzona przyrostem tyrozyny, w homogenatach mięśniaków macicy wynosiła od 104 do 227 nM Tyr/ml/2 godz. (średnio 151,5±36,2 nM Tyr/ml/2 godz.), a w homogenatach zdrowej tkanki mięśnia macicy od 58 do 115 nM Tyr/ml/2 godz. (średnio 80,8±17,8 nM Tyr/ml/2 godz.). Aktywność badanego enzymu w surowicy krwi kobiet z mięśniakami macicy wyniosła od 26 do 70 nM Tyr/ml/2 godz. (średnio 40,5±13,5 nM Tyr/ml/2 godz.), a w surowicy krwi kobiet zdrowych od 15 do 54 nM Tyr/ml/2 godz. (średnio 26,5±11,8 nM Tyr/ml/2 godz.). Różnice w aktywności katepsyny D między grupami badanymi a odpowiednimi grupami kontrolnymi są istotne statystycznie (p<0,001).

OMÓWIENIE WYNIKÓW
Przeprowadzone badania wskazują, że w przypadkach mięśniaków macicy aktywność katepsyny D, zarówno w homogenatach badanych tkanek nowotworowych, jak i w surowicy krwi, przewyższa w sposób znamienny statystycznie aktywność enzymu, w odpowiednim materiale kontrolnym. Aktywność katepsyny D w tkankach i w surowicy krwi chorych z mięśniakami macicy jest prawie 2-krotnie wyższa niż w odpowiednich tkankach prawidłowych i w surowicy krwi kobiet zdrowych.
Literaturowe dane eksperymentalne świadczą o udziale enzymów proteolitycznych w rozroście tkanek nowotworowych [10]. Sylven i Bois- -Svensson [11] wyrażają pogląd, że nowotwory bardziej złośliwe charakteryzują się wyższą aktywnością kwaśnych proteaz niż nowotwory łagodne. Zaobserwowano wysoką aktywność katepsyny D u kobiet z rakiem sutka [5], rakiem jajnika [6], rakiem endometrium, rakiem szyjki macicy [7] oraz w innych nowotworach [8, 12]. Wyższa aktywność wewnątrzkomórkowych proteaz w tkankach nowotworowych niż w tkankach, z których się one wywodzą, może nasuwać przypuszczenie o przyspieszonym katabolizmie białek nowotworowych [3]. Chen i wsp. [13] uważają, że zarówno w stanach fizjologicznych, jak i w patologicznych, w tym również w powstawaniu przerzutów nowotworowych, proteolityczne procesy degradacyjne zachodzą w miejscach, gdzie powierzchnia komórki kontaktuje się z macierzą międzykomórkową.
Na aktywność proteolityczną katepsyny D wpływ może mieć wiele czynników, takich jak wewnątrzkomórkowe pH, produkty metabolizmu, hormony, czynniki wzrostu oraz inhibitory [14]. Nie można wykluczyć, że stwierdzona wyższa aktywność katepsyny D w homogenatach mięśniaków macicy, niż w homogenatach tkanki prawidłowej, spowodowana jest jednym z wymienionych czynników, który w czasie wzrostu mięśniaka macicy może wpływać na aktywność tego enzymu.
Jak wynika z przeprowadzonych badań, różnica między aktywnością katepsyny D w surowicy krwi kobiet z mięśniakami macicy, a jej aktywnością w surowicy osób zdrowych jest mniejsza niż w przypadku tkanek nowotworowych. Być może stwierdzenie mniejszego wzrostu aktywności katepsyny D w surowicy krwi jest spowodowane maskowaniem jej przez inhibitory lub inne czynniki [8].
Przypuszcza się, że wydzielana w nadmiarze przez komórki nowotworowe katepsyna D może aktywować proenzymy innych proteaz, uruchamiając kaskadę proteolityczną, która przyczynia się do inwazji procesu nowotworowego i tworzenia przerzutów [2].
Uzyskane wyniki badania sugerują, że oznaczanie aktywności katepsyny D w przypadkach mięśniaków macicy może być wykorzystane w diagnostyce ginekologicznej.

WNIOSKI
1. Aktywność katepsyny D w homogenatach mięśniaków macicy jest znacznie wyższa niż w homogenatach zdrowej tkanki mięśniowej macicy.
2. Aktywność katepsyny D w surowicy kobiet z mięśniakami macicy przewyższa aktywność tego enzymu w surowicy krwi kobiet zdrowych.
3. Oznaczanie aktywności katepsyny D w przypadkach mięśniaków macicy może być wykorzystane do celów diagnostycznych.
PIŚMIENNICTWO
1. Worowski K, Ostrowska H. Katepsyna D. Post Biol Kom 1980; 7: 119-47.
2. Tomaszewski JJ, Tomaszewski T. Enzymy lityczne w proliferacji nowotworowej. Diagn Lab 1991; 27: 56-62.
3. Briozzo P, Morisset M, Capony F, et al. In vitro degradation of extracellular matrix with Mr 52,000 cathepsin D secreted by breast cancer cells. Cancer Res 1988; 48: 3688-92.
4. Watanabe M, Higashi T, Watanabe A, et al. Cathepsin B and L activities in gastric cancer tissue: correlation with histological findings. Biochem Med Metabol Biol 1989; 42: 21-9.
5. Bevilacqua P, Boracchi P, Gasparini G. Prognostic indicators for early stage breast carcinoma. Part II: Value cathepsin D expression, detected by immunocytochemistry. A multiparametric study. Int J Oncol 1994; 5: 559-601.
6. Scambia G, Brnedetti P, Ferrandina G, et al. Cathepsin D assay in ovarian cancer: correlation with pathological features and receptors for oestrogen, progesterone and epidermal growth factor. Br J Cancer 1991; 64: 182-4.
7. Scambia G, Benedetti Panici P, Ferrandina G, et al. Significance of cathepsin-D expression in uterine tumours. Eur J Cancer 1995; 31: 1449-54.
8. Kiluk M, Skrzydlewski Z, Kiluk A i wsp. Aktywność katepsyny D w niektórych nowotworach przewodu pokarmowego. Pol Merkuriusz Lek 1997; 11: 307-8.
9. Barret AJ. Proteinases in mammalian cells and tissues. North-Holland Publishing Company, Amsterdam, New York, Oxford 1977: 46-135.
10. Mylonas I, Makovitzky J, Richter DU, i wsp. Cathepsin D expression in normal, hyperplastic and malignant endometrial tissue: an immunohistochemical analysis. Acta Histochem 2003; 105: 245-252.
11. Sylven B, Bois-Svennson J. On the chemical pathology of intestinal fluid. Proteolytic activities in transplanted mouse tumors. Cancer Res 1965; 25: 458-68.
12. Droller MJ. Expression of cathepsin D in urothelial carcinoma of the urinary bladder: an immunohistochemical study including correlations with extracellular matrix components, CD 44, p53, Rb,
c-erb B-2 and the proliferation indices. J Uro 2003; 170: 671-672.
13. Chen WT, Olden K, Bernard BA, et al. Expression of transformation-associated protease (s) that degrade fibronectin at cell contact sites. J Cell Biol 1984; 98: 1546-55.
14. Leto G, Gebbia N, Rausa L, et al. Cathepsin D in the malignant progression of neoplastic disease. Anticancer Res 1982; 12: 235-48.
ADRES DO KORESPONDENCJI
dr med. Kamil Michalak
SP WSZ Białystok
Oddział Położnictwa
15-089 Białystok
ul. Warszawska 15
e-mail: stanlek54m@wp.pl