Cathepsin D activity in the blood serum and urine in patients with colonic adenocarcinoma

Wstęp
Katepsyna D [EC 3.4.23.5] jest proteinazą aspartylową, która występuje w lizosomach oraz w połączeniach z błonami w erytrocytach i endosomach makrofagów [1, 2]. Aktywność katepsyny D jest regulowana przez wewnątrzkomórkowe pH, produkty metabolizmu, hormony, czynniki wzrostu i inhibitory [3]. Katepsyna D współuczestniczy w powstaniu stanów zapalnych, niedokrwienia mięśnia sercowego, chorób wątroby, dystrofii mięśniowej i stwardnienia rozsianego [3–5]. Wzrost ekspresji tej proteazy zaobserwowano także w chorobie nowotworowej [6–10].
Celem niniejszej pracy jest ocena przydatności diagnostycznej oznaczania aktywności katepsyny D w surowicy krwi i moczu chorych na gruczolakoraka jelita grubego.

Materiał i metody
Materiał do badań pobierano, przed wdrożeniem chemioterapii oraz radioterapii, w I Klinice Chirurgii Ogólnej i Endokrynologicznej AM w Białymstoku, od 9 chorych (6 kobiet i 3 mężczyzn) w wieku 56–81 lat (średnia wieku 71±9,1 lat) z rozpoznanym histopatologicznie gruczolakorakiem (adenocarcinoma) jelita grubego ze stopniem złośliwości G2, w stopniu zaawansowania pT2 stwierdzonym u 3 chorych, a pT3 u 6 chorych. Grupę kontrolną stanowiło 6 osób zdrowych (3 kobiety i 3 mężczyzn) w wieku 28–40 lat (średnia wieku 36±5,2 lat). Krew pobierano w godzinach rannych z żyły łokciowej od pacjentów będących na czczo, do probówki bez antykoagulanta i odstawiano na godzinę w temperaturze pokojowej do skrzepnięcia. Surowicę otrzymano przez odwirowanie krwi po skrzepnięciu (4000 x g w ciągu 10 min). Mocz do badań otrzymano z środkowego strumienia rannej porcji i odwirowano (4000 x g w ciągu 10 min).
Aktywność katepsyny D oznaczano w surowicy krwi i moczu. Substratem była 6-% hemoglobina denaturowana kwasem solnym. Reakcję przeprowadzono w pH 3,5, temp. 37°C, w ciągu 6 godz., a następnie ją hamowano 10-% roztworem kwasu trichlorooctowego (TCA). Miarą aktywności katepsyny D była ilość uwolnionej tyrozyny kwasorozpuszczalnej oznaczanej metodą Folina-Ciocalteau w modyfikacji miedziowej [11].
Stężenie białka w moczu oznaczano metodą Lowry i wsp. [12] i odczytywano z krzywej wzorcowej sporządzonej z 0,03% liofilizowanej albuminy wołowej firmy POCH Gliwice, Polska.
Oceny statystycznej wyników dokonano testem Manna-Whitneya. Za poziom istotności statystycznej różnic przyjęto p<0,05.

Wyniki
Aktywność katepsyny D w surowicy krwi chorych na gruczolakoraka jelita grubego wynosiła 138,04±32,91 nmol/ml/6 godz. i była istotnie statystycznie wyższa (p<0,003) w porównaniu z aktywnością katepsyny D w surowicy krwi osób zdrowych 87,07±21,53 nmol/ml/6 godz. (ryc. 1.). Brak istotnych statystycznie różnic (p=0,426) stwierdzono w badaniu aktywności katepsyny D w moczu, która w gruczolakoraku jelita grubego wynosiła 268,25±224,86 nmol/mg białka/6 godz., a u osób zdrowych 407,77±315,88 nmol/mg białka/6 godz. (ryc. 2.) oraz między stężeniem białka w moczu (p=0,139) chorych na gruczolakorakoraka jelita grubego (0,144±0,144 mg/ml) i osób zdrowych (0,144±0,016 nmol/mg białka/6 godz.) (ryc. 3.).

Omówienie wyników
Komórki nowotworowe charakteryzują się niekontrolowaną proliferacją [13]. Proteazy lizosomalne, w tym katepsyna D, pochodzące z komórek proliferujących nowotworu, biorą udział w degradacji elementów tkanki łącznej otaczających komórki. Protezy uczestniczą w penetracji guza w tkankach, migracji komórek nowotworowych i ich umiejscowieniu w ogniskach przerzutowych [4]. Obecność katepsyny D stwierdzono zarówno w tkankach prawidłowych, jak i w nowotworowych [9, 10, 14]. Dotychczasowe badania pozwalają na stwierdzenie, że aktywność katepsyny D w surowicy krwi zależy od lokalizacji narządowej nowotworu. Obserwowany jest istotny statystycznie wzrost aktywności katepsyny D w surowicy krwi chorych z powierzchownym rakiem pęcherza moczowego w porównaniu z aktywnością tego enzymu w surowicy krwi osób zdrowych. Stwierdzono zależność między aktywnością katepsyny D a typem histologicznym, stopniem złośliwości oraz stopniem klinicznego zaawansowania powierzchownego raka pęcherza moczowego [8]. Istotnych statystycznie różnic nie stwierdzono natomiast w aktywności katepsyny D w surowicy krwi u chorych z rakiem przełyku [6] i rakiem trzustki [7], gdzie ekspresja badanego enzymu u chorych na nowotwory była zbliżona do wartości prawidłowych.
Z uzyskanych danych eksperymentalnych wynika, że aktywność katepsyny D w surowicy krwi chorych na gruczolakoraka jelita grubego jest ponad półtora razy wyższa od aktywności katepsyny D w surowicy krwi osób zdrowych. Aktywność katepsyny D w moczu chorych na gruczolakoraka jelita grubego wskazuje na obniżenie aktywności tego enzymu u chorych z gruczolakorakiem jelita grubego w porównaniu z aktywnością w moczu osób zdrowych. Brak jest jednak istotnych statystycznie różnic w aktywności katepsyny D między porównywanymi grupami.
Z dotychczasowych doniesień wynika, że badanie w surowicy krwi aktywności katepsyny D może znaleźć zastosowanie w rozpoznaniu gruczolakoraka jelita grubego oraz powierzchownego raka pęcherza moczowego.

Wniosek
1. Gruczolakorak jelita grubego wykazuje podwyższenie aktywności katepsyny D w surowicy krwi.

Piśmiennictwo
1. Worowski K, Ostrowska H. Katepsyna D. Post Biol Kom 1980; 7: 119-1947.
2. Diment S, Leech MS, Stahl PD. Cathepsin D is membrane-associated in macrophage endosomes. J Biol Chem 1988; 263: 6901-7.
3. Leto G, Gebbia N, Rausa L, Tumminello FM. Cathepsin D in the malignant progression of neoplastic diseases (review). Anticancer Res 1992; 12: 235-40.
4. Tomaszewski JJ, Tomaszewski T. Enzymy lityczne w proliferacji nowotworowej. Diagn Lab 1991; 27: 56-62.
5. Bever CT Jr, Morgan KD, Whitaker JN. Cathepsin D activity in human peripheral blood mononuclear leukocytes. Inflammation 1989; 13: 309-16.
6. Szajda SD, Kiluk M, Wiśniewski R, Skrzydlewski Z. Wartość diagnostyczna markerów nowotworowych: CEA, AFP, katepsyny D i prokoagulanta nowotworowego (CP) w przypadkach raka płuca i przełyku. Współcz Onkol 2002; 6: 9-11.
7. Szajda SD, Snarska J, Chlabicz M, Mroczko B, Skrzydlewski Z. Ocena przydatności badania niektórych markerów nowotworowych w diagnostyce raka trzustki. Współcz Onkol 2004; 8: 338-41.
8. Szajda SD, Darewicz B, Kudelski J, Chlabicz M, Domel T, Chabielska E, Skrzydlewski Z. Aktywność nowotworowego prokoagulanta i katepsyny D w surowicy chorych na raka pęcherza moczowego. Pol Merk Lek 2005; 18: 651-3.
9. Szajda SD, Jankowski M, Zalewska B, Kożuszko B, Gabrylewski W, Skrzydlewski Z. Aktywność prokoagulanta nowotworowego i katepsyny D w przypadkach raka sutka. Współcz Onkol 2004; 8: 132-5.
10. Szajda SD, Zalewska B, Michalak K, Skrzydlewski Z. Aktywność katepsyny D u kobiet w przypadkach mięśniaków macicy. Współcz Onkol 2004; 8: 266-8.
11. Barrett AJ. Cathepsin D and other carboxylproteinases. In: Barrett AJ (ed). Proteinases in mammalian cells and tissues. North-Holland Publishing Company, Amsterdam, New York, Oxford 1977; 240-3.
12. Kokot F. Metody badań laboratoryjnych stosowanych w klinice. PZWL, Warszawa 1969; 130.
13. Rubin E, Faber JL. Neoplasia. In: Pathology. Rubin E, Fabrer JL (red.). Wyd. JB Lippincott Company, Philadelphia 1994.
14. von Ardenne M. Lysosomal enzymes in pericellular environment: a factor in tumor regression. J Natl Cancer Inst 1973; 51: 313-14.

Adres do korespondencji
dr med. Sławomir D. Szajda
Zakład Biochemii Farmaceutycznej
Akademia Medyczna
ul. Mickiewicza 2
15-230 Białystok 8
tel. +48 85 748 56 90, +48 85 748 56 91
e-mail: spoak@amb.edu.pl