An attempt to explain unsuccessful specification of autoantibody assessment in ANA-positive sera basing on analysis of particular antibody specificities present in circulating immune complexes

Wstęp

W układowych chorobach tkanki łącznej występuje wiele zaburzeń odporności prowadzących do występowania tzw. autoprzeciwciał, czyli przeciwciał skierowanych przeciwko wielu antygenom własnoustrojowym. Szczególnie istotne znaczenie diagnostyczne mają przeciwciała skierowane przeciwko różnym składnikom białkowym i niebiałkowym jądra komórkowego (antygeny jądrowe – dsDNA, ssDNA, histon, DNP, antygen Scl-70, białka centromerowe) oraz antygenom białkowym występującym w cytoplazmie, organellach komórkowych lub w błonie komórkowej [1, 2]. Przeciwciała te, określane zbiorczo jako przeciwciała przeciwjądrowe (PPJ; anti-nuclear antibodies – ANA), włączono do kryteriów diagnostycznych wielu chorób reumatycznych z uwagi na ich markerowy charakter, związek z aktywnością procesu chorobowego oraz swoiste korelacje niektórych z nich z określonymi objawami klinicznymi [1, 3, 4].

Lista metod służących do oznaczania ANA jest niezwykle bogata, choć w ostatnich 10–15 latach obserwuje się tendencję w kierunku stosowania metod immunoenzymatycznych, takich jak ELISA, Western-blotting czy DOT-blotting . Widać też wyraźne zróżnicowanie tych metod – na skriningowe, tj. służące jedynie ustaleniu obecności przeciwciał ANA, i na metody pozwalające ustalić swoistość ANA występujących w surowicy danego chorego [5, 6].

Jednak w ok. 10–25% przypadków surowic pobranych od pacjetów ze schorzeniami reumatycznymi, w których wynik ANA jest dodatni, nie udaje się oznaczyć swoistości auto­przeciwciał i wtedy należy analizować przyczyny seronegatywności. Szczególnym problemem są surowice ANA-dodatnie, w których metodami klasycznymi stosowanymi w serodiagnostyce autoprzeciwciał nie udaje się ustalić swoistości autoprzeciwciała markerowego (np. anty-U1snRNP, anty-Sm, anty-Ro i La itp.). Jedną z przyczyn seronegatywności tych surowic może być kompleksemia.

Kompleksemia występująca w surowicach pacjentów z układowymi chorobami tkanki łącznej jest zwykle skojarzona z fazami zaostrzenia procesu podstawowego, np. w toczniu, gdzie towarzyszy hipokomplementemii, podwyższeniu wskaźników ostrej fazy i wskaźników aktywności choroby oraz zmianom poziomu i awidności autoprzeciwciał [7, 8]. Mało uwagi poświęca się temu, że procesowi zaostrzenia choroby zwykle mogą towarzyszyć dwa zjawiska. Pierwsze z nich to uwalnianie z zajętych narządów lub tkanek do krążenia autoantygenów, drugie – związanie autoprzeciwciał obecnych w krążących kompleksach immunologicznych (KKI). Pierwszy fenomen jest niedocenianym na ogół wskaźnikiem aktywnego procesu destrukcji narządów lub tkanek, a drugi prowadzi do neutralizacji krążących autoprzeciwciał i obniżenia ich miana w surowicach.

Celem pracy była analiza KKI pod kątem ewentualnej obecności autoprzeciwciał markerowych w trudnych diagnostycznie surowicach ANA-dodatnich, w przypadku których klasycznymi metodami stosowanymi w serodiagnostyce autoprzeciwciał nie udało się ustalić swoistości przeciwciał ANA.

Materiał i metody

Badania dotyczyły 588 surowic przekazanych do Zakładu Mikrobiologii i Serologii Instytutu Reumatologii w celu oznaczenia miana i typu ANA oraz ustalenia swoistości ANA. Surowice pochodziły z klinik i polikliniki IR.

W surowicach oznaczano następujące parametry:

• miano i typ świecenia ANA metodą IIF – na slajdach z utrwalonymi komórkami Hep-2 (firmy Euroimmun, Niemcy) oraz metodą Colorzyme (firmy Immunovision, USA),

• poziom autoprzeciwciał (w zależności od typu świecenia ANA metodami ELISA i Western-blotting na teście ANA-ENA RecomLine firmy Biomedica-Poland Sp. z o.o.),

• poziom KKI metodą immunoenzymatyczną (C1q – CIC kit) firmy Quidel (USA),

• frakcję wzbogaconą w KKI uzyskiwano metodą wytrącania glikolem polietylowym o ciężarze cząsteczkowym 6000 (PEG-6000) wg Świerczyńskiej i wsp. [9],

• frakcję  z osadów po PEG-6000 uzyskiwano przez wytrącanie nasyconym siarczanem amonu w pH 3,5 (stosowanym do dysocjacji KKI) wg metody własnej [10, 11],

• białko we frakcji  i osadach PEG-6000 oznaczano spektrofotometrycznie metodą wg Kalckara [12].

Wyniki

W surowicach przysłanych do diagnostyki przeciwciał ANA oznaczano miano i typ świecenia, a następnie – postępując zgodnie ze standardową procedurą – wykonywano typowanie swoistości testem Western-blotting lub typowanie wskazanych przez klinicystę swoistości charakterystycznych (przeciwciał markerowych) dla danej jednostki chorobowej. Test Western-blotting służy do oznaczania następujących autoprzeciwciał: anty-U1snRNP, anty-Sm, anty-Ro (SS-A), anty-La (SS-B) anty-Rib-P, anty-PCNA, anty-CENP-B, anty-Scl-70, anty-Jo-I oraz anty-Hp i dsDNA. Wyżej opisaną standardową procedurę wykonano dla 588 surowic. W przypadku 69 surowic (co stanowi 11,7%) przy dodatnim wyniku ANA (rzędu  1/160) oznaczanie poszczególnych swoistości autoprzeciwciał dało wynik negatywny. W niewielkim odsetku (ok. 19%) spośród tych 69 surowic udało się ustalić swoistość autoprzeciwciał (zgodną z typem świecenia ANA) przy znacznym obniżeniu (z 1/100 do 1/10) roboczego rozcieńczenia surowicy.

Być może wyżej opisaną procedurę, tj. proporcjonalne do miana ANA obniżenie rozcieńczenia roboczego surowic dla metody Western-blotting, można będzie stosować obligatoryjnie w przypadkach, w których podstawowe znaczenie ma wykazanie obecności autoprzeciwciała markerowego, a jego poziom ma na tym etapie znaczenie drugorzędne.

Nie rozstrzygnięto, czy w przypadku tych trudnych surowic mamy do czynienia z rzadkim przeciwciałem, dla którego brakuje antygenu w zastosowanym teście Western-blotting, czy też autoprzeciwciało jest związane w KKI, ale zachowało zdolność wiązania się z antygenami, co najczęściej dotyczy przeciwciał klasy IgM, ale także pozostałych klas – IgG i IgA. W tym celu wykonano oznaczanie swoistości przeciwciał ANA metodą Western-blotting. Wiadomo z doświadczeń z seronegatywnymi surowicami chorych podejrzanych o boreliozę, że osady po PEG-6000 oraz frakcje  z surowic seronegatywnych dla przeciwciał anty-Borrelia burgdorferi dają dodatnie wyniki w teście potwierdzenia Western-blotting stosowanym w przypadku pogłębienia diagnostyki boreliozy ([13] oraz praca przygotowywana do druku).

Na rycinie 1 przedstawiono wyniki testu Western-blotting wykonanego na osadach PEG-6000 w zestawieniu z wynikami uzyskiwanymi na pełnych surowicach (metodą standardową), a na rycinie 2 pokazano częstość występowania autoprzeciwciał w osadach PEG.

W ok. 84% surowic uzyskano wyniki pozytywne testów Western-blotting, przy czym w znacznym odsetku (60/69, tj. 87%) uzyskano więcej niż jedną linię (dla różnych swoistości). Wskazuje to, że prawdopodobnie jest to mieszanina KKI o różnym składzie (różna swoistość autoprzeciwciał oraz różne autoantygeny?). Wśród 133 swoistości przeciwciał oznaczanych w 69 surowicach (przeciętnie ok. 2 na surowicę) przeciwciała dla antygenów chromatynowych (anty-Hp i anty-dsDNA) stanowiły blisko 50% (73 oznaczonych swoistości) wszystkich oznaczanych swoistości, natomiast przeciwciała dla antygenów ENA – 32% (43 oznaczonych swoistości), a pozostałe 14 oznaczanych surowic to tylko 10,5%. Przeciwciała dla antygenów chromatynowych (stanowiące 56% wszystkich oznaczanych swoistości) będą przedmiotem dalszych badań, gdyż prawdopodobnie mamy tu do czynienia ze zjawiskiem krzyżowej reaktywności przeciwciał (anty-ssDNA i dsDNA, anty-PL, anty-NuHi, anty-histon i ewentualnie anty-HMG i anty- -uQ). Chcąc wstępnie zróżnicować i scharakteryzować budowę KKI, określono za pomocą surowic anty-Fc i anty-(Fab)2-IgG orientację i lokalizację autoprzeciwciał występujących w danym typie KKI – wykrywanych metodą Western-blotting. Bazowano na opublikowanych danych dotyczących klas i podklas autoprzeciwciał o określonych swoistościach [14]. Wyniki wyżej opisanej analizy dla wybranych surowic przedstawiono na rycinie 3 oraz w tabeli I.

W większości badanych tą metodą surowic (72%) uzyskano pozytywną reakcję, tj. osłabienie linii po dodaniu do osadów PEG surowic anty-F(ab)2-IgG oraz tylko w ok. 30% osłabienie reakcji po surowicach anty-Fc-IgG. Efekt był niezależny od swoistości wykrywanego autoprzeciwciała, co może wskazywać na powierzchniową lokalizację tych autoprzeciwciał. Zróżnicowanie efektów wyżej opisanego eksperymentu dla poszczególnych swoistości nie zostało wykonane dla wszystkich surowic z powodu braku materiału, ale było na tyle charakterys­tyczne, że pozwalało stwierdzić, iż mamy do czynienia z więcej niż jednym typem KKI.

Dyskusja

Z masywną kompleksemią mamy do czynienia na ogół w aktywnej fazie choroby, gdy dochodzi do destrukcji komórek, ewentualnie tkanek zajętych narządów, np. w przebiegu zaostrzenia tocznia rumieniowatego układowego, gdzie jednocześnie ze wzrostem OB, obniżeniem poziomu dopełniacza, zwiększa się także poziom KKI. W KKI związane są autoprzeciwciała [7, 15]. Może to paradoksalnie doprowadzić do sytuacji, w której w okresie aktywności choroby będzie obniżał się poziom autoprzeciwciał markerowych do wartości nieoznaczalnej w stosowanych standardowo metodach.

Jeśli weźmiemy pod uwagę częstość występowania podstawowych autoprzeciwciał włączonych do kryteriów klasyfikacyjnych poszczególnych jednostek chorobowych (opublikowanych w ciągu ostatnich 20 lat) oraz przeanalizujemy możliwe przyczyny seronegatywności surowic w układowych chorobach tkanki łącznej, to hipoteza ta nabiera realnych podstaw [16]. Przykładowo w toczniu rumieniowatym układowym jedno z dwóch podstawowych autoprzeciwciał markerowych (poza przeciwciałami dla dsDNA) – przeciwciała anty-Sm występują w zaledwie 15–30% przypadków tocznia [1, 2, 17]. Także inne autoprzeciwciała markerowe występują w zdiagnozowanych przypadkach układowych chorób tkanki łącznej, np. przeciwciała anty-Scl-70 w ok. 30%, przeciwciała anty-Jo-I w > 20% i przeciwciała anty-Pm- -Scl w > 10%. Nawet w przypadku autoprzeciwciał o stosunkowo wysokiej częstości występowania, np. przeciwciał anty-SSA, anty-CCP, margines seronegatywności sięga 20–30% [18, 19]. Część pacjentów z powodu restrykcji odpowiedzi przeciwciałowej zależnej od haplotypu HLA nie syntetyzuje określonych swoistości, ponieważ jest niewrażliwa na określone sekwencje peptydowe prezentowane komórkom układu odpornościowego [20, 21]. Te 12% surowic (ANA-dodatnich o nieustalonej swoistości) staje się bardzo ważne w indywidualnych przypadkach chorych, u których pozwalają one ustalić rozpoznanie i wdrożyć właściwe leczenie. Jest to ważne również z powodu konieczności przeprowadzenia szybkiej diagnostyki (zarówno klinicznej, jak i laboratoryjnej).

Słuszność założenia, że przynajmniej część autoprzeciwciał markerowych występuje w postaci związanej w KKI, jeśli nie liczyć autoprzeciwciał związanych w tkankach, potwierdza wysoki odsetek występowania KKI w surowicach ANA(+) o nieustalonej swoistości oraz koreluje z mianami ANA tych surowic.

Wyniki oznaczania swoistości wykonane testami Western-blotting i ELISA wykonane na osadach PEG-6000 w pełni potwierdziły słuszność naszych oczekiwań opartych na doświadczeniach z seronegatywnymi surowicami (od chorych z podejrzeniem boreliozy), że osady po PEG-6000 oraz frakcje  z surowic seronegatywnych dla przeciwciał anty-Borrelia burgdorferi dają dodatnie wyniki w teście potwierdzenia Western-blotting stosowanym w przypadku podejrzenia o boreliozę [13].

Uzyskane wyniki pozwalają na konstatację (w pełni uzasadnioną), że w krążeniu występuje więcej niż jeden typ KKI, gdyż swoistości pojawiające się w osadach PEG-6000 z surowic nie mogą być zlokalizowane na jednej cząsteczce antygenu. Przykładowo w niektórych osadach PEG pojawiają się swoistości, takie jak anty-histon, anty-SSA i anty-SSB, anty-U1snRNP. Może to mieć znaczenie w przypadku zespołu nakładania, w którym występuje nakładanie się objawów klinicznych różnych chorób układowych oraz obecne są różne swoistości autoprzeciwciał [22].

Autorzy chcą także ustalić, czy pojawienie się aktywności przeciwciałowej po precypitacji glikolem polietylenowym o masie cząsteczkowej 6000 Da jest efektem prostego zgęszczenia frakcji KKI po wytrąceniu, czy jest spowodowane zmianą konformacji poszczególnych białek wchodzących w skład KKI – będzie to przedmiotem dalszych badań w Zakładzie Mikrobiologii i Serologii IR.

Wszystkie wyżej opisane doświadczenia mające na celu wyjaśnienie przyczyn seronegatywności powinny być uzupełnione analizą składu antygenowego metodami antygenowo-swoistymi, tj. takimi, które pozwalają ustalić rzeczywisty skład antygenów występujących w KKI [23]. Potwierdziłoby to w sposób oczywisty wiarygodność zaproponowanych przez autorów oznaczeń. Dodatkowo ze względu na prostotę metodyczną tego podejścia do analizy składu KKI, umożliwiłoby wprowadzenie tej metodyki do diagnozowania „trudnych” z punktu widzenia analitycznego surowic, co też będzie przedmiotem dalszych badań.



Praca częściowo sfinansowana z grantu PBZ-KBN-119/PO/05/2005.

Piśmiennictwo

 1. von Mühlen CA, Tan EM. Autoantibodies in the diagnosis of systemic rheumatic diseases. Semin Arthritis Rheum 1995; 24: 323-358.  

2. Manual of Biological Markers of Disease. van Venrooij WJ, Maini RN (eds.). Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, Boston, London 1994.  

3. Nielen MMJ, van Schaardenburg D, Reesink HW, et al. Specific autoantibodies precede the symptoms of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2004; 50: 380.  

4. Vencovský J, Machácek S, Sedová L, et al. Autoantibodies can be prognostic markers of an erosive disease in early rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 2003; 62: 427.  

5. Ząbek J. Podstawowe zasady racjonalnej serodiagnostyki autoprzeciwciał markerowych w układowych chorobach tkanki łącznej. Reumatologia 2005; 43: 335-340.  

6. Reis J. Współczesne metody szybkiej indykacji i immunodiagnostyki rozpuszczalnych antygenów bakteryjnych. Post Mikrobiol 1989; 28: 17.  

7. Ząbek J, Pyka J, Krzewska I i wsp. Autoantibodies in systemic lupus erythematosus (SLE). Annales Universitatis Mariae Curie-Skłodowska Lublin – Polonia 2008; 43: 18-24.  

8. Haugbro K, Nossent JC, Winkler T, et al. Anti-dsDNA antibodies and diseases classification in antinuclear antibody positive patients: The role of analytical diversity. Ann Rheum Dis 2004; 63: 386-394.  

9. Świerczyńska Z, Rdułtowska H, Woźniczko-Orłowska G, Ząbek J. A New metod for the detection of circulating immune complexes by immunoelectrophoretic analysis. I. Studies on DNA-anti-DNA immune complexes prepared in vitro. Reumatologia 1979; 17: 269-277.

10. Gazda A, Ząbek J, Romicka AM i wsp. Występowanie przeciwciał antykardiolipinowych w krążących kompleksach immunologicznych u dzieci z młodzieńczym toczniem rumieniowatym i młodzieńczym idiopatycznym zapaleniem stawów. Pol Arch Med Wewn 2008; 118: 10-14.

11. Jabłońska J, Ząbek J, Kozłowska J, Krzewska I. Obecność przeciw­ciał antykardiolipinowych w krioglobulinach izolowanych z surowic pacjentów zakażonych wirusem zapalenia wątroby typu C. Pol Arch Med Wewn 2008; 118: 20-24.

12. Lisowski J. Metody fizykochemiczne stosowane w immunologii. W: Immunologia praktyczna. Ślopek S (red.). PZWL, Warszawa 1970.

13. Legatowicz-Koprowska M, Gziut I, Jezierski J i wsp. Borelioza serca – gorzka lekcja czy spóźniony sukces diagnostyczny? Opis przypadku. Kardiologia Polska 2007; 65: 1228-1230.

14. Youinou P, Dueymes M, Shoenfeld Y. Autoantibody subclasses. In: Autoantibodies. Shoenfeld Y, Gershwin ME, Meroni PL (eds.). Elsevier. Amsterdam, Boston, Heidelberg, London, New York, Oxford, Paris, San Diego, San Francisco, Singapore, Sydney, Tokyo. Second Edition 2007; 61-67.

15. Smeenk R, Hylkema M. Detection of antibodies to DNA: a technical assessment. Mol Biol Reports 1992; 17: 71.

16. Ząbek J. Przyczyny niepowodzeń w identyfikacji swoistości autoprzeciwciał ANA w surowicach pobranych od pacjentów z układowymi chorobami tkanki łącznej. Reumatologia 2004; 42: 416-426.

17. Puszczewicz M. Przeciwciała przeciwjądrowe w diagnostyce różnicowej chorób układowych. Reumatologia 1998; 36: 30-41.

18. Szmyrka-Kaczmarek M, Dziemianko I, Szechiński J. Przeciw­ciała antycytrulinowe w reumatoidalnym zapaleniu stawów – znaczenie diagnostyczne i prognostyczne. Pol Arch Med Wewn 2003; 110: 915.

19. Ożóg-Sulikowska A. Przeciwciała przeciwjądrowe w układo­wych chorobach tkanki łącznej. Nowa Klinika. Reumatologia 2003; 8: 1144-1152.

20. Wańkowicz A. Zjawiska autoimmunologiczne. W: Immunologia. Jakóbisiak M (red.). PWN, Warszawa 1995; 499.

21. Welcker M. Clinical features of systemic lupus erythematosus. Elias Journal 2001; 2: 3-5.

22. Pernice W, Sedlacek HH. Antigen-specific detection of soluble immune complexes by a solid phase specific antibody system. J Immunol Methods 1979; 28: 33-40.

23. Agnello V. Immune complexes assays in rheumatic diseases. Human Pathol 1983; 14: 343-349.