Analysis of microsatellite instability markers in women with endometrial cancer

Wstęp
Zaburzenia w sekwencjach mikrosatelitarnych wykryto w genomie komórek rakowych, w tym raka trzonu macicy. Za zmiany te, określane mianem niestabilności sekwencji mikrosatelitarnych (MSI – ang. microsatellite instability), jest odpowiedzialny uogólniony defekt mechanizmów odpowiadających za wierność replikacji DNA lub za poreplikacyjną naprawę DNA [1]. Sekwencje mikrosatelitarne są szczególnie podatne na błędy w replikacji i zaburzenia wykryte w ich obrębie są markerem zahamowania czynności genów mutatorowych. Do tej pory wykryto mutacje w następujących genach: MSH2, MLH1, PMS1 i PMS2. Najczęściej występują one w genie MLH1.
Dane literaturowe wskazują, że MSI odgrywa ważną rolę w rozwoju różnych nowotworów [2–4] w tym raka endometrium [5–8].
Rak endometrium należy do najczęstszych nowotworów złośliwych rozwijających się w trzonie macicy [9]. Rak błony śluzowej trzonu macicy występuje w 80% w okresie pomenopauzalnym. Tylko 5% zachorowań na ten nowotwór notuje się przed 40. rokiem życia. Nowotwór ten zajmuje 4. miejsce wśród zachorowań na raka u kobiet [10]. Rocznie odnotowuje się na całym świecie ok. 150 tys. nowych zachorowań na raka endometrium.
Niestabilność mikrosatelitarna (MSI) po raz pierwszy została wykryta u rodzin z zespołem HNPCC (ang. Hereditary Nonpyloposis Colorectal Cancer) [11, 12]. Za jej powstawanie odpowiedzialny jest defekt w genach naprawczych. W 90% przypadków HNPCC mutacje germinalne mają miejsce w genach MSH2 i MLH1 [13]. Jednym z częściej występujących nowotworów w koincydencji z rakiem jelita grubego jest rak endometrium. W genomie jego komórek dochodzi często do MSI pod wpływem uszkodzeń w genach mutatorowych [14, 15]. Poza tym wiadomo, że niestabilność mikrosatelitarną spotyka się w 9–45% sporadycznych przypadków raka trzonu macicy [16, 17]. W prezentowanej pracy przeprowadzono analizę genetyczną niestabilności mikrosatelitarnych u chorych na raka endometrium. W celu analizy MSI zastosowano panel 5 markerów (wg kryterium Bethesda) [18]; 2 jednonukleotydowe powtórzenia (BAT25 i BAT26) oraz 3 dwunukleotydowe powtórzenia (D2S123, D5S346 i D17S250).
Materiały i metody
Pacjentki
Badaniom poddano kobiety (n=10) w wieku od 55 do 82 lat (średnia wieku ±SD 68,8±6,68 lat), u których stwierdzono raka endometrium. Materiał do badań w postaci próbek krwi pobranej na cytrynian oraz wycinków z guza endometrium został uzyskany od każdej pacjentki. Wszystkie nowotwory sklasyfikowano wg kryteriów ustalonych przez FIGO (ang. International Federation of Gynaecology and Obstetrics).
Grupa kontrolna
Jako kontrolę zastosowano krew uzyskaną od kobiet (n=25), u których nie stwierdzono występowania choroby nowotworowej.
Izolacja DNA
DNA był izolowany z zastosowaniem komercyjnie dostępnego zestawu QIAmp Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Niemcy) zgodnie z zaleceniami producenta.
Analiza niestabilności mikrosatelitarnych
Próbki genomowego DNA uzyskane od kobiet z rakiem endometrium i kontrolnego DNA zostały poddane analizie z zastosowaniem panelu 5 markerów mikrosatelitarnych dla jednonukleotydowych i dwunukleotydowych sekwencji powtórzonych: BAT 25 (locus 4q12), BAT 26 (2p16), D2S123 (2p16–p21), D5S346 (5q21–q22) and D17S250 (17q11.2–q12) [18]. Wszystkie sekwencje starterów uzyskano z komputerowej bazy danych Genome DataBase (GDB, at: http://www.gdb.org). Warunki reakcji PCR podano w tab. I.
Reakcja PCR została przeprowadzona w termocyklerze Perkin-Elmer/Gene Amp, PCR System 2400. Mieszanina reakcyjna (25 µl) obejmowała 5 ng genomowego DNA, 0,2 µmol każdego startera (ARK Scientific GmbH Biosystems, Darmstad, Niemcy), 2,5 mM MgCl2, 1 mM dNTP i 1 U Taq Polymerase (Qiagen GmbH, Hilden, Niemcy). Produkt PCR podlegał elektroforezie denaturującej w 8% żelu poliakryloamidowym i był wizualizowany przez barwienie srebrem. Pacjentki, których próbki DNA wykazywały allele, które nie były obecne w kontrolnym DNA, były klasyfikowane jako MSI pozytywne.
Analiza statystyczna
W celu analizy statystycznej zastosowano test Χ², p<0,05 traktowano jako wynik statystycznie znaczący.
Wyniki
Próbka była klasyfikowana jako przypadek o wysokim stopniu niestabilności mikrosatelitarnej [ang. MSI-high, (MSI-H)] jeśli 2 lub więcej markerów wykazywało niestabilność, natomiast o niskim stopniu niestabilności mikrosatelitarnej [ang. MSI-low (MSI-L)] jeśli 1 marker wykazywał niestabilność w porównaniu z kontrolnym DNA. Próbki, w których nie stwierdzono niestabilności mikrosatelitarnej definiowano jako MSI stabilne [ang. MS-stable (MSS)].
Przebadano 10 pacjentek z rakiem endometrium oraz 25 kobiet z grupy kontrolnej. Nie stwierdzono różnic w niestabilności mikrosatelitarnej pomiędzy próbkami DNA uzyskanymi z guza a próbkami DNA z krwi pochodzącymi od tej samej pacjentki. 4 z 10 pacjentek (40%) wykazywało niestabilność mikrosatelitarną przy zastosowaniu pełnego panelu 5 markerów; 3 pacjentki zostały zaklasyfikowane jako przypadki o wysokim stopniu niestabilności mikrosatelitarnej, a 1 pacjentka (10%) jako przypadek niskiego stopnia niestabilności (tab. II).
Wykazano, że obecność MSI u chorych na raka endometrium jest wyższa niż w grupie kontrolnej (ryc. 1.) (p<0,05).
Dyskusja
Proces powstawania raka endometrium jest wynikiem akumulacji wielu zmian genetycznych [19]. Wiadomo, że w procesie nowotworzenia biorą udział 3 główne grupy genów onkogeny, geny supresorowe oraz geny mutatorowe (geny kodujące enzymy, kontrolujące wierność replikacji i naprawy DNA). W warunkach prawidłowych podlegają one kontrolowanej ekspresji podczas embriogenezy, różnicowania i proliferacji komórek, natomiast ich mutacje prowadzą do zaburzenia tych procesów i w konsekwencji do transformacji nowotworowej.
Defekty w funkcjonowaniu genów mutatorowych prowadzą do powstawania niestabilności mikrosatelitarnych, które przyczyniają się do rozwoju raka endometrium [20–24].
Badania wskazują, że MSI może być markerem tendencji do powstawania błędów replikacyjnych w nowotworach [8, 22, 25]. Uszkodzenia w genach naprawczych, takich jak MLH1, MSH2 i MSH6 powodują błędy replikacyjne, ujawniające się jako niestabilność markerów mikrosatelitarnych. Wykazano, że utrata ekspresji genu MLH1 jest częstym zjawiskiem w raku endometrium [26–28]. W nowotworach endometrium o wysokim stopniu niestabilności mikrosatelitarnej stwierdzono utratę ekspresji genu MLH1, w przeciwieństwie do nowotworów z niskim stopniem MSI. Ponieważ patologiczna ekspresja genu MLH1 nie występuje we wszystkich nowotworach z pozytywnym indeksem MSI, sugeruje to, że w tym procesie mogą uczestniczyć inne geny naprawcze [28].
W prezentowanej pracy wykazano związek pomiędzy występowaniem raka endometrium a obecnością MSI. 40% chorych wykazywało MSI, w przeciwieństwie do 12% kontroli.
Badania genetyczne wskazują, że zmiany genetyczne, takie jak mutacje p53, utrata heterozygotyczności LOH, czy zaburzenia amplifikacji genów K-ras, PTEN oraz Her2/neu są wykrywane w raku endometrium [29]. Nasze badania potwierdziły fakt, że MSI może występować jako częste zjawisko w przypadku tego nowotworu.
Wysoka częstość MSI u kobiet z rakiem endometrium dostarcza motywu do jej zastosowania jako markera wykrywania grupy wysokiego ryzyka wystąpienia raka endometrium. Kolejne badania, które obejmą większą grupę badaną są konieczne do potwierdzenia tego przypuszczenia.
Praca powstała w oparciu o grant nr 6P05E12220 uzyskany z Komitetu Badań Naukowych (KBN).
Piśmiennictwo
1. Lothe RA. Microsatellite instability in human solid tumours. Mol Med Today 1997; 3, 61-8.
2. Benachenhou N, Guiral S, Gorska-Flipot I, et al. Frequent loss of heterozygosity at the DNA mismatch-repair loci hMLH1 and hMSH3 in sporadic breast cancer. Br J Cancer 1999; 79: 1012-7.
3. Thibodeau SN, Bren G, Schaid D. Microsatellite instability in cancer of the proximal colon. Science 1993; 260: 816-9.
4. Pinto M, Oliveira C, Machado JC, et al. MSI-L gastric carcinomas share the hMLH1 methylation status of MSI-H carcinomas but not their clinicopathological profile. Lab Invest 2000; 80: 1915-23.
5. Chadwick RB, Pyatt RE, Niemann TH, et al. Hereditary and somatic DNA mismatch repair gene mutations in sporadic endometrial carcinoma. J Med Genet 2001; 38: 461-6.
6. Furlan D, Casati B, Cerutti R, et al. Genetic progression in sporadic endometrial and gastrointestinal cancers with high microsatellite instability. J Pathol 2002; 197: 603-9.
7. Muresu R, Sini MC, Cossu A, et al. Chromosomal abnormalities and microsatellite instability in sporadic endometrial cancer. Eur J Cancer 2002; 38: 1802-9.
8. Stefansson I, Akslen LA, MacDonald N, et al. Loss of hMSH2 and hMSH6 expression is frequent in sporadic endometrial carcinomas with microsatellite instability: a population-based study. Clin Cancer Res 2002; 8: 138-43.
9. Rose PG. Endometrial carcinoma. N Engl J Med 1996; 335: 610-9.
10. Bremond A, Bataillard A, Thomas L. Cancer of the endometrium. French National Federation of Cancer (FNCLCC). Br J Cancer 2001; 84: 31-6.
11. Ionov Y, Peinado MA, Malkhosyan S, et al. Ubiquitous somatic mutations in simple repeated sequences reveal a new mechanism for colonic carcinogenesis. Nature 1993; 363: 558-61.
12. Peltomaki P, Lothe RA, Aaltonen LA. Microsatellite instability is associated with tumours that characterize the hereditary non-polyposis colorectal carcinoma syndrome. Cancer Res 1993; 53: 5853-5.
13. Peltomaki P, Vasen HF. Mutations predisposing to hereditary nonpyloposis colorectal cancer: database and results of a collaborative study. The International Collaborative Group on Hereditary Nonpyloposis Colorectal Cancer. Gastroenterology 1997; 113: 1146-58.
14. Muresu R, Sini MC, Cossu A. Chromosomal abnormalities and microsatellite instability in sporadic endometrial cancer. Eur J Cancer 2002; 38; 1802-9.
15. Orbo A, Eklo K, Kopp M. A semiautomated test for microsatellite instability and its significance for the prognosis of sporadic endometrial cancer in northern Norway. Int J Gynecol Pathol 2002; 21: 27-33.
16. Caduff RF, Johnston CM, Svoboda-Newman M. Clinical and pathological significance of microsatellite instability in sporadic endometrial carcinoma. Am J Pathol 1996; 148: 1671-8.
17. Gurin CC, Federici MG, Kang L. Causes and consequences of microsatellite instability in endometrial carcinoma. Cancer Res 1999; 59: 462-6.
18. Boland CR, Thibodeau SN, Hamilton SR. National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res 1998; 58: 5248-5257.
19. Mutter GL. Diagnosis of premalignant endometrial disease. J Clin Pathol 2002; 55: 326-31.
20. Arzimanoglou II, Gilbert F, Barber HRK. Microsatellite instability in human solid tumors. Cancer 1998; 82: 1808-20.
21. Katabuchi H, van Rees B, Lambers AR, et al. Mutations in DNA mismatch repair genes are not responsible for microsatellite instability in most sporadic endometrial carcinomas. Cancer Res 1995; 55: 5556-60.
22. Parc YR, Halling KC, Burgart LJ, et al. Microsatellite instability and hMLH1/hMSH2 expression in young endometrial carcinoma patients: associations with family history and histopathology. Int J Cancer 2000; 86: 60-6.
23. Liu VW, Yang HJ, Wang Y, et al. High frequency of mitochondrial genome instability in human endometrial carcinomas. Br J Cancer 2003; 89: 697-701.
24. Hardisson D, Moreno-Bueno G, Sanchez L, et al. Tissue microarray immunohistochemical expression analysis of mismatch repair (hMLH1 and hMSH2 genes) in endometrial carcinoma and atypical endometrial hyperplasia: relationship with microsatellite instability. Mod Pathol 2003; 16: 1148-58.
25. Ilyas M, Straub J, Tomlinson IP, et al. Genetic pathways in colorectal and other cancers. Eur J Cancer 1999; 35: 1986-2002.
26. Gurin CC, Federici MG, Kang L, et al. Causes and consequences of microsatellite instability in endometrial carcinoma. Cancer Res 1999; 59: 462-6.
27. Esteller M, Levine R, Baylin SB, et al. MLH1 promoter hypermethylation is associated with the microsatellite instability phenotype in sporadic endometrial carcinomas. Oncogene 1998; 17: 2413-7.
28. Salvesen HB, MacDonald N, Ryan A, et al. Methylation of hMLH1 in a population-based series of endometrial carcinoma. Clin Cancer Res 2000; 6: 3607-13.
29. Lax SF. Molecular genetic pathways in various types of endometrial carcinoma: from a phenotypical to a molecular-based classification. Virchows Arch 2004; 4: 213-23.


Adres do korespondencji
dr n. med. Hanna Romanowicz-Makowska
Pracownia Biologii Molekularnej
Zakład Patomorfologii Klinicznej
Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki
ul. Rzgowska 281/289
93-338 Łódź
tel. +48 42 271 12 80