Angiogenesis of ovarian neoplasms

Wstęp


Nowotwory złośliwe jajnika stanowią nadal jedną z głównych przyczyn umieralności kobiet. Pomimo znacznego postępu w medycynie, patomechanizm rozrostu nowotworowego guzów jajnika nie jest dobrze poznany. W progresji guzów oraz w powstawaniu odległych przerzutów istotną rolę zdaje się odgrywać neoangiogeneza [1].
Wraz ze wzrostem każdej tkanki wzrasta liczba naczyń krwionośnych dostarczających do niej składniki odżywcze i odprowadzających zbędne produkty przemiany materii. W warunkach fizjologicznych liczba i wielkość naczyń włosowatych przenikających wszystkie tkanki nie zwiększa się, ponieważ komórki wyściełającego je śródbłonka nie ulegają podziałom. W pewnych sytuacjach, np. w jajniku po owulacji, w błonie śluzowej macicy po menstruacji lub po uszkodzeniu tkanki, naczynia zaczynają rozrastać się. Proces ten nazywany jest angiogenezą.
Neoangiogeneza zachodzi tylko w warunkach patologicznych i jest inicjowana przez komórki nowotworowe, które pojawiwszy się w zdrowej tkance, nie są początkowo zdolne do pobudzenia neoangiogenezy. Kiedy kilka milionów komórek utworzy guz, a komórki położone centralnie coraz bardziej oddalają się od komórki macierzystej i dochodzącej do niej włośniczki, wówczas guz przestaje rosnąć i osiąga stan równowagi, w którym liczba umierających komórek odpowiada liczbie komórek proliferujących. Jest to wczesne stadium rozwoju raka. Komórki nowotworowe w hodowli mogą namnażać się przy braku unaczynienia tylko do guza o średnicy 1–2 mm. Dopiero kiedy nowe naczynia dostarczą składników odżywczych – masa guza powiększa się. Neoangiogeneza jest więc przełomowym etapem w rozwoju guza. Znalezienie przyczyn wyzwalających proces neoangiogenezy i sposobów jej przerwania może mieć istotne znaczenie w procesie hamowania rozrostu nowotworowego.
Aktywność procesu neoangiogenezy zależy od równowagi pomiędzy jej regulatorami – aktywatorami i inhibitorami. Jedną z metod pomiaru aktywności neoangiogennej jest pomiar wewnątrzguzowej gęstości mikronaczyń – IMD [2].
Wiele niezależnych, retrospektywnych badań wykazuje, że stopień nasilenia neoangiogenezy w początkowych stadiach litych, złośliwych guzów (np. rak piersi) jest znaczącym czynnikiem rokowniczym [3, 4].


Cel pracy


Celem pracy jest ocena znaczenia ilościowej neoangiogenezy w diagnostyce i różnicowaniu guzów nowotworowych jajnika.


Materiał i metody


Grupę badaną stanowiły 42 pacjentki w wieku 29–84 lat (–c±56,5) operowane w I Klinice Ginekologii i Onkologii Ginekologicznej Instytutu Ginekologii i Położnictwa (IGiP) Uniwersytetu Medycznego w Łodzi z powodu rozpoznanego raka jajnika. Grupę kontrolną, do której odnoszono uzyskane wyniki oznaczeń stanowiło 10 pacjentek w wieku 34–89 lat (–c±61,5 roku) operowanych z powodu guzów granicznych przydatków.
Analiza histopatologiczna przeprowadzana była w Pracowni Histopatologicznej IGiP w Łodzi w sposób rutynowy: fragmenty tkankowe po uprzednim utrwaleniu w 10% formalinie były zatapiane w parafinie, a następnie z bloczków parafinowych wykonywane były skrawki, które barwiono hematoksyliną i eozyną. Rozpoznanie histopatologiczne było dokonywane wg kryteriów WHO. Oceniano również stopień zaawansowania klinicznego choroby wg FIGO oraz stopień zróżnicowania komórkowego (grading).
Ilościowa neoangiogeneza w preparatach wykonanych z pobranych podczas operacji fragmentów guza przeprowadzana była w Zakładzie Patologii Nowotworów Katedry Onkologii UM w Łodzi. Do badania tego wykorzystywano bloczki parafinowe, z których wykonywano preparaty histopatologiczne barwione metodą immunohistochemiczną z wykorzystaniem przeciwciał monoklonalnych CD-31 (wg katalogu Dako) firmy Dako. Skrawki parafinowe po uprzednim trawieniu trypsyną barwione były metodą strepawidynowo-biotynową.
Ocenę liczby naczyń rozpoczynano od miejsc o największej liczbie naczyń (tzw. hot spots), co identyfikowano poprzez przeglądanie preparatu pod małym powiększeniem. Właściwą ocenę przeprowadzano z użyciem powiększenia 400 razy w kolejnych polach widzenia. Zliczanie naczyń prowadzono niezależnie przez dwóch patologów, a w przypadkach niezgodności wyników większej niż 15%, preparat oceniano ponownie. Podczas zliczania nowotworzących się naczyń brano pod uwagę każdą zabarwioną komórkę lub też grupę komórek, z widocznym światłem lub bez niego. Za liczbę naczyń brano ich średnią liczbę przypadającą na jedno pole widzenia pod powiększeniem 400 razy w mikroskopie świetlnym.
Dla celów wnioskowania statystycznego przyjęto poziom istotności 0,05. Wartości średnie badanych parametrów porównano przy użyciu uogólnionego modelu liniowego McCulacha i Nedlera, w którym jako rozkład zmiennej zależnej przyjęto rozkład g oraz rozkład z logarytmiczną funkcją łączącą. Zmienne dyskretne wprowadzone zostały w postaci k-1 (k – liczba kategorii) zmiennych 0–1 z wybraną jedną kategorią odniesienia. W przypadku zależności pomiędzy dwoma zmiennymi ciągłymi, badano istotność trendu liniowego. Wszystkie obliczenia wykonano przy użyciu pakietu statystycznego STATA 6.


Wyniki


Ocenę nowotworzenia naczyń krwionośnych (IMD) w tkankach guza przedstawiono w tab. I. Wewnątrzguzowa gęstość mikronaczyń osiągnęła wyższą wartość w nowotworach złośliwych (średnio 23,9 w polu widzenia) w porównaniu do grupy nowotworów granicznych (p<0,001).
Zbadano zależność IMD od wieku chorych na raka jajnika. Średnia IMD u chorych na raka jajnika w wieku 29–45 lat wynosiła 25,8±14,9, u kobiet w wieku 46–55 lat: 23,5±12,7, a u pacjentek w wieku 56–84 lat: 22,6±10,0 (ns).
Oceniono zależność pomiędzy wielkością guza nowotworowego u chorych na raka jajnika, a średnią IMD. IMD w guzach o średnicy mniejszej od 10 cm wynosiła 18,8±7,5, w guzach większych od 10 cm: 27,4±14,6, natomiast w przypadkach stwierdzonej rozsianej choroby nowotworowej: 22,8±11,1 (ns). Średnia IMD obliczona łącznie dla stopni I i II zaawansowania klinicznego raka jajnika (wczesna postać nowotworu) wynosiła 20,6±12,3, a odpowiednia wartość obliczona dla stopni III i IV (zaawansowana choroba nowotworowa) wynosiła 25,1 ±12,0 (ns).
Poddano analizie wpływ zróżnicowania komórkowego raka jajnika na średnią IMD. W rakach dobrze zróżnicowanych (G1) IMD wynosiła 22,2±17,0, w nowotworach średnio zróżnicowanych (G2): 31,5±14,1, natomiast w słabo zróżnicowanych rakach jajnika (G3): 21,2±9,8 (ns).
Oceniono zależność pomiędzy typem histologicznym raka jajnika, a średnią IMD. IMD w surowiczych rakach jajnika wynosiła 24,9±9,9, w rakach śluzowych: 21,1±13,5, w rakach endometrialnych: 29,1±15,7, w rakach litych: 16,4±3,5, a w innych postaciach raka jajnika: 20,4±9,3 (ns).


Dyskusja


Jednym z krytycznych czynników w rozwoju guzów litych jest ich zaopatrzenie w składniki odżywcze, wymiana gazowa i odprowadzanie metabolitów, odbywające się za pośrednictwem naczyń krwionośnych. Możliwości rozwoju guza są limitowane przez unaczynienie tkanki, a dalsze etapy jego rozwoju zależą od wytworzenia sieci nowych naczyń krwionośnych. Powszechnie uważa się, że bez procesu neowaskularyzacji guzy lite nie są w stanie przekroczyć objętości 2–3 mm3 [5]. Już na bardzo wczesnym etapie wzrostu guza zachodzą zmiany w lokalnym układzie naczyniowym pod wpływem nowotworu i są one bezwzględnie konieczne dla dalszego jego rozwoju. Również bardzo wcześnie dochodzi do lokalnego wydzielania czynników antyangiogennych, mających wpływ na proliferację i przeżywalność komórek nowotworowych in vivo, dlatego wytworzyły one szereg mechanizmów, które w sposób bezpośredni lub pośredni stymulują neoangiogenezę w swoim sąsiedztwie. Wydzielają one cytokiny, które parakrynnie stymulują komórki śródbłonka do proliferacji i przestrzennej organizacji w nowe naczynia. Komórki nowotworowe zdolne są do indukcji stanu zapalnego, a pod wpływem jego mediatorów substancje proangiogenne produkowane są przez makrofagi, neutrofile, limfocyty, fibroblasty oraz komórki śródbłonka [5].
Badania neoangiogenezy prowadzone są od lat 60. XX wieku, ale dopiero w latach 80. nastąpił gwałtowny wzrost zainteresowania tym procesem, niezależnie w kilku ośrodkach badawczych. Było to spowodowane odkryciem i zsekwencjonowaniem kilku czynników wzrostowych oraz inhibitorów neoangiogenezy. W latach 90. XX wieku zsyntetyzowano farmakologiczne inhibitory neoangiogenezy zdolne do tłumienia całej kaskady neowaskularyzacji w warunkach in vitro.
Od czasu kiedy Folkman [5] odkrył, że wzrost litych guzów jest zależny od angiogenezy, trwają intensywne badania nad tym procesem, jego mechanizmami i regulatorami. Obecnie znanych jest już wiele czynników angio- i antyangiogennych.
Proces neoangiogenezy jest niezwykle złożony i zależny od wielu komponentów komórkowych, pozakomórkowych i humoralnych. Wśród komórek wpływających na neoangiogenezę należy wymienić również komórki mięśniówki gładkiej otaczającej naczynia i makrofagi, które są głównym źródłem zarówno cytokin prozapalnych, w tym TNF, jak też niektórych czynników wzrostowych dla komórek śródbłonka [6].
Hata i wsp. [7] oceniali neoangiogenezę w tkankach guzów nowotworowych jajników dwiema metodami: metodą immunohistochemiczną – IMD oraz ultrasonograficzną z zastosowaniem techniki kolorowego Dopplera. W prezentowanych badaniach, opartych o metody immunohistochemiczne stwierdzono największe nasilenie wewnątrzguzowej gęstości mikronaczyń (IMD) w zmianach o charakterze złośliwym. W dużych guzach proces neoangiogenezy, jak wynika z piśmiennictwa [8] może ulegać samoograniczeniu. W skrajnych przypadkach prowadzi to do obumierania znacznych jego obszarów. Kubiak i in. [9] stwierdzili, iż nasilenie neoangiogenezy różni się w poszczególnych obszarach guza. W badanych przez niego guzach sutka największe nasilenie neoangiogenezy stwierdza się na granicy guza i tkanki niezmienionej.
Stępień i in. [10] badali neoangiogenezę w hormonozależnych guzach gruczołów dokrewnych metodą immunohistochemiczną. Stwierdzili, iż ilość mikronaczyń zależy wprost proporcjonalnie od wielkości zmiany pierwotnej. W naszych badaniach korelacji takiej nie zaobserwowano. Być może w guzach jajnika hormonalnie czynnych, które nie były przedmiotem badań, podobna zależność miałaby miejsce.
Przedstawione powyżej wyniki badań wydają się potwierdzać opinie cytowanych wyżej autorów i w niedalekiej przyszłości mogą przyczynić się do udoskonalenia diagnostyki i terapii nowotworów.


Wnioski


1. Nasilenie neoangiogenezy w nowotworach złośliwych jest istotnie wyższe, niż w zmianach granicznych.
2. Nasilenie neoangiogenezy w guzach złośliwych jajnika nie zależy od stopnia zaawansowania klinicznego, ani stopnia zróżnicowania komórek guza.
3. Nie stwierdzono zależności między nasileniem neoangiogenezy, a typem histopatologicznym raka jajnika.





Piśmiennictwo


1. Miyadera K, Sumizawa T, Haraguchi M, et al. Role of thymidine phosphorylase activity in the angiogenic effect of platelet-derived endothelial cell growth factor/thymidine phosphorylase. Cancer Res 1995; 55: 1687-93.
2. Gasparini G. Angiogenesis research up to 1996. A commentary on the state of art and suggestions for future studies. Eur J Cancer 1997; 14: 2379-84.
3. Folkman J. New perspectives in clinical oncology from angiogenesis research Eur J Cancer 1996; 14: 2534-9.
4. Toi M, Taniguchi T, Yamamoto Y, et al. Clinical significance of determination of angiogenic factors. Eur J Cancer 1996; 32: 2513-9.
5. Folkman J. What is the evidence that tumors are angiogenesis depend? J Natl Cancer Inst. 1990; 82: 4-11.
6. Arras M, Ito WD, Scholz D, et al. The role of TNF in angiogenesis. Clin Invest 1998; 101: 40-7.
7. Hata K, Nagami H, Iida K, et al. Expression of thymidine phosphorylase in malignant ovarian tumors: correlation with microvessel density and an ultrasound-derived index of angiogenesis. Ultrasound Obstet Gynecol 1998; 12: 201-6.
8. Folkman J. Tumor angiogenesis. In: The Molecular Basis of Cancer. Eds. J Mendelsohn, PM Howley, MA Israel & LA Liotta. Philadelphia: Saunders, 1995: 206-32.
9. Kubiak R, Miszczak-Zaborska E, Jesinek-Kupnicka D, et al. Correlation between the activity of thymidine phosphorylase and some clinical features and the level of angiogenesis in brest carcinoma. Z Naturforsch 1999; 54c: 1096-101.
10. Stępień HM, Kołomecki K, Pasieka Z, et al. Angiogenesis of endocrine gland tumors – new molecular targets in diagnostics and therapy. Eur J Endocr 2002; 146: 143-51.




Adres do korespondencji


I Klinika Ginekologii
i Onkologii Ginekologicznej
Instytutu Ginekologii i Położnictwa
Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
ul. Wileńska 37
94-029 Łódź