Apoptosis and BRCA1 gene mutations in women with breast cancer from the Lodz region of Poland

Wstęp
Mutacje w genach supresorowych BRCA1 (ang. BReast-CAncer susceptibility gene 1) i BRCA2 predysponują do rozwoju raka piersi i jajnika [1–4]. Badania wskazują, że białka kodowane przez te geny uczestniczą w ważnych procesach komórkowych. W szczególności oba białka wpływają na naprawę DNA i regulację transkrypcji w odpowiedzi na uszkodzenia DNA [5, 6]. Białka BRCA1 i BRCA2 są konieczne dla zachowania stabilności chromosomów, co chroni genom przed uszkodzeniami [7]. BRCA1/2 oddziałują z wieloma innymi białkami uczestniczącymi w naprawie DNA (RAD51, RAD52, XRCC2, PIR54) i procesie apoptozy (Bax, Bcl-2, P53) [8].
Apoptoza jest genetycznie uwarunkowanym procesem fizjologicznym, polegającym na zmianach biochemicznych i morfologicznych komórek, które prowadzą poprzez proteolityczną i nukleolityczną degradację składników komórki do jej śmierci. Obecnie wiadomo, że występowanie i rozwój nowotworu jest wynikiem nie tylko nagromadzenia się w komórkach zmian genetycznych powstałych w konsekwencji nadekspresji lub mutacji protoonkogenów, czy też utraty lub zmian genów supresorowych. Za równie istotny czynnik w tych procesach uważa się obniżenie zdolności komórek do prawidłowego przeprowadzania programu aktywnej śmierci – apoptozy, jako odpowiedzi na bodźce pochodzące z otaczającego środowiska [10]. Apoptoza jest regulowana przez białka z rodziny Bcl-2; supresory apoptozy Bcl-2, Bcl-X_L czy Mcl-1 oraz jej promotory Bax, Bak i Bcl-X_S [11, 12].
W raku piersi defekty w ekspresji mRNA Bax są kluczowym promotorem apoptozy [13]. p53 działa jako transkrypcyjny regulator genu Bax oraz współdziała z BRCA1 [14]. BRCA1 podwyższa zależną od p53 transkrypcję promotorów p21WAF1/CIP1 i bax [15] BRCA1 i p53 oddziałują in vitro i in vivo i wspólnie indukują apoptozę w komórkach rakowych.
W raku piersi stwierdzono związek pomiędzy apoptozą a stopniem zaawansowania nowotworu i negatywnymi recetorami estrogenowymi. Wysoki poziom apoptozy w raku piersi jest złym czynnikiem rokowniczym [16].
Jednym z przejawów apoptozy jest fragmentacja DNA na poziomie nukleosomów (185 pz). Zazwyczaj pofragmentowany DNA jest wykrywany poprzez elektroforezę w żelu agarozowym. W niniejszej pracy badano częstość apoptozy przy zastosowaniu powyższej techniki u chorych na raka piersi. Poza tym analizowano mutacje w genie BRCA1, ponieważ uczestniczy on w indukowaniu tego procesu.
Materiał i metody
Pacjentki z rakiem piersi
Krew do badań została uzyskana od 40 kobiet z rakiem piersi, u których stwierdzono obecność (n=12) lub brak przerzutów (n=28) do okolicznych węzłów chłonnych. Krew pobrano od 18 kobiet w wieku przedmenopauzalnym (średnia wieku ±SD 41,33±4,72 lat) i od 22 kobiet w wieku pomenopauzalnym (średnia wieku ±SD 65,33±7,66 lat). Średni rozmiar guza wynosił 20 mm (17–32 mm). Wszystkie nowotwory były klasyfikowane wg skali Scarffa-Blooma-Richardsona. W badaniach wykorzystano 17 przypadków nowotworów I stopnia, 16 – II stopnia i 7 – III stopnia zaawansowania.
Grupa kontrolna
Jako kontrolę zastosowano krew uzyskaną od kobiet (n=42), u których nie stwierdzono występowania choroby nowotworowej.
Analiza apoptozy
Analiza apoptozy została przeprowadzona w DNA uzyskanym z limfocytów krwi obwodowej przy zastosowaniu komercyjnie dostępnego zestawu Ladder Ex^TM (TaKaRa BIO INC., Japonia) zgodnie z zaleceniami producenta (ryc. 1.).
Analiza mutacji BRCA1
Analiza mutacji w genie BRCA1 została przeprowadzona w DNA uzyskanym z limfocytów krwi obwodowej przy zastosowaniu komercyjnie dostępnego zestawu (Międzynarodowe Centrum Nowotworów Dziedzicznych, Szczecin, Polska) zgodnie z zaleceniami producenta (ryc. 2.).
Analiza statystyczna
W celu analizy statystycznej zastosowano test χ², p<0,05 było traktowane jako wynik statystycznie znaczący.
Wyniki
Genomowy DNA był ekstrahowany z 40 próbek krwi uzyskanych od chorych na raka piersi i 42 zdrowych osób. Apoptotyczne uszkodzenia DNA w limfocytach krwi obwodowej zarówno u pacjentów, jak i w kontroli były wykrywane z zastosowaniem elektroforezy w żelu agarozowym.
Częstość apoptozy u chorych na raka piersi i w kontroli została przedstawiona w tab. I. 12 z 40 próbek rakowych (30%) charakteryzowało się obecnością apoptotycznych uszkodzeń DNA w limfocytach krwi obwodowej. W przypadku kontroli 14 z 42 przypadków (33%) wykazywało fragmentację DNA. Obecność drabinek apoptotycznych w komórkach rakowych nie była wyższa niż w komórkach prawidłowych (P>0,05). Wśród apoptotycznie pozytywnych próbek 7 pochodziło od kobiet w wieku przedmenopauzalnym i 5 od kobiet w wieku pomenopauzalnym. Analiza częstości apoptozy pomiędzy tymi grupami wykazała brak statystycznie istotnych różnic (test Mann-Whitney U, P=0,051).
Zależność rozkładu częstości apoptozy od stopnia zaawansowania nowotworu określonego wg skali Scarfa-Blooma-Richardsona dla chorych na raka piersi przedstawia tab. II. Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic pomiędzy stopniem apoptozy w podgrupach o różnym stopniu zaawansowania nowotworów (P<0,05).
Analiza mutacji genu BRCA1 została przeprowadzona w grupie chorych na raka piersi. W grupie 40 badanych kobiet stwierdzono tylko jedną mutację Ex20insC BRCA1.
Dyskusja
Rak piersi dotyka co dziesiątą kobietę w krajach uprzemysłowionych i jest główną przyczyną ich śmierci. Rak piersi może zachodzić sporadycznie lub być uwarunkowany dziedzicznie. Raki sporadyczne stanowią ok. 95% przypadków, tylko 5% raków piersi jest uwarunkowanych dziedzicznie [17]. Istotny jest fakt, że raki piersi uwarunkowane dziedzicznie dotykają osoby w młodym wieku.
Dane literaturowe wskazują na związek BRCA1 z naprawą DNA [18]. BRCA1 odgrywa także istotną rolę w regulacji procesu apoptozy. Badano związki pomiędzy genem BRCA1 a genami odpowiadającymi za proces apoptozy, jak bcl-2, bax oraz p53 w raku piersi [19]. Ekspresja BRCA1 korelowała pozytywnie z ekspresją bcl-2, czego nie zaobserwowano w przypadku bax i p53. Dane sugerują, że bcl-2 może być istotnym genem współdziałającym z BRCA1 w procesie nowotworzenia.
Apoptoza jest zjawiskiem zachodzącym w przypadku nowotworów i wydaje się mieć istotne znaczenie dla ich występowania. Podwyższoną częstość apoptozy stwierdza się w raku piersi typu przewodowego [20, 21]. Wysoki poziom apoptozy w tym nowotworze może być związany z krótszym czasem przeżycia [22, 23] i może być niezależnym czynnikiem prognostycznym [24, 25].
Aby stwierdzić fakt, czy komórki nowotworowe od chorych na raka piersi podlegają kontroli poprzez proces apoptozy, genomowy DNA był izolowany z krwi uzyskanej od chorych leczonych w Instytucie Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi. Analizę DNA prowadzono z zastosowaniem klasycznej elektroforezy w żelu agarozowym. 30% pacjentek z rakiem piersi reprezentowało uszkodzenia DNA charakterystyczne dla procesu apoptozy; 14 z 42 próbek kontrolnych (33%) charakteryzowało się zmianami apoptotycznymi, czyli w podobnej skali, co w przypadku grup badanych. Przeprowadzone analizy histologiczne wskazują na brak korelacji pomiędzy stopniem zaawansowania nowotworów a liczbą komórek apoptotycznych.
Wykrywanie apoptozy przy zastosowaniu elektroforezy w żelu agarozowym polega na określaniu stopnia fragmentacji DNA [25]. W obecnej pracy wykazano, że apoptoza może być z sukcesem wykrywana w limfocytach krwi obwodowej przy użyciu powyższej metody.
W grupie 40 kobiet z rakiem piersi mutację w genie BRCA1 stwierdzono tylko w 1 przypadku III stopnia zaawansowania nowotworu. W tym przypadku stwierdzono także apoptotyczne uszkodzenia DNA.
Badania wskazują, że zmiany genetyczne, jak mutacje BRCA1 i apoptotyczne uszkodzenia DNA mogą być wykrywane w raku piersi. Przeprowadzone wstępne analizy sugerują, że proces apoptozy może być związany z występowaniem i/lub progresją raka piersi. Brak mutacji BRCA1 w większości przypadków sugeruje na fakt uczestnictwa innych genów w procesie nowotworzenia, które być może nie zostały jeszcze poznane. Jednakże kolejne badania, obejmujące większą populację chorych są konieczne dla potwierdzenia tego przypuszczenia.

Praca powstała w oparciu o granty 3P05C06624 i 3P05E07124 uzyskane z Komitetu Badań Naukowych (KBN).
Piśmiennictwo
1. Futreal PA, Liu QY, Shattuck-Eidens D, et al. BRCA1 mutations in primary breast and ovarian carcinomas. Science 1994; 266: 120-2.
2. Miki Y, Swensen J, Shattuck-Eidens D, et al. A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1. Science 1994; 266: 66-71.
3. Wooster R, Bignell G, Lancaster J, et al. Identification of the breast cancer gene BRCA2. Nature 1995; 378: 789-92.
4. Wooster R, Neuhausen S, Mangion J, et al. Location of a breast cancer susceptibility gene, BRCA2, to chromosome 13q12-13. Science 1994; 265: 2088-90.
5. Yoshida K, Miki Y. Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage. Cancer Sci 2004; 95: 866-71.
6. Lane TF. BRCA1 and transcription. Cancer Biol Ther 2004; 3: 528-33.
7. Ting NS, Lee WH. The DNA double-strand break response pathway: becoming more BRCAish than ever. DNA Repair (Amst) 2004; 3, 935-44.
8. Dubrovska A, Kanamoto T, Lomnytska M, et al. TGFbeta1/Smad3 counteracts BRCA1-dependent repair of DNA damage. Oncogene; 2005: 24, 2289-97.
9. Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 1972; 26; 239-57.
10. Kerr JF, Winterford CM, Harmon BW. Apoptosis. Its significance in cancer and cancer therapy. Cancer 1994; 73: 2013-26.
11. Reed JC, Miyashita T, Takayama S, Wang HG, et al. BCL-2 family proteins: regulators of cell death involved in the pathogenesis of cancer and resistance to therapy. J Cell Biochem 1996; 60: 23-32.
12. Song Q, Kuang Y, Divit VM, Vincenz C. BOO, a novel negative regulator of cell death, interacts with Apaf-1. EMBO J 1999; 18: 167-78.
13. Bargou RC, Daniel PT, Mapara MY, et al. Expression of the bcl-2 gene family in normal and malignant breast tissue: low bax-alpha expression in tumor cells correlates with resistance towards apoptosis. Int J Cancer 1995; 60: 854-9.
14. Miyashita T, Reed JC. Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene. Cell 1995; 80: 293-9.
15. Zhang H, Somasundaram K, Peng Y, et al. BRCA1 physically associates with p53 and stimulates its transcriptional activity. Oncogene 1998; 16: 1713-21.
16. Parton M, Dowsett M, Smith I. Studies of apoptosis in breast cancer. BMJ 2001; 322: 1528-32.
17. Garber JE, Offit K. Hereditary cancer predisposition syndromes. J Clin Oncol 2005; 23: 276-92.
18. Brugarolas J, Jacks T. Double indemnity: p53, BRCA and cancer p53 mutation partially rescues developmental arrest in Brca1 and Brca2 null mice, suggesting a role for familial breast cancer genes in DNA damage repair. Nature Med 1997; 7: 721-2.
19. Yang Q, Yoshimura G, Nakamura M, et al. Correlation between BRCA1 expression and apoptosis-related biological parameters in sporadic breast carcinomas. Anticancer Res 2002; 22: 3615-9.
20. Gandhi A, Holland PA, Knox WF, et al. Evidence of significant apoptosis in poorly differentiated ductal carcinoma in situ of the breast. Br J Cancer 1998; 78: 788-94.
21. Lipponen P, Aaltomaa S, Kosma VM, et al. Apoptosis in breast cancer as related to histopathological characteristics and prognosis. Eur J Cancer 1994; 14: 2068-73.
22. Berardo MD, Elledge RM, de Moor C, et al. Bcl-2 and apoptosis in lymph node positive breast carcinoma. Cancer 1998; 82: 1296-302.
23. Zhang GJ, Kimijima I, Abe R, et al. Apoptotic index correlates to bcl-2 and p53 protein expression histological grade and prognosis in invasive breast cancer. Anticancer Res 1998; 18: 1989-98.
24. De Jong JS, van Diest PJ, Baak JP. Number of apoptotic cell as a prognostic marker in invasive breast cancer. Br J Cancer 2000; 82: 368-73.
25. Gonzalez-Campora R, Galera Ruiz MR, Vazquez Ramirez F, et al. Apoptosis in breast carcinoma. Pathol Res Pract 2000; 196: 167-74.
Adres do korespondencji
dr n. med. Hanna Romanowicz-Makowska
Pracownia Biologii Molekularnej,
Zakład Patomorfologii Klinicznej
Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki
w Łodzi
ul. Rzgowska 281/289
93-338 Łódź
tel. +48 42 271 12 80
e-mail: smolbea@wp.pl