Arginase and arginine in diagnostics of patients with colorectal cancer and patients with colorectal cancer liver metastases

Wstęp
Nowotwory złośliwe stanowią jedną z najgroźniejszych chorób we współczesnym świecie, a rak jelita grubego jest drugą, po raku płuc u mężczyzn i raku gruczołu sutkowego u kobiet, przyczyną zgonów. Statystyki wskazują, że u połowy osób chorych na raka jelita grubego dochodzi do rozwoju przerzutów odległych, głównie do wątroby, natomiast u 30% przerzuty występują już w chwili wykrycia ogniska pierwotnego. Podstawowym sposobem leczenia jest resekcja chirurgiczna, której skuteczność zależy w dużej mierze od liczby, wielkości, zaawansowania, a także umiejscowienia zmian nowotworowych. Dlatego też dla rokowania, a tym samym przeżycia pacjenta, ważne jest wczesne rozpoznanie procesu nowotworowego. W diagnostyce raka jelita grubego i jego przerzutów do wątroby najczęściej stosowanymi markerami są antygen kanceroembrionalny (CEA) oraz antygen węglowodanowy (CA19-9) [1]. Badania prowadzone od wielu lat w Zakładzie Biochemii Akademii Medycznej w Warszawie [obecnie Warszawski Uniwersytet Medyczny] wskazują na możliwość wykorzystania arginazy w celu diagnostyki zarówno pierwotnego raka jelita grubego, jak i jego przerzutów do wątroby [2, 3]. Arginaza (EC.3.5.3.1) katalizuje hydrolizę L-argininy do mocznika i ornityny. W wątrobie człowieka pełni ważną funkcję w detoksykacji amoniaku jako ostatni enzym cyklu mocznikowego. Poza wątrobą występuje także w wielu innych tkankach, w których jej rola nie została w pełni wyjaśniona [4]. U ssaków arginaza występuje w formie dwóch izoenzymów, będących produktami genów AI i AII. Izoenzymy arginazy różnią się lokalizacją komórkową (AI w cytozolu, AII w mitochondrium) oraz odmiennymi właściwościami fizykochemicznymi, kinetycznymi i immunologicznymi [5]. Rozkładana przez arginazę L-arginina powstaje w osi jelitowo-nerkowej [6, 7]. W warunkach fizjologicznych jej synteza jest wystarczająca do prawidłowego funkcjonowania dorosłego organizmu. Nie jest jednak wystarczająca dla organizmów rosnących, którym musi być dostarczana z pokarmem. Suplementacja L-argininy jest wskazana także w urazach, oparzeniach, zaburzeniach czynności nerek, w których dochodzi do zmniejszenia stężenia argininy w surowicy [8]. Arginina bierze udział w wielu ważnych procesach fizjologicznych i metabolicznych jako związek wyjściowy do syntezy białek komórkowych, tlenku azotu, glutaminianu, glutaminy, kreatyny. Poza mocznikiem jest źródłem uwalnianej przez arginazę ornityny, z przemian której powstają poliaminy. Ponieważ poliaminy są odpowiedzialne za proliferację i różnicowanie się komórek zarówno L-arginina, jak i arginaza mogą pełnić istotną funkcję w procesie kancerogenezy [9, 10]. W niniejszej pracy oznaczono i porównano aktywność arginazy i stężenie L-argininy w surowicy chorych na raka jelita grubego i z przerzutami tego nowotworu do wątroby oraz określono przydatność diagnostyczną badanych parametrów.
Materiał i metody
Krew do badań pochodziła od chorych na raka jelita grubego i osób z przerzutami raka jelita grubego do wątroby, operowanych w Klinikach Chirurgii Akademii Medycznej w Warszawie. Badaniami objęto grupę 30 chorych na raka jelita grubego (11 kobiet i 18 mężczyzn), w wieku 51–77 lat (średni wiek 67,3±9,6 roku) i grupę 27 osób z przerzutami raka jelita grubego do wątroby (13 kobiet i 14 mężczyzn), w wieku 37–71 lat (średni wiek 55,1±9,8 roku). Diagnostyka przedoperacyjna obejmowała testy biochemiczne, kolonoskopię oraz badanie ultrasonograficzne. Zmiany nowotworowe potwierdzone zostały pooperacyjnym badaniem histopatologicznym. Grupę kontrolną stanowiło 25 zdrowych dawców krwi (14 kobiet i 11 mężczyzn), w wieku 30–75 lat (średni wiek 50,9±11 lat). Krew do badań pobierano dzień przed operacją, a otrzymaną surowicę zamrażano w temp. –80°C i stosowano do badań. Badania wykonywano za zgodą pacjentów i Komisji Bioetycznej przy Akademii Medycznej w Warszawie. Aktywność arginazy oznaczano spektrofotometrycznie z ilości powstałej w reakcji ornityny i wyrażano w jednostkach na litr surowicy (U/l) [11]. Jedna jednostka aktywności odpowiadała 1 mikromolowi ornityny powstającej w ciągu 1 min w temperaturze 37°C. Stężenie L-argininy oznaczano metodą spektrofotometryczno-enzymatyczną, mierząc stężenie ornityny powstałej w reakcji katalizowanej przez standaryzowany preparat arginazy i wyrażano w mg/dl [12]. Zakres wartości referencyjnych grupy kontrolnej, zawierający się pomiędzy 5. a 95. percentylem wynosił 3,1–15,8 U/l dla aktywności arginazy i 1,3–2,5 mg/dl dla stężenia argininy. Poziom odcięcia (cut-off) określono za pomocą analizy ROC (ang. receiver operating characteristic). Dla arginazy wynosił on 12 U/l, a dla argininy 2,4 mg/dl. Analizę statystyczną uzyskanych wyników przeprowadzono przy użyciu programu Statistica 6.0, StatSoft Inc. (St Tulsa USA). Uzyskane dane przedstawiono jako wartości mediany. W analizie statystycznej stosowano testy nieparametryczne ANOVA, U-Manna-Whitneya. W ocenie istotności statystycznej różnic pomiędzy grupami chorych i grupą kontrolną przyjęto p<0,001.
Wyniki
Aktywność arginazy w surowicy chorych na raka jelita grubego mieściła się w przedziale 6,9–57,6 U/l (mediana 18,4), natomiast w surowicy osób z przerzutami raka jelita grubego do wątroby 4,3–147 U/l (mediana 34,1). Aktywność arginazy w obu badanych grupach była znamiennie wyższa niż w grupie kontrolnej, gdzie wynosiła 3,1–19,5 U/l (mediana 5,6) (ryc. 1., 2.). Stężenie L-argininy w surowicy chorych na raka jelita grubego i osób z przerzutami tego nowotworu do wątroby mieściło się w zakresie 2,2–6,0 mg/dl. Wartość mediany w obu badanych grupach była podobna i wynosiła 3,7 mg/dl w surowicy chorych na raka jelita grubego i 4,1 mg/dl w surowicy osób z przerzutami. Podobnie jak aktywność arginazy, stężenie L-argininy w obu badanych grupach chorych było znamiennie większe w porównaniu z grupą zdrowych dawców krwi, gdzie wynosiło 1,1–2,5 mg/dl (mediana 1,9) (ryc. 1., 3.). Na podstawie uzyskanych wyników określono czułość każdego z badanych parametrów. W przypadku arginazy odsetek wyników prawdziwie dodatnich w grupie chorych na raka jelita grubego oraz w grupie z przerzutami do wątroby był zbliżony i wynosił odpowiednio 83 i 81% (tab. 1.). Czułość oznaczania L-argininy była wyższa i wynosiła 90% w raku jelita grubego i 96% w przerzutach tego nowotworu do wątroby (tab. 1.).
Dyskusja
Jak wykazaliśmy uprzednio, aktywność arginazy wzrasta znacząco w surowicy chorych na raka pierwotnego jelita grubego oraz osób z przerzutami tego nowotworu do wątroby [2, 3]. W niniejszej pracy potwierdzono wcześniejsze wyniki i stwierdzono, że u chorych na raka pierwotnego aktywność arginazy wzrasta 3-krotnie, a u chorych z przerzutami 6-krotnie. Ponieważ aktywność arginazy w guzach jest znacznie wyższa niż w prawidłowej błonie śluzowej jelita grubego, obecna w surowicy chorych arginaza prawdopodobnie pochodzi z tkanki nowotworowej [13]. Czułość oznaczania arginazy w surowicy badanych w obecnej pracy chorych na raka pierwotnego wynosiła 83%, a z przerzutami 81%. W tej drugiej grupie była ona zgodna z wcześ-niejszymi badaniami wykonanymi z udziałem 85 osób z przerzutami raka jelita grubego do wątroby (85%) [2]. Jednak do wzrostu aktywności arginazy w surowicy dochodzi także w schorzeniach nienowotworowych, takich jak: oparzenia, cukrzyca, astma czy stany zapalne [14–17]. Ponieważ może to ograniczać wartość diagnostyczną wyłącznego oznaczania tego enzymu jako markera raka jelita grubego i jego przerzutów do wątroby, w prezentowanych badaniach poza aktywnością arginazy równocześnie oznaczano stężenie rozkładanej przez nią L-argininy. Hydrolizowana przez arginazę L-arginina jest aminokwasem niezbędnym do wzrostu komórek nowotworowych [18]. Rak jelita grubego, w przeciwieństwie np. do raka pierwotnego wątroby, nie jest auksotroficzny wobec L-argininy, którą może syntetyzować z cytruliny [19]. Mimo tego zarówno w guzach pierwotnych, jak i przerzutowych raka jelita grubego wykazano wzrost syntezy transporterów argininy, co wskazuje na zwiększone zapotrzebowanie komórek nowotworowych na ten aminokwas [20, 21]. Stwierdzono także, że w raku pierwotnym jelita transport argininy jest stymulowany przez EGF i TGF-a, czynniki mające bardzo istotny wpływ na wzrost komórek nowotworowych [22]. Jak wykazaliśmy, u chorych na raka jelita grubego oraz z jego przerzutami, wzrostowi aktywności arginazy towarzyszy 2-krotne zwiększenie stężenia L-argininy w surowicy. Czułość oznaczania L-argininy była bardzo wysoka (90% u chorych na raka pierwotnego i 96% u osób z przerzutami). Z literatury wiadomo, że w stanach nienowotworowych, przebiegających ze wzrostem aktywności arginazy, stężenie L-argininy w surowicy jest zmniejszone [14, 23–25]. Wyjaśnienie zwiększenia stężenia L-argininy w surowicy chorych badanych w obecnej pracy wymaga dalszych badań. Uzyskane w pracy wyniki wskazują, że równoczesne oznaczanie aktywności arginazy i stężenia L-argininy może podnieść skuteczność oznaczania samej arginazy jako markera raka jelita grubego i/lub jego przerzutów do wątroby. Może też być pomocne w różnicowaniu tych nowotworów z procesami nienowotworowymi. Znaczne różnice pomiędzy aktywnością arginazy (ale nie stężeniem L-argininy) w surowicy chorych na raka pierwotnego jelita grubego i osób z jego przerzutami do wątroby mogą być wykorzystywane w różnicowaniu tych dwóch procesów nowotworowych.
Podziękowania
Praca była finansowana z projektu badawczego promotorskiego nr 2 PO5B 124 27 oraz tematu 1WK/N/2007. Autorzy dziękują prof. M. Krawczykowi, kierownikowi Katedry i Kliniki Chirurgii Ogólnej, Transplantacyjnej i Wątroby, prof. I. Krasnodębskiemu, kierownikowi Katedry i Kliniki Chirurgii Ogólnej, Gastroenterologicznej i Żywienia i prof. Z. Wierzbickiemu z Katedry i Kliniki Chirurgii Ogólnej i Transplantacyjnej za udostępnienie krwi badanych chorych.
Piśmiennictwo
1. Nowotwory przewodu pokarmowego. Krawczyk M (red). Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2001. 2. Mielczarek M, Chrzanowska A, Ścibior D, Skwarek A, Ashamiss F, Lewandowska K, Barańczyk-Kuźma A. Arginase as a useful factor for the diagnosis of colorectal cancer liver metastases. Int J Biol Markers 2006; 21: 40-4. 3. Porembska Z, Skwarek A, Mielczarek M, Barańczyk-Kuźma A. Serum arginase activity in postsurgical monitoring of patients with colorectal carcinoma. Cancer 2002; 94: 2930-34. 4. Jenkinson CP, Groody WW, Cederbaum SD. Comparative properties of arginases. Comp Biochem Physiol Biochem Mol Biol 1996; 114: 107-32. 5. Cederbaum SD, Yu H, Grody WW, Kern RM, Yoo P, Iyer RK. Arginases I and II: do their functions overlap? Mol Genet Metab 2004; 81 Suppl 1: S38-44. 6. Windmueller HG, Spaeth AE. Source and fate of circulating citrulline. Am J Physiol 1981; 241: E473-80. 7. van de Poll MC, Siroen MP, van Leeuwen PA, Soeters PB, Melis GC, Boelens PG, Deutz NE, Dejong CH. Interorgan amino acid exchange in humans: consequences for arginine and citrulline metabolism. Am J Clin Nutr 2007; 85: 167-72. 8. Wu G, Meininger C, Knabe DA Bazer FW, Rhoads JM. Arginine nutrition in development, health and disease. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2000; 3: 59-66. 9. Gokmen SS, Aygit AC, Ayhan MS, Yorulmaz F, Gulen S. Significance of arginase and ornithine in malignant tumors of the human skin. J Lab Clin Med 2001; 137: 340-4. 10. Singh R, Pervin S, Wu G, Chaudhuri G. Activation of caspase-3 activity and apoptosis in MDA-MB-468 cells by N (omega)-hydroxy-L-arginine, an inhibitor of arginase, is not solely dependent on reduction in intracellular polyamines. Carcinogenesis 2001; 22: 1863-9. 11. Chinard FP. Photometric estimation of proline and ornithine. J Biol Chem 1952; 199: 91-5. 12. Gopalakrishna R, Nagarajan B. A simplified procedure for the estimation of arginine in plasma and urine using arginase. Clin Chim Acta 1980; 106: 333-7. 13. Porembska Z, Ząbek J, Graboń W, Rahden-Staroń I, Barańczyk-Kuźma A. Arginase isoforms in human colorectal cancer. Clin Chim Acta 2001; 305: 157-65. 14. Kashyap SR, Lara A, Zhang R, Park YM, DeFronzo RA. Insulin reduces plasma arginase ativity in type 2 diabetic patients. Diabetes Care 2008; 31: 134-9. 15. Morris CR, Poljakovic M, Lavrisha L, Machado L, Kuypers FA, Morris SM Jr. Decreased arginine bioavailability and increased serum arginase activity in asthma. Am J Respir Crit Care Med 2004; 170: 148-53. 16. Ścibior D, Ashamiss F, Wierzbicki Z, Barańczyk-Kuźma A. Arginase activity in blood serum of patients with acute and chronic pancreatitis. Pol Merk Lek 2006; 126: 522-4. 17. Yu YM, Ryan CM, Castillo L, Lu XM, Beaumier L, Tompkins RG, Young VR. Arginine and ornithine kinetics in severely burned patients: increased rate of arginine disposal. Am J Physiol Endocrinol Metab 2001; 280: E509-E517. 18. Caso G, McNurlan MA, McMillan ND, Eremin O, Garlick PJ. Tumour cell growth in culture: dependence on arginine. Clin Sci (Lond) 2004; 107: 371-9. 19. Dillon BJ, Prieto VG, Curley SA, Ensor CM, Holtsberg FW, Bomalaski JS, Clark MA. Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers:a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation. Cancer 2004; 100: 826-33. 20. Cendan JC, Souba WW, Copeland EM 3rd, Lind DS. Characterization and growth factor stimulation of L-arginine transport in a human colon cancer cell line. Ann Surg Oncol 1995; 2: 257-65. 21. Cendan JC, Souba WW, Copeland EM 3rd, Lind DS. Increased L-arginine transport in a nitric oxide-producing metastatic colon cancer cell line. Ann Surg Oncol 1996; 3: 501-8. 22. Huang S, Trujillo JM, Chakrabarty S. Proliferation of human colon cancer cells: role of epidermal growth factor and transforming growth factor alpha. Int J Cancer 1992; 52: 978-86. 23. Grasemann, H, Schwiertz R, Grasemann C, Vester U, Racké K, Ratjen F. Decreased systemic bioavailability of L-arginine in patients with cystic fibrosis. Respir Res 2006; 7: 87. 24. Sandstrom P, Trulsson L, Gasslander T, Sundqvist T, von Dobeln U, Svanvik J. Serum amino acid profile in patients with acute pancreatitis. Amino Acids 2007; DOI: 10.1007/S00726-007-0557-5. 25. Morris CR, Kato GJ, Poljakovic M, et al. Dysregulated arginine metabolism, hemolysis-associated pulmonary hypertension, and mortality in sickle cell disease. JAMA 2005; 294: 81-90.
Adres do korespondencji
prof. dr hab. Anna Barańczyk-Kuźma Katedra i Zakład Biochemii Warszawski Uniwersytet Medyczny ul. Banacha 1 02-097 Warszawa tel. +48 22 572 06 93; faks +48 22 572 06 79 e-mail: akuzma@amwaw.edu.pl