Original paper
Serum soluble tumour necrosis factor a receptor type I measurement in patients

Wstęp

Choroba Raynauda jest schorzeniem o nieznanej etiologii, charakteryzującym się zaburzeniami naczynioruchowymi w obrębie dystalnych części kończyn, które polegają na napadowym blednięciu z następowym sinieniem i obrzękiem rąk, u części chorych także stóp, uszu lub nosa (objaw Raynauda). Choroba Raynauda wymaga różnicowania z wtórnymi zaburzeniami wazokonstrykcyjnymi (zespół Raynauda), związanymi z różnymi stanami chorobowymi, najczęściej chorobami tkanki łącznej, głównie z twardziną układową. Diagnostyka pierwotnego i wtórnego objawu Raynauda stwarza jednak wiele trudności. Stwardnienie skóry i włóknienie narządów wewnętrznych
– obiektywne kryteria pozwalające na rozpoznanie SSc
– mogą w wielu przypadkach rozwijać się powoli, dopiero po wielu latach trwania objawu Raynauda. Jako czynniki prognostyczne rozwoju SSc proponuje się obecność zmian kapilaroskopowych (obok rozszerzonych i pozazębianych pętli charakterystycznych dla choroby Raynauda, dla SSc typowe jest zwężenie światła i zanikanie naczyń), dodatnie przeciwciała przeciwjądrowe (scl70, ACA, jąderkowe), wzrost stężenia w surowicy czynników śródbłonkowych (endotelina 1 ET-1, tkankowy aktywator plazminogenu tPA, inhibitor aktywatora plazminogenu PAI-1,
E-selektyna) i płytkowych (β-tromboglobulina – β-TG, płytkopochodny czynnik wzrostowy PDGF, transformujący czynnik wzrostowy TGF-β) [1–7]. W celu optymalizacji postępowania u chorych z objawem Raynauda nadal poszukuje się nowych wskaźników rozwoju SSc. Uszkodzenie i aktywacja śródbłonka należą do najwcześniejszych zmian patogenetycznych w SSc i wiążą się m.in. z ekspresją cytokin IL-1, IL-6, INF-γ, a głównie TNF-α[8–10]. Hebbar i wsp. [11] wykryli wzrost liczby komórek tucznych i zwiększoną ekspresję TNF-αu chorych z objawem Raynauda i nieprawidłowym obrazem kapilaroskopowym, u których następnie obserwowano rozwój SSc. Czynnik ten ze względu na krótki czas półtrwania rzadko jednak wykrywa się w surowicach, ale przyjmuje się, że na jego aktywację mogą wskazywać wysokie stężenia rozpuszczalnych receptorów sTNFαRI i sTNFαRII [12]. Są one obecne w krążeniu osób zdrowych w niewielkich ilościach, natomiast w stanach aktywacji układu immunologicznego stężenie ich może znacznie wzrastać, przekraczając nieraz ponad 100-krotnie stężenie cytokiny [12]. Ekspresję receptorów dla
TNF-α wykazują różnorodne komórki, ale głównym źródłem sTNαRI we krwi są prawdopodobnie komórki śródbłonka, fibroblasty i makrofagi, natomiast sTNFαRII komórki limfatyczne [13]. Uznawanie stężenia sTNFαRI za jeden ze wskaźników postępu SSc stwarza przesłankę, że wykrycie w krążeniu chorych z objawem Raynauda podwyższonego stężenia tego receptora przed wystąpieniem stwardnień skóry mogłoby stanowić parametr prognostyczny świadczący o początku procesu autoimmunologicznego.

Celem pracy była ocena stężenia sTNFαRI w surowicach chorych z objawem Raynauda bez klinicznych objawów chorób tkanki łącznej i w surowicach chorych z SSc oraz określenie wartości tego parametru w rokowaniu rozwoju i progresji twardziny.

Materiał i metody

Badaniami objęto 50 chorych (45 kobiet i 5 mężczyzn) z objawem Raynauda w wieku 30–73 lat (średnia 44,6±13 lat), hospitalizowanych w Klinice Dermatologii Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach, z podejrzeniem lub rozpoznaniem twardziny układowej we wczesnym okresie choroby – do 3 lat od wystąpienia stwardnień skóry. Czas trwania objawu Raynauda wynosił 0,3–25 lat, średnio 7,2±5,7 lat. U każdego chorego wykonywano badanie kapilaroskopowe wałów paznokciowych, oznaczano przeciwciała przeciwjądrowe (ANA) metodą IIF na komórkach Hep-2 i przeprowadzano szczegółowe badania diagnostyczne, pozwalające na ocenę zajęcia przez proces chorobowy narządów wewnętrznych. Zmiany w przełyku rozpoznawano na podstawie stwierdzonych zaburzeń perystaltyki i/lub wygładzenia fałdów błony śluzowej w badaniu radiologicznym przełyku. O zajęciu płuc świadczyły obustronne zmiany włókniste w badaniu rentgenologicznym klatki piersiowej. Zmiany kardiologiczne o charakterze arytmii, zaburzeń przewodnictwa w badaniu EKG lub podczas elektrostymulacji przezprzełykowej i cechy niewydolności prawokomorowej, wtórnej do nadciśnienia płucnego, rozpoznawano jako zajęcie mięśnia sercowego w przebiegu SSc, natomiast zajęcie nerek przez proces chorobowy na podstawie utrzymującego się białkomoczu i współistnienia nadciśnienia tętniczego. Zmiany mięśniowe typu myositis, poza objawami klinicznymi, osłabieniem i bólami mięśni, zdiagnozowano na podstawie zwiększenia aktywności enzymów mięśniowych (fosfokinazy kreatynowej i aldolazy) oraz odchyleń w badaniu elektromiograficznym i histopatologicznym. Poza tym przeprowadzano rutynowe badania laboratoryjne (OB, morfologię krwi, badanie ogólne moczu) oraz wykonano odczyn Waalera-Rosego, latex-R, elektroforetyczny rozdział białek surowicy i oceniano funkcję nerek.

Na podstawie kryteriów Amerykańskiego Towarzystwa Reumatologicznego [14] u 20 chorych rozpoznano SSc, pozostali 30 chorzy to pacjenci z izolowanym objawem Raynauda. Biorąc pod uwagę topografię stwardnień skóry i przebieg choroby, posługiwano się najszerzej przyjętym podziałem twardziny układowej na postać ze stwardnieniami ograniczonymi do odsiebnych części ciała (ang. limited SSc – ISSc) oraz postać uogólnioną (ang. diffuse SSc – dSSc). Stan zajęcia skóry określano, posługując się techniką skin score, opisaną przez Clementsa i wsp. [15]. W 10 okolicach ciała (twarz, klatka piersiowa, brzuch, plecy, ramiona, przedramiona, ręce, uda, podudzia, stopy) manualnie oceniano możliwość ujęcia skóry w fałd, przyjmując 0–3-stopniową skalę (0 – brak stwardnienia skóry, 1 – lekkie stwardnienie, 2 – średnie stwardnienie,
3 – duże stwardnienie skóry). O skin score stanowiła suma punktów przyznanych w poszczególnych badanych okolicach ciała, maksymalnie 30 pkt. Analizując zmiany układowe u badanych chorych, uwzględniono ich charakter i nasilenie oraz liczbę zajętych narządów. Szybką progresję zmian układowych w SSc rozpoznawano, gdy stwierdzono zmiany włókniste w płucach i objęcie procesem chorobowym co najmniej 2 innych narządów, takich jak przełyk, serce, nerki, mięśnie. U pozostałych pacjentów z SSc progresję zmian narządowych oceniono jako umiarkowaną. Charakterystykę kliniczną chorych z objawem Raynauda bez klinicznych objawów chorób tkanki łącznej i chorych z SSc podano w tab. 1.


Chorzy zakwalifikowani do badania stężenia sTNFαRI w surowicy nie byli wcześniej leczeni środkami immunosupresyjnymi i/lub steroidami. Próbę kontrolną stanowiły surowice 15 zdrowych osób, pracujących w klinice, dobranych odpowiednio pod względem płci i wieku.

Stężenie sTNFαRI w surowicy oznaczano metodą
ELISA, używając odczynników R&D Systems Europe Ltd.: Human Soluble Tumor Necrosis Factor a Receptor I,
Quantikine, zgodnie z zaleceniami producenta testu. Intensywność reakcji barwnej oceniano w czytniku ELISA przy długości fali 450 nm. Zakres pomiaru stężenia
sTNFαRI wynosił 7,8–500 pg/ml, czułość 2,5 pg/ml, surowicę rozcieńczano w stosunku 1:10. Wszystkie oznaczenia wykonywano w 2 powtórzeniach i do analizy statystycznej użyto wartości średnich.

Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej i scharakteryzowano za pomocą średniej arytmetycznej i odchylenia standardowego. Istotność statystyczną średnich arytmetycznych stężeń sTNFαRI między poszczególnymi badanymi grupami określano za pomocą testu
t-Studenta. Stosując analizę regresji za pomocą współczynnika korelacji prostoliniowej r, określano związek stężenia sTNFαRI z czasem trwania choroby i wskaźnikiem skin score. Wyniki oceniano jako znamienne statystycznie, gdy p<0,05.

Wyniki

W tab. 2. i na ryc. 1. przedstawiono stężenia sTNFαRI u chorych z SSc, izolowanym objawem Raynauda i w grupie kontrolnej.
Podwyższone stężenia sTNFαRI wykazano u 87,5% chorych z dSSc, 16,7% z ISSc, 13,3% chorych bez klinicznych objawów tkanki łącznej, w tym u 12,2% pacjentów, u których stwierdzono obecność przeciwciał przeciwjądrowych i/lub zmiany kapilaroskopowe, oraz u 7,1% chorych bez tych odchyleń. Średnie stężenie sTNFαRI u chorych bez klinicznych objawów chorób tkanki łącznej było znacząco podwyższone w porównaniu z grupą kontrolną (p<0,01), natomiast znacząco niższe w porównaniu z wartością w ISSc i dSSc (odpowiednio p<0,001 i p<0,0002). Średnie stężenie sTNFαRI u chorych z izolowanym objawem Raynauda, u których stwierdzono obecność przeciwciał przeciwjądrowych i/lub zmiany kapilaroskopowe, było wyższe niż w podgrupie chorych bez tych odchyleń, ale różnica ta nie była znamienna statystycznie. Średnie stężenie sTNFaRI u chorych z dSSc było istotnie statystycznie wyższe w porównaniu z ISSc, p<0,0002.
Stężenie sTNFαRI w podgrupach chorych z SSc w zależności od nasilenia progresji zmian narządowych przedstawiono na ryc. 2. Średnie stężenie sTNFαRI u chorych z SSc z szybką progresją zmian narządowych było znacząco wyższe niż u chorych, u których progresja była umiarkowana, p<0,02.
Stężenia sTNFαRI w zależności od czasu trwania objawu Raynauda u chorych bez klinicznych objawów chorób tkanki łącznej i w SSc zilustrowano na ryc. 3. i 4. W SSc obserwowano wyższe wartości sTNFαRI u chorych z krótszym czasem trwania objawu Raynauda, p<0,05.
Stężenie sTNFαRI u chorych z SSc zależnie od czasu utrzymywania się stwardnień skóry i wskaźnika skin score przedstawiono na ryc. 5. i 6. Stwierdzono istotną statystycznie korelację między stężeniem sTNFαRI w surowicy a wskaźnikiem skin score, p<0,05. Linijna analiza regresji i korelacji nie wykazała natomiast istotnych statystycznie zależności między stężeniem sTNFαRI w surowicy a czasem utrzymywania się stwardnień skóry.

Omówienie

TNF-α – białko o ciężarze cząsteczkowym 17 kDa – jest wielofunkcyjną cytokiną, która bierze udział w patogenezie licznych chorób zapalnych i autoimmunologicznych [16]. Receptory dla TNF-α stwierdza się w różnych tkankach, w tym w wątrobie, mięśniach, jelitach, nerkach, płucach i skórze [16]. Głównym celem działania TNF-α są komórki śródbłonka [16]. Do aktywacji śródbłonka dochodzi w wyniku interakcji TNF-α ze swoistymi receptorami, głównie z receptorem o masie 55 kDa (TNFαR typ I), w mniejszym stopniu z receptorem o masie 75 kDa (TNFαR typ II) [16]. Po związaniu TNF-α z receptorami błonowymi w wyniku proteolitycznego rozszczepienia części zewnętrznych tych receptorów powstają rozpuszczalne formy sTNFαRI i sTNFαRII [17]. W badaniach Gruschwitz i wsp. [18] stężenia sTNFαRI i sTNFαRII w surowicach chorych z SSc korelowały z ich ekspresją in situ w tkankach. W przeciwieństwie do skóry zdrowej i przewlekłej fazy włóknienia ekspresję TNFαRI, poza komórkami śródbłonka, wykazywało ponad 30% komórek okołonaczyniowych nacieków zapalnych. TNFαRII stwierdzono na prawie wszystkich limfocytach i w 30–50% komórek śródbłonka we wczesnych zmianach twardzinowych. Chociaż metodą immunohistochemiczną nie wykryto tych receptorów na fibroblastach, to stwierdzono swoisty mRNA na poziomie transkrypcji. Ekspresja sTNFαRI i sTNFαRII na komórkach jednojądrowych krwi obwodowej (ang. peripheral blood mononuclear cells
– PBMC) od chorych z SSc nie różniła się znacząco od kontroli. Stężenia sTNFαRI i sTNFαRII w surowicy korelowały z laboratoryjnymi i klinicznymi wskaźnikami stanu zapalnego i postępu choroby. Znaczenie sTNFαRI, jako parametru określającego aktywność i ciężkość SSc, potwierdziły także dalsze badania [12, 19–23]. W tym badaniu podwyższone stężenie sTNFαRI wykryto w surowicach chorych z objawem Raynauda bez klinicznych objawów chorób tkanki łącznej i u chorych z SSc w początkowym okresie jej rozwoju. U chorych z izolowanym objawem Raynauda obserwowano tendencję do wyższych wartości sTNFαRI w przypadkach z obecnością przeciwciał przeciwjądrowych w surowicy i zmianami kapilaroskopowymi. Wyniki te potwierdzają rolę TNF-α w patogenezie SSc. Poprzez aktywację chemokin i komórek śródbłonka cytokina ta może przyczyniać się do tworzenia okołonaczyniowych nacieków zapalnych i zaburzeń mikrokrążenia we wczesnym okresie rozwoju SSc [18, 24]. TNF-α stymuluje syntezę innych prozapalnych cytokin (IL-1, IL-8, IL-6, GMCSF), pobudza proliferację fibroblastów, zmniejsza aktywność metaloproteinaz macierzy, indukuje ekspresję ICAM-1, VCAM-1, E-selektyny na komórkach śródbłonka [8–10, 18, 24]. Cytokina ta pobudza także uwalnianie czynnika von Willebranda (vWF), który jest markerem uszkodzenia śródbłonka, oraz czynników wazokonstrykcyjnych endoteliny 1 (ET-1), szeregu produktów cyklooksygenazy (COX), m.in. trombosanu A2 [25–27]. TNF-α wpływa także na ekspresję śródbłonkowej syntetazy tlenku azotu, skracając jej czas półtrwania w komórkach śródbłonka [28]. Czynnik ten zwiększa zarówno proliferację, jak i apoptozę (aktywując kaspazę 3) w komórkach mięśni gładkich naczyń, tym
samym reguluje liczbę tych komórek [29]. TNF-α przy udziale innych cytokin i chemokin może odgrywać kluczową rolę w patogenezie objawu Raynauda związanego z chorobami tkanki łącznej, a szczególnie z SSc. sTNFαR pełnią prawdopodobnie rolę autokrynnych i parakrynnych inhibitorów TNF-α poprzez kompetycyjne wiązanie liganda TNF-α [17]. Wykazano jednak różne oddziaływanie krążących sTNFαR na śródbłonek. Podczas gdy stężenie sTNFαRI miało działanie ochronne i pozytywnie korelowało z śródbłonkowozależną fazą rozszerzenia naczyń, odwrotną korelację obserwowano odnośnie sTNFαRII, zwłaszcza u chorych z obniżoną tolerancją glukozy [30]. Stwierdzono także wpływ sTNFαRI na wzrost proliferacji komórek śródbłonka oraz związek wysokiego stężenia sTNFαRII z występowaniem choroby wieńcowej, opornością na insulinę i nadciśnieniem [31–33]. W przedstawionym badaniu, podobnie jak Wojas-Pelc i wsp. [21, 22] oraz Alekperow i wsp. [23], najwyższe stężenia sTNFαRI wykryto w dSSc i u chorych z szybką progresją zmian narządowych. Dodatkowo stwierdzono, że stężenie sTNFαRI w początkowej fazie rozwoju SSc koreluje dodatnio z wskaźnikiem nasilenia zmian twardzinowych skóry, tzw. skin score. Wyższe wartości sTNFαRI u chorych z SSc z krótszym czasem trwania objawu Raynauda potwierdzają wartość tego parametru klinicznego jako czynnika prognostycznego szybszej progresji choroby. Uzyskane wyniki wskazują na możliwość wykorzystania oznaczania stężenia sTNFαRI w ocenie aktywności i ciężkości SSc. Monitorowanie stężenia tego receptora może być także pomocne w określaniu ryzyka rozwoju SSc u chorych z objawem Raynauda.

Piśmiennictwo

1. Priollet P, Yayssairat M, Housset E. How to classify Raynaud’s phenomenon. Long-term follow-up study of 73 cases. Am
J Med 1987; 83: 494-8.

2. Kallenberg CG. Connective tissue disease in patients presenting with Raynaud’s phenomenon alone. Ann Rheum Dis 1991; 50: 666-7.

3. Ihata A, Shirai A, Okubo T, et al. Severity of seropositive isolated Raynaud’s phenomenon is associated with serological profile. J Rheumatol 2000; 27: 1686-92.

4. Spencer-Green G. Outcomes in primary Raynaud phenomenon: a meta-analysis of the frequency, rates, and predictors of transition to secondary diseases. Arch Intern Med 1998; 158: 595-600.

5. Silveri F, De Angelis R, Poggi A, et al. Relative roles of endothelial celi damage and platelet activation in primary Raynaud’s phenomenon (RP) and RP secondary to systemic sclerosis. Scand J Rheumatol 2001; 30: 290-6.

6. Lis-Święty A, Brzezińska-Wcisło L, Wcisło-Dziadecka D, Kulawik J. Badanie stężenia E-selektyny w surowicy u chorych z chorobą Raynauda i twardziną układową. Post Dermatol Alergol 2005; 5: 250-4.

7. Brevetti G, De Caterina M, Martone VD, et al. Measurement of soluble adhesion molecules in primary Raynaud’s phenomenon and in Raynaud’s phenomenon secondary to connective tissue diseases. Int J Clin Lab Res 2000; 30: 75-81.

8. Takehara K. Hypothesis: pathogenesis of systemic sclerosis. J Rheumatol 2003; 30: 755-9.

9. Sapadin AN, Esser AC, Fleischmajer R. Immunopathogenesis of scleroderma – evolving concepts. Mt Sinai J Med 2001; 68: 233-42.

10. Jimenez SA, Derk CT. Following the molecular pathways toward an understanding of the pathogenesis of systemic sclerosis. Ann Intern Med 2004; 140: 37-50.

11. Hebbar M, Gillot JM, Hachulla E, et al. Early expression of
E-selectin, tumor necrosis factor alpha and mast cell infiltration in the salivary glands of patients with systemic sclerosis. Arthritis Rheum 1996; 39: 1161-5.

12. Heilig B, Fiehn C, Brockhaus M, et al. Evaluation of soluble tumor necrosis factor (TNF) receptors and TNF receptor antibodies in patients with systemic lupus erythematodes, progressive systemic sclerosis, and mixed connective tissue disease. J Clin Immunol 1993; 13: 321-8.

13. Goodwin RG, Alderson MR, Smith CA, et al. Molecular and biological characterization of a ligand for CD27 defines a new family of cytokines with homology to tumor necrosis factor. Cell 1993; 73: 447-56.

14. Preliminary criteria for the classification of systemic sclerosis (scleroderma). Subcommittee for scleroderma criteria of the American Rheumatism Association Diagnostic and Therapeutic Criteria Committee. Arthritis Rheum 1980; 23: 581-90.

15. Clements PJ, Lachenbruch PA, Ng SC, et al. Skin score. A semiquantitative measure of cutaneous involvement that improves prediction of prognosis in systemic sclerosis. Arthritis Rheum 1990; 33: 1256-63.

16. Jacob CO. Tumor necrosis factor alpha in autoimmunity: pretty girl or old witch? Immunol Today 1992; 13: 122-5.

17. Olsson I, Gatanaga T, Gullberg U, et al. Tumour necrosis factor (TNF) binding proteins (soluble TNF receptor forms) with possible roles in inflammation and malignancy. Eur Cytokine Netw 1993; 4: 169-80.

18. Gruschwitz MS, Albrecht M, Yieth G, Haustein UF. In situ expression and serum levels of tumor necrosis factor-alpha receptors in patients with early stages of systemic sclerosis. J Rheumatol 1997; 24: 1936-43.

19. Lis-Święty A, Brzezińska-Wcisło L, Bergler-Czop B, Kamińska-Winciorek G. Badanie stężenia rozpuszczalnego receptora czynnika martwicy nowotworów a typu I w surowicy chorych z twardziną układową przed i po leczeniu immunosupresyjnym. Przegl Dermatol 2006; 93: 335-40.

20. Lis A, Brzezińska-Wcisło L. Rozpuszczalne receptory dla cytokin w surowicach chorych z twardziną układową – korelacje kliniczne. Wiad Lek 2003; 56: 532-6.

21. Majewski S, Wojas-Pelc A, Malejczyk M, et al. Serum levels of soluble TNF alpha receptor type I and the severity of systemic sclerosis. Acta Derm Venereol 1999; 79: 207-10.

22. Wojas-Pelc A, Majewski S, Malejczyk M, et al. Parametry odczynowości komórkowej w twardzinie układowej – korelacje kliniczne. Przegl Dermatol 1999; 86: 543-9.

23. Alekperov RT, Timchenko AV, Samsonov M, et al. Level of soluble tumor necrosis factor receptor type I in patients with systemic scleroderma. Ter Arkh 2004; 76: 11-5.

24. Sedgwick JD, Riminton DS, Cyster JG, Korner H. Tumor necrosis factor: a master-regulator of leukocyte movement. Immunol Today 2000; 21: 110-3.

25. Blann AD, Illingworth K, Jayson MI. Mechanisms of endothelial cell damage in systemic sclerosis and Raynaud’s phenomenon. J Rheumatol 1993; 20: 1325-30.

26. Mutschler D, Wikstrom G, Lind L, et al. Etanercept reduces late endotoxin-induced pulmonary hypertension in the pig.
J Interferon Cytokine Res 2006; 26: 661-7.

27. Rychlik-Golema W, Mastej K, Adamiec R. The role of endothelin-1 and selected cytokines in the pathogenesis of Raynaud’s phenomenon associated with systemic connective tissue diseases. Int Angiol 2006; 25: 221-7.

28. Martens FM, Rabelink TJ, Roodt J, et al. TNF-alpha induces endothelial dysfunction in diabetic adults, an effect reversible by PPAR-gamma agonist pioglitazone. Eur Heart J 2006; 27: 1605-9.

29. Groves J, Wang Z, Newman WH. Two distinct phenotypes of rat vascular smooth muscle cells: growth rate and production of tumor necrosis factor-alpha. Am Surg 2005; 71: 546-51.

30. Esteve E, Castro A, Lopez-Bermejo A, et al. Divergent relationship among soluble tumor necrosis factor-alpha receptors
1 and 2, insulin resistance, and endothelial function. Diabetes Care 2006; 29: 1460-1.

31. Sugano M, Tsuchida K, Tomita H. Increased proliferation of
endothelial cells with overexpression of soluble TNF-alpha
receptor I gene. Atherosclerosis 2002; 162: 77-84.

32. Benjafield AV, Wang XL, Moris BJ. Tumor necrosis factor alpha receptor 2 gene (TNFRsF1b) in genetic basis of coronary artery disease. J Mol Biol 2001; 79: 1000-115.

33. Fernandez-Real JM, Lainez B, Yendreal J, et al. Shedding of TNF-alpha receptors, blood pressure, and insulin sensitivity in type 2 diabetes mellitus. Am J Physiol Endocrinol Metabol 2002; 282: 952-9.