Original paper
Angiogenesis assessment in patients with mycosis fungoides

Wprowadzenie

Ziarniniak grzybiasty jest pierwotnie skórnym chłoniakiem, wywodzącym się z komórek T. W początkowej fazie, trwającej zwykle od kilku do kilkunastu lat, zmiany skórne są mało charakterystyczne, mogą naśladować ogniska rumieniowo-złuszczające w przebiegu wyprysku lub przyłuszczycy plackowatej, blaszki łuszczycowe, wykwity chorobowe w przebiegu świerzbu lub choroby Devergie [1].
Przyłuszczyce plackowate (parapsoriasis en plaques – PP) są grupą skórnych chorób limfoproliferacyjnych. W obrazie klinicznym odmiana wielkoogniskowa przypomina wczesne zmiany w przebiegu ziarniniaka grzybiastego (mycosis fungoides – MF), a w części przypadków w obrębie zmian skórnych w jej przebiegu dochodzi do rozwoju chłoniaka T-komórkowego, przede wszystkim MF. Istnieją także doniesienia o transformacji zmian skórnych w przebiegu PP drobnoogniskowej (palczastej), nieuważanej powszechnie za stan poprzedzający MF, w skórnego chłoniaka T-komórkowego [2]. Podobieństwo obrazu klinicznego, a także histopatologicznego zmian skórnych w przebiegu przyłuszczycy plackowatej i ziarniniaka grzybiastego [3], przy odmiennym rokowaniu, wiąże się z trudnościami w diagnostyce różnicowej i stwarza potrzebę odkrycia czynnika umożliwiającego różnicowanie obu jednostek chorobowych. Neoangiogeneza jest cechą charakterystyczną dla procesów nowotworowych. Autorzy w prezentowanej pracy podjęli próbę porównania procesu nowotworzenia naczyń w zmianach skórnych w przebiegu przyłuszczycy plackowatej wielkoogniskowej i ziarniniaka grzybiastego.

Materiał i metody

Za materiał do badań posłużyły bloczki parafinowe wycinków skórnych pobranych ze zmian chorobowych pobranych w znieczuleniu miejscowym od 56 chorych (24 kobiet i 32 mężczyzn) z MF. Uzyskano 22 preparaty od pacjentów z MF we wczesnym stadium choroby (MF IA–IIA), pozostałe 23 – ze zmian pobranych od chorych z zaawansowanym procesem rozrostowym (MF IIB–IV). Zbadano również preparaty pochodzące od 11 pacjentów (7 mężczyzn i 4 kobiety) z przyłuszczycą plackowatą wielkoogniskową (PP). Za grupę kontrolną posłużyły preparaty skóry zdrowej pobranej od 8 pacjentów operowanych na oddziale chirurgii plastycznej. Diagnozę postawiono na podstawie obrazu klinicznego oraz badań dodatkowych, w tym badania histopatologicznego i badań obrazowych. Stopień zaawansowania MF ustalono zgodnie z wytycznymi ISCL/EORTC [4]. Badanie uzyskało pozytywną opinię Komisji ds. Etyki Badań Akademii Medycznej we Wrocławiu. Wszyscy pacjenci wyrazili zgodę na udział w nim.
Preparaty zabarwiono eozyną–hematoksyliną i poddano ocenie histopatologicznej. Badania immunohistochemiczne wykonywano na skrawkach parafinowych grubości 5 mm, które umieszczono na szkiełkach silanizowanych (DAKO® nr kat. S 3003), a następnie skrawki odparafinowano w ksylenie i przeprowadzono przez szereg alkoholi o malejących stężeniach aż do wody. Antygeny tkanek utrwalonych w formalinie odkrywano w Target Retrieval Solution, pH 9, DAKO® nr kat. 3308, przez podgrzewanie w łaźni wodnej w temp. 96°C w czasie 20 min. Endogenną peroksydazę blokowano w 3-procentowym roztworze H₂O2 przez 5 min. Następnie na skrawki nanoszono pierwotne przeciwciała monoclonal Mouse anti human CD34clone: class II, QBEnd 10, firma DAKO® nr kat. N 1632, rozcieńczenie producenta, inkubacja 10 min w temperaturze pokojowej. Płukano w TBS i nakładano biotynylowane przeciwciało (LSAB® + Kit, DAKO K 0675) na 15 min. Reakcję immunocytochemiczną wywołano roztworem tetrachlorku 3,3’-diaminobenzydyny (DAB+, Liquid K 3486 DAKO). Następnie skrawki płukano w wodzie bieżącej i odwadniano w szeregu alkoholowym oraz ksylenie i zamykano w balsamie.
Ocenę ilościową ekspresji CD34 przeprowadzano w strefach na największej gęstości naczyń tzw. hot spots i wyrażano ją poprzez liczbę pojedynczych komórek lub grup komórek endotelialnych na 1 mm². W badaniach wykorzystano system analizy obrazu mikroskopowego Multiscan II (obiektyw Zeissa 40×, powiększenie końcowe wynosiło 400×). Analizy statystycznej dokonano przy użyciu testu t Studenta (za wartość statystycznie istotną uznano p < 0,05).

Wyniki

Badano ekspresję CD34 w komórkach śródbłonka naczyń skóry właściwej w obszarach objętych naciekiem limfocytarnym. Stwierdzono statystycznie istotną różnicę w ekspresji CD34 między grupą PP a grupą MF IIB–IV (p < 0,0001) (tab. 1.). Podobną różnicę zaobserwowano, porównując grupę MF IA–IIA i MF IIB–IV (p < 0,0001). Grupa chłoniaków w stadium zaawansowanym (MF IIB–IV) charakteryzowała się również znacząco większą gęstością mikronaczyń (microvascular density – MVC) niż w grupie osób zdrowych (p < 0,0001). Nie wykazano natomiast statystycznie istotnych różnic między grupami PP a MF IA–IIA, jak również między PP i MF IA–IIA a grupą kontrolną. Na ryc. 1., 2. przedstawiono przykładowy obraz ekspresji CD34 w obrębie zmiany skórnej w przebiegu MF.

Omówienie wyników

Nowotworzenie naczyń jest charakterystyczną cechą procesów rozrostowych. Szczególne znaczenie przypisuje się angiogenezie w przebiegu nowotworów bogato unaczynionych, takich jak rak prostaty czy sutka, oraz w rozrostach hematologicznych [5]. W dotychczas opublikowanych pracach wzrost gęstości mikronaczyń, wskazujący na nasiloną angiogenezę w obrębie badanej tkanki, jest zwykle złym czynnikiem prognostycznym w guzach litych, m.in. w raku sutka, jajnika, raku płuca [6, 7]. Wykazano, że wzmożona angiogeneza w obrębie ogniska pierwotnego w przebiegu raka przewodowego sutka sprzyja powstawaniu przerzutów do regionalnych węzłów chłonnych [8]. Znaczenie prognostyczne neoangiogenezy w przebiegu chłoniaków jest zróżnicowane w zależności od typu choroby [9]. Dotychczas opublikowano niewiele prac dotyczących nowotworzenia naczyń w pierwotnie skórnych chłoniakach T-komórkowych (CTCL) [10, 11]. Prace te obejmowały zwykle niewielkie grupy chorych, a ich wyniki wskazywały na istnienie dodatniej korelacji między neoangiogenezą i stopniem zaawansowania choroby.
W ocenie nowotworzenia naczyń wykorzystuje się wiele markerów angiogenezy, wśród których szczególną popularność zdobyły takie antygeny, jak CD31, CD34 czy czynnik VIII [12]. W ostatnich latach podejmowano próby porównania wyników badań nad neoangiogenezą w zmianach nowotworowych za pomocą omawianych znaczników [13, 14] i stwierdzono, że oznaczanie MVC metodą immunohistochemiczną z użyciem przeciwciała przeciwko CD34 charakteryzuje się największą czułością i detekcją większej liczby najdrobniejszych naczyń w obrębie tkanki nowotworowej [15].
Antygen CD34 jest powierzchniową glikoproteiną należącą do rodziny przezbłonowych białek sialomucynowych, biorącą udział w adhezji komórkowej. Białko CD34 ulega ekspresji na powierzchni komórek hematopoetycznych szpiku kostnego, komórek tucznych, komórek dendrytycznych, a także na powierzchni komórek progenitorowych śródbłonka i komórkach śródbłonka. Tę ostatnią cechę wykorzystuje się w ocenie angiogenezy (tzw. gęstości mikronaczyń). W prezentowanej pracy stwierdzono, że wzmożona neoangiogeneza jest cechą charakterystyczną zaawansowanego stadium MF i złym czynnikiem prognostycznym tej jednostki chorobowej. We wczesnych stadiach MF oraz w przebiegu PP nie odnotowano nasilonego procesu nowotworzenia naczyń, mierzonego metodą immunohistochemiczną przy użyciu przeciwciała przeciwko CD34, a otrzymane wyniki były porównywalne z wynikami uzyskanymi ze skóry zdrowej. Omawiany czynnik nie spełnia więc kryteriów markera różnicującego obie jednostki chorobowe.

Piśmiennictwo

1. Elmer KB, George RM. Cutaneous T-cell lymphoma presenting as benign dermatoses. Am Fam Phisician 1999; 59: 2809-13.
2. Belousova IE, Vanecek T, Samtsov AV, et al. A patient with clinicopathological features of small plaque parapsoriasis presenting later as plaque-stage mycosis fungoides: report of a case and comparative study of 27 of “nonprogressive” small plaque parapsoriasis. J Am Acad Dermatol 2008; 59: 474-82.
3. Reddy K, Bhawan J. Histologic mimickers of mycosis fungoides: a review. J Cutan Pathol 2007; 34: 519-25.
4. Olsen E, Vonderheid E, Pimpinelli N, et al. Revisions to the staging and classification of mycosis fungoides and Sezary syndrome: a proposal of the International Society for cutaneous Lymphomas (ISCL) and the cutaneous lymphoma task force of the European Organization of Research and Treatment of Cancer (EORTC). Blood 2007; 110: 1713-22.
5. Guinebretiere JM. Angiogenesis and breast neoplasms. The pathologist’s point of view. Gynecol Obstet Fertil 2005; 33: 140-6.
6. Uzzan B, Nicholas P, Cucherat M, Perret GY. Microvessel density as a prognostic factor In women with breast cancer: a systematic review of the literature and meta-analysis. Cancer Res 2004; 64: 2941-55.
7. Murri AM, Hilmy M, Bell J, et al. The relationship between the systemic inflammatory response, tumour proliferative activity, T-lymphocytic and macrophage infiltration, microvessel density and survival in patients with primary operable breast cancer. Br J Cancer 2008; 99: 1013-9.
8. Popiela TJ, Sikora J, Klimek M, et al. The analysis of CD34 immunoreactivity level in invasive ductal breast cancer with respect to the presence of lymph node metastases. Neuro Endocrinol Lett 2008; 29: 443-6.
9. Koster A, Raemaekers JM. Angiogenesis in malignant lymphomas. Curr Opin Oncol 2005; 17: 611-6.
10. Mazur G, Woźniak Z, Wróbel T, et al. Increased angiogenesis in cutaneous T-cell lymphomas. Pathol Oncol Res 2004; 10: 34-6.
11. Vacca A, Moretti S, Ribatti D, et al. Progression of mycosis fungoides is associated with changes in angiogenesis and expression of matrix metalloproteinases 2 and 9. Eur J Cancer 1997; 33: 1685-92.
12. Baluk P, McDonald DM. Markers of microscoping imaging of lymphangiogenesis and angiogenesis. Ann N Y Acad Sci 2008; 1131: 1-12.
13. Nico B, Benagiano V, Mangieri D, et al. Evaluation of microvascular density in tumours: pro and contra. Histol Histopathol 2008; 23: 601-7.
14. Norrby K, Ridell G. Tumour-type-specific capillary endothelial cell stainability in malignant B-cell lymphomas using antibodies against CD31, CD34 and Factor VIII. APMIS 2003; 111: 483-9.
15. Sasano H, Suzuki T. Pathological analysis of angiogenesis in human tumors. Biomed Pharmacother 2005; 59 (Suppl 2): 334-6.