Original paper
Estimation of bFGF and TGF-β1 sera concentrations in vitiligo patients – pilot study

Wprowadzenie
Bielactwo nabyte charakteryzuje się występowaniem na skórze wyraźnie odgraniczonych, różnej wielkości i kształtu odbarwionych plam, będących następstwem braku lub zmian strukturalnych melanocytów naskórka [1]. Melanocyty, odpowiadające za produkcję melaniny, są komórkami wywodzącymi się z grzebienia nerwowego, które w okresie życia płodowego wędrują wzdłuż całej długości cewy nerwowej i docelowo osiedlają się w warstwie podstawnej naskórka, mieszkach włosowych, błonie naczyniowej gałki ocznej, prążku naczyniowym ucha wewnętrznego oraz oponie miękkiej mózgu [2]. Etiopatogeneza bielactwa nie została dotychczas poznana, ale podkreśla się znaczenie czynników genetycznych, autoimmunologicznych, autocytotoksycznych, neurogennych [1]. W proliferacji melanocytów i melano-genezie ważną rolę odgrywa mikrośrodowisko naskórka. Uważa się, że keratynocyty i melanocyty tworzą czynnościowe i anatomiczne połączenie określane jako tzw. naskórkowa jednostka melaninowa (ang. epidermal melanin unit) [1, 3]. W prawidłowym jej funkcjonowaniu kluczowe znaczenie mają cytokiny, produkowane przez keratynocyty i fibroblasty, w tym czynniki wzrostowe, pobudzające proliferację komórek barwnikowych, takie jak czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i monocytów (GM-CSF), zasadowy fibroblastyczny czynnik wzrostowy (bFGF lub FGF-2), czynnik komórek macierzystych (SCF), endoteliny [3]. Melanocyty mają na powierzchni swoiste receptory FGFR-1 i c-kit, odpowiednio dla bFGF i SCF [4]. Z kolei parakrynnymi inhibitorami proliferacji melanocytów i melanogenezy są interleukiny 1a (IL-1a), 6 (IL-6), czynnik martwicy nowotworów a (TNF-α), transformujący czynnik wzrostu β (TGF-β) [3].
Cel pracy
W świetle rozbieżnych wyników dotyczących udziału bFGF i TGF-β1 w etiopatogenezie bielactwa nabytego, przeprowadzono własne oznaczenia tych cytokin.
Materiał i metody
Badaniem objęto 21 pacjentów z bielactwem nabytym, w tym 10 kobiet i 11 mężczyzn, w wieku 9–55 lat, hospitalizowanych w Klinice Dermatologii, Wenerologii i Dermatologii Dziecięcej Akademii Medycznej w Lublinie. Choroba trwała 2–20 lat. Wszyscy chorzy mieli rozsianą postać bielactwa. Grupę kontrolną stanowiło 17 zdrowych ochotników dobranych pod względem płci i wieku. Surowicę uzyskaną z krwi obwodowej pacjentów i osób z grupy kontrolnej przechowywano do czasu wykonania oznaczeń w temperaturze –70°C. Stężenie bFGF i TGF-β1 oznaczono metodą immunoenzymatyczną ELISA, używając odczynników R&D Systems Europe Ltd.: Human FGF Basic, Quantikine oraz Bender MedSystems GmbH, Europe: Human TGF-β1, Instant ELISA. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą programu Statistica. Uzyskane wyniki przedstawiono w postaci średniej arytmetycznej, odzwierciedlającej poziom przeciętny i odchylenia standardowego, mierzącego stopień rozproszenia pomiarów wokół średniej. Podano także wartości minimalne i maksymalne. W celu porównania różnic między grupą chorych a kontrolną wykorzystano test U Manna-Whitneya. Zależności uważano za istotne statystycznie przy p<0,05.
Wyniki
Stężenie bFGF w surowicy krwi obwodowej chorych z bielactwem wynosiło 5,347–26,400 pg/ml, średnio 9,4769±4,8497 pg/ml, natomiast w grupie kontrolnej 4,494–17,296 pg/ml, średnio 8,5733±3,6386 pg/ml (ryc. 1.). Analiza porównawcza powyższych wyników wykazała brak istotnej statystycznie różnicy między grupą chorych a kontrolną (p=0,587047). Stężenie TGF-β1 w surowicy krwi obwodowej chorych z bielactwem wynosiło 23,844–87,912 ng/ml, średnio 52,4931±17,7362 ng/ml, natomiast w grupie kontrolnej 7,140–71,312 ng/ml, średnio 44,6654±15,9378 ng/ml (ryc. 2.). Analiza porównawcza powyższych wyników wykazała brak istotnej statystycznie różnicy między grupą chorych a kontrolną (p=0,181621).
Omówienie wyników
Wpływ bFGF oraz TGF-β na proliferację melanocytów i melanogenezę oraz ich udział w etiopatogenezie bielactwa nabytego nie jest do końca wyjaśniony w piśmiennictwie. bFGF jest czynnikiem wzrostowym działającym mitogennie i angiogennie na różne rodzaje komórek pochodzących z mezodermy i ektodermy. Istnieją 4 izoformy bFGF o masach cząsteczkowych 18, 22, 23, 24 kD. Większość badań dotyczy izoformy o masie cząsteczkowej 18 kD, która wywiera działanie biologiczne, wiążąc się z receptorem FGFR. Wydzielany przez keratynocyty i fibroblasty bFGF jest niezbędny do prawidłowego funkcjonowania melanocytów. W warunkach fizjologicznych komórki barwnikowe nie mają zdolności produkowania bFGF, natomiast jest on wytwarzany przez komórki czerniaka i znamion dysplastycznych. Zablokowanie syntezy i działania bFGF w linii komórek czerniaka prowadzi do zahamowania wzrostu guza [4, 5]. Zaobserwowano, że bFGF pobudza migrację i proliferację melanocytów, tym samym może odgrywać ważną rolę w procesie repigmentacji przy współudziale wielu innych cytokin wydzielanych przez keratynocyty i fibroblasty, takich jak leukotrien C4 (LTC4), D4 (LTD4), endotelina 1 (ET-1), czynnik komórek macierzystych (SCF), wątrobowy czynnik wzrostu (HGF), melanotropina, czynnik wzrostu naskórka (EGF) czy płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF) [2]. Badania histopatologiczne ujawniły, że w obrębie plam bielaczych brak jest aktywnych melanocytów albo są one uszkodzone. Zaobserwowano, że w środkowej i dolnej części pochewki zewnętrznej mieszka włosowego pozostają niedojrzałe melanocyty, charakteryzujące się brakiem aktywności enzymatycznej, tzw. DOPA-negative. Podczas remisji choroby dochodzi do aktywacji, proliferacji i migracji melanocytów, co klinicznie ujawnia się pojawieniem okołomieszkowych wysp repigmentacji [2]. Ponadto badania za pomocą mikroskopu elektronowego ujawniły, że w bielactwie dochodzi do zmian strukturalnych keratynocytów o charakterze zwyrodnienia wodniczkowego, obrzmienia organelli i zagęszczenia cytoplazmy. Sugeruje to, że w patogenezie choroby istotną rolę może odgrywać zaburzenie homeostazy cytokin w obrębie naskórkowej jednostki melaninowej, które prowadzi do nasilenia apoptozy melanocytów [6]. Potwierdza to opisywana u chorych z bielactwem zmniejszona ekspresja chroniących przed apoptozą białek Bcl-2 i p53, przy jednoczesnym wzroście białek Bax, FLIP, kaspazy 3, 8, 9, wykazujących przeciwstawne działanie [7]. Badania przeprowadzone przez Horikawa i wsp. [8] wskazują, że czynniki mitogenne, takie jak bFGF, ET-1, SCF oraz LTC4, indukują chemokinezę i chemotaksję melanocytów. Podobne wyniki przedstawili Zhang i wsp. [9], którzy w badaniu in vitro na pożywkach z fibronektyną zaobserwowali, że bFGF zwiększa przyleganie i migrację melanocytów. Ostatnie doniesienia opublikowane przez Wu i wsp. [10] sugerują, że w hodowli keratynocytów dochodzi do zwiększenia uwalniania bFGF pod wpływem naświetlań wąskopasmowym promieniowaniem UVB (NB UVB) o długości 311 nm, uznawanym obecnie za najbardziej skuteczną metodę leczenia bielactwa [1]. Ponadto stwierdzono, że za migrację melanocytów może częściowo odpowiadać zwiększona pod wpływem czynników mitogennych ekspresja p125FAK (ang. phosphorylated focal adhesion kinase) na melanocytach [11]. Na podstawie powyższych wyników badań część autorów sugeruje możliwość zastosowania bFGF w leczeniu bielactwa. Z kolei Bradford i wsp. [12] potwierdzają, że bFGF wprawdzie stymuluje proliferację komórek barwnikowych, ale jednocześnie wywiera działanie hamujące na melanogenezę, zależnie od dawki. Dane z piśmiennictwa sugerują ponadto, że do wystąpienia repigmentacji konieczne są morfologiczne i funkcjonalne zmiany w melanocytach oraz działanie wielu innych czynników, takich jak białko macierzy zewnątrzkomórkowej – kolagen typu IV oraz różne receptory integryn, które warunkują migrację komórek [8]. Sprzeczne dane prezentują Edmondson i wsp. [13], którzy uważają, że keratynocyty wydzielają bFGF w zbyt małym stężeniu, aby pobudzać proliferację melanocytów [3, 18]. Na podstawie badań in vivo zakładają oni, że bFGF zwiększa liczbę melanocytów jedynie w obecności hormonu wzrostu i/lub insulinowego czynnika wzrostu (IGF-1). Jeszcze inne wyniki prezentują Ozdemir i wsp. [14], którzy wykazali, że u pacjentów z bielactwem stężenie bFGF w surowicy jest wyższe istotnie statystycznie niż u zdrowych (p<0,001), co wg autorów odpowiada za hamowanie melanogenezy. Badania przeprowadzone przez Yanga i wsp. [15] wskazują, że usunięcie bFGF z hodowli melanocytów zmniejsza cytotoksyczny wpływ 4-TBP (ang. 4-tertiary butylphenol). Sugeruje to, że bFGF zwiększa wrażliwość melanocytów na toksyczny wpływ 4-TBT, a tym samym może odgrywać rolę w patogenezie bielactwa. Moretti i wsp. [3] przeprowadzili badania immunohistochemiczne mające na celu porównanie ekspresji różnych cytokin w obrębie plam bielaczych, skóry na granicy odbarwień oraz skóry niezmienionej. Autorzy zaobserwowali w obrębie plam bielaczych znaczne obniżenie ekspresji cytokin stymulujących komórki barwnikowe – GM-CSF, SCF i bFGF. Przeciwnie badacze donoszą o wysokim stężeniu IL-6, TNF-α o działaniu hamującym na melanogenezę w obrębie odbarwionych zmian. Ponadto niezależnie od miejsca pobrania wycinka skóry obserwowano bardzo niską aktywność TGF-β. TGF-β tworzy rodzinę białek wywierającą wielokierunkowe działanie, odpowiadając za proliferację, różnicowanie i apoptozę komórek [16]. W skórze właściwej zwiększa odkładanie macierzy międzykomórkowej oraz pobudza angiogenezę w procesie gojenia ran. W naskórku hamuje wzrost komórek, biorąc tym samym udział w homeostazie tkankowej [17]. TGF-β produkowany przez pobudzone keratynocyty jest czynnikiem o silnych właściwościach immunosupresyjnych. Hamuje proliferację limfocytów T i B oraz aktywność komórek NK [18]. Uważa się, że w obrębie plam bielaczych zmniejszona jest liczba regulatorowych limfocytów T CD25+ (T regs), które produkują IL-10 i TGF-β. Brak tych immunosupresyjnych cytokin umożliwia proliferację i migrację limfocytów T cytotoksycznych, prowadząc do depigmentacji [19]. Część autorów sugeruje, że właściwości immunosupresyjne cytokin TGF-β i IL-10 można w przyszłości wykorzystać w leczeniu bielactwa [20]. Odmienny pogląd przedstawili Alanko i Saksela [17], którzy wykazali, że TGF-β może wywierać działanie proapoptotyczne w stosunku do melanocytów. W warunkach prawidłowych produkowane przez keratynocyty warstwy podstawnej czynniki wzrostowe, takie jak bFGF oraz czynnik wzrostu nerwów, chronią melanocyty przed apoptozą indukowaną TGF-β. TGF-β pobudza ERK (ang. extracellular signal-regulated kinase), co także może przyczynić się do hamowania melanogenezy [16]. Wielu autorów mimo prezentowanych rozbieżnych wyników jest zgodnych, że bFGF i TGF-β1 odgrywają rolę w patogenezie bielactwa. Brak w piśmiennictwie jednoznacznych wniosków skłonił autorów do przeprowadzenia oznaczeń stężenia tych cytokin w surowicy pacjentów z bielactwem. W przeprowadzonych oznaczeniach nie obserwowano istotnej statystycznie różnicy w stężeniach bFGF i TGF-β między grupą badaną i kontrolną. Może to wynikać ze zbyt małej liczby przebadanych chorych, różnic dotyczących wieku pacjentów, długości trwania bielactwa i mogącym stąd wynikać stopniu aktywności choroby. Autorzy uważają, że bFGF i TGF-β odgrywają rolę w patogenezie bielactwa, a badanie należy traktować jako pilotażowe, stanowiące fragment dalszej całości. Stosowane dotychczas metody leczenia bielactwa, tj. fototerapia, preparaty miejscowe, przynoszą jedynie krótkie okresy remisji i częściową poprawę zmian skórnych. Lepsze poznanie mechanizmów patogenetycznych w bielactwie ułatwi opracowanie nowych metod terapeutycznych, którymi może okazać się wykorzystanie działania mitogennego bFGF i immunosupresyjnego TGF-β.
Piśmiennictwo
1. Placek W. Bielactwo nabyte. Przegl Dermatol 2006; 93: 629-36. 2. Yu HS. Melanocyte destruction and repigmentation in vitiligo: a model for nerve cell damage and regrowth. J Biomed Sci 2002; 9: 564-73. 3. Moretti S, Spallanzani A, Amato L, et al. Vitiligo and epidermal microenvironment: possible involvement of keratinocyte-derived cytokines. Arch Dermatol 2002; 138: 273-4. 4. Giehl KA, Nägele U, Volkenandt M, Berking C. Protein expression of melanocyte growth factors (bFGF, SCF) and their receptors (FGFR-1, c-kit) in nevi and melanoma. J Cutan Pathol 2007; 34: 7-14. 5. Nesbit M, Nesbit HK, Bennett J, et al. Basic fibroblast growth factor induces a transformed phenotype in normal human melanocytes. Oncogene 1999; 18: 6469-76. 6. Moretti S, Spallanzani A, Amato L, et al. New insights into the pathogenesis of vitiligo: imbalance of epidermal cytokines at sites of lesions. Pigment Cell Res 2002; 15: 87-92. 7. Dell’anna ML, Picardo M. A review and a new hypothesis for non-immunological pathogenetic mechanisms in vitiligo. Pigment Cell Res 2006; 19: 406-11. 8. Horikawa T, Norris DA, Yohn JJ, et al. Melanocyte mitogens induce both melanocyte chemokinesis and chemotaxis. J Invest Dermatol 1995; 104: 256-9. 9. Zhang XQ, Feng J, Mou KH, et al. Effects of bFGF and alpha-MSH on adhesion and migration of human melanocytes in vitro. Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban 2006; 35: 161-4. 10. Wu CS, Yu CL, Wu CS, et al. Narrow-band ultraviolet-B stimulates proliferation and migration of cultured melanocytes. Exp Dermatol 2004; 13: 755-63. 11. Wu CS, Lan CC, Chiou MH, Yu HS. Basic fibroblast growth factor promotes melanocyte migration via increased expression of p125 (FAK) on melanocytes. Acta Derm Venereol 2006; 86: 498-502. 12. Bradford CS, Sun L, Barnes DW. Basic fibroblast growth factor stimulates proliferation and suppresses melanogenesis in cell cultures derived from early zebrafish embryos. Mol Mar Biol Biotechnol 1994; 3: 78-86. 13. Edmondson SR, Russo VC, McFarlane AC, et al. Interactions between growth hormone, insulin-like growth factor I, and basic fibroblast growth factor in melanocyte growth. J Clin Endocrinol Metab 1999; 84: 1638-44. 14. Ozdemir M, Yillar G, Wolf R, et al. Increased basic fibroblast growth factor levels in serum and blister fluid from patients with vitiligo. Acta Derm Venereol 2000; 80: 438-9. 15. Yang F, Abdel-Malek Z, Boissy RE. Effects of commonly used mitogens on the cytotoxicity of 4-tertiary butylphenol to human melanocytes. In Vitro Cell Dev Biol Anim 1999; 35: 566-70. 16. Kim DS, Park SH, Park KC. Transforming growth factor-beta1 decreases melanin synthesis via delayed extracellular signal-regulated kinase activation. Int J Biochem Cell Biol 2004; 36: 1482-91. 17. Alanko T, Saksela O. Transforming growth factor beta 1 induces apoptosis in normal melanocytes but not in nevus cells grown in type I collagen gel. J Invest Dermatol 2000; 115: 286-91. 18. Jakóbisiak M, Gołąb J, Zagożdżon R. Cytokiny. W: Immunologia. Kruczyńska K (red.), PWN, Warszawa 1998; 263-86. 19. Oyarbide-Valencia K, van den Boorn JG, Denman CJ, et al. Therapeutic implications of autoimmune vitiligo T cells. Autoimmun Rev 2006; 5: 486-92. 20. Shahmoradi Z, Darougheh A, Misaghian S. Association of alopecia universalis, generalized vitiligo and Graves’disease. J Res Med Scien 2005; 10: 398-400.