Artykuł oryginalny
Wątrobowa aktywność wydzielnicza greliny u chorych z przewlekłym wirusowym zapaleniem wątroby

Wstęp
Grelina jest 28-aminokwasowym peptydem będącym ligandem sekrecyjnego receptora hormonu wzrostu (GHS-R). Głównym miejscem syntezy greliny są komórki neuroendokrynne dna i trzonu żołądka [1, 2], a miejscem degradacji – nerki, wątroba i żołądek [3, 4]. Dotychczasowe dane literaturowe, przedstawiające zmiany poziomu greliny w schorzeniach wątroby, dotyczą opisu zwiększonego stężenia tego hormonu w osoczu w niewyrównanej marskości wątroby [4]. W pierwotnej marskości żółciowej wątroby zwiększa się stężenie leptyny – odpowiadającej za stymulację prozapalnych cytokin i katabolizm – a obniża się stężenie greliny [5]. Grelina uczestniczy wraz z insuliną, leptyną, adiponektyną oraz rezystyną w regulacji bilansu energetycznego organizmu. Ośrodkowe oddziaływanie w zakresie podwzgórza jest przeciwstawne do leptyny i prowadzi do zwiększonego przyjmowania pokarmów [6]. Marchesini i wsp. [7] obserwowali wzrost poziomu greliny u pacjentów z uszkodzeniem wątroby, który tłumaczyli kompensacyjnym mechanizmem zapobiegającym pogłębianiu ujemnego bilansu energetycznego. W pierwotnym raku wątroby [4] obniżony poziom greliny jest odwrotnie skojarzony z poziomem alfa fetoproteiny i interpretowany jako przyczyna zespołu anoreksyjno-kachektycznego. Zmiany w zakresie tkanki tłuszczowej występujące pod wpływem greliny nie wynikają tylko ze zwiększenia podaży energetycznej wywołanej zmianą zachowań, ale dotyczą także jej bezpośredniego oddziaływania na gospodarowanie zasobami energetycznymi tkanki tłuszczowej, mięśni i wątroby [7–9]. W niealkoholowym stłuszczeniu wątroby postulowany jest związek obniżenia poziomu osoczowej greliny z występującą w tym schorzeniu insulinoopornością [10]. Grelina to hormon szeroko rozpowszechniony w organizmie. Ekspresję mRNA tego peptydu stwierdza się w większości tkanek, w tym także w wątrobie [11]. Tak szerokie rozpowszechnienie tego związku nie znalazło wytłumaczenia w dotychczasowych publikacjach i pozostaje przedmiotem dalszych badań. Podtyp 1a GHS-R ma największą ekspresję w przednim płacie przysadki (ten rodzaj receptora nie jest stwierdzany w miąższu wątroby). Podtyp 1b GHS-R występuje w większości tkanek, w tym także w wątrobie, ale jego funkcja nie jest znana. Przyjmuje się możliwość istnienia większej liczby podtypów receptorów GHS-R [11]. Podsumowując wyniki dotychczasowych prac, należy stwierdzić, że odnoszą się one do oceny poziomu greliny w osoczu krwi, potwierdzając jej związek z zaburzeniami funkcji i metabolizmu wątroby, dokumentują także syntezę badanego związku wraz z obecnością niektórych podtypów receptora sekrecyjnego hormonu wzrostu w obrębie miąższu wątroby.
Cel pracy
Celem pracy była ocena metabolizmu greliny w wątrobie. Realizacja zamierzenia opierała się na określeniu stężenia oraz wydzielania podstawowego i stymulowanego greliny w tkankach wątroby i żołądka. Porównanie przemian hormonu w obu narządach wynika z dokładniejszego zdefiniowania roli żołądka w metabolizmie greliny, będącego jej głównym źródłem w tkankach obwodowych.
Materiał i metody
Badaniem objęto 11 chorych z przewlekłym wirusowym zapaleniem wątroby typu B i C, w wieku od 20 do 56 lat, u których wykonano biopsję wątroby wg Menghiniego oraz gastroskopię ze wskazań klinicznych. Źródłem materiału tkankowego do badań były wycinki wątroby oraz błony śluzowej dna i trzonu żołądka. Do oznaczania stężeń tkankowych badane próbki zamrażano w temperaturze –75°C i przechowywano do czasu dalszej analizy. Wycinki ważono i homogenizowano w buforze fosforanowym o pH 7,1, a następnie wirowano z prędkością 4000 obrotów/min przez 5 min i oddzielano nadsącz, w którym oznaczano poziom greliny. Wydzielanie in vitro greliny z tkanek przeprowadzono wg metody Kowalskiego i Girauda [12]. Bezpośrednio po pobraniu wycinki ważono i cięto przy użyciu mikrotomu na skrawki, które umieszczano w plastikowych naczynkach z nylonową siatką zamiast dna. Naczynka umieszczano w studzienkach inkubacyjnych zawierających 1,5 ml buforu Krebsa z dodatkiem BSA (albumina bydlęca) w temperaturze 39–40°C, pozwalając na stabilizację wydzielania. Po okresie stabilizacji przystępowano do właściwej inkubacji, przekładając naczynka z tkankami do kolejnych studzienek wg schematu: A – 10 min Krebs (stabilizacja, określenie wydzielania podstawowego), B – 10 min Krebs, C – 10 min Krebs z dodatkiem in vitro greliny, D – 10 min Krebs, E – 10 min Krebs, F – 10 min Krebs z dodatkiem in vitro naltreksonu, G – 10 min Krebs i H – 10 min Krebs. Po zakończeniu inkubacji ze wszystkich studzienek pobierano 1 ml medium inkubacyjnego i do momentu oznaczania ilości wydzielonej greliny zamrażano je, i przechowywano w temperaturze –20°C. Oznaczanie poziomu wydzielonej greliny w medium inkubacyjnym oraz stężenia greliny w tkankach przeprowadzono metodą radioimmunologiczną za pomocą zestawów Ghrelin (Total) firmy LINCO Research (USA), gdzie jako znacznik wykorzystano 125I oraz swoiste przeciwciała dla greliny. Do oznaczania pobierano 100 µl nadsączu z homogenatu tkanki lub 200 µl liofilizatów z medium inkubacyjnego rozpuszczonych w buforze. W drugim dniu badania do wszystkich próbek dodawano znakowaną 125I grelinę, po czym inkubowano je przez 24 godz. w temperaturze 4°C. W trzecim dniu dodawano odczynnik do precypitacji i inkubowano 20 min w temperaturze 4°C. Próbki wirowano przy 2000–3000 × γ w temperaturze 4°C przez 20 min. Następnie próbki dekantowano, a radioaktywność mierzono w liczniku promieniowania g. Poziom greliny w badanych próbkach określano w oparciu o krzywą standardową. Standard greliny był wyznaczany przez korelację różnych stężeń tego związku i jego radioaktywność. Wyniki stężenia greliny w wątrobie i żołądku przedstawiono w pikogramach w przeliczeniu na 1 mg białka tkanki. Analizę statystyczną stężeń greliny w miąższu wątroby i śluzówce żołądka oraz w nadsączu w następstwie wydzielania podstawowego i stymulowanego naltreksonem w związku z rozkładem odbiegającym od normalnego przeprowadzono w oparciu o test nieparametryczny U Manna-Whitneya, a w przypadku stymulacji greliną przy rozkładzie normalnym w oparciu o test t-Studenta. Jako istotne statystycznie przyjęto wartości p<0,05.
Wyniki
Statystycznie istotna różnica (p=0,006) stwierdzona została pomiędzy rozkładem wartości stężenia greliny w śluzówce żołądka oraz wątroby, z medianą 100 pg w żołądku i 5 pg w wątrobie w przeliczeniu na 1 mg białka w próbce (ryc. 1.). Wydzielanie podstawowe oraz stymulowane greliny nie wykazało statystycznie istotnego zróżnicowania w materiale tkankowym wątroby i żołądka (ryc. 2.–4.).
Omówienie
Komórki błony śluzowej dna i trzonu żołądka są źródłem ok. 65% krążącej greliny, która drogą endokrynną przez modulowanie ośrodków podwzgórzowych kształtuje zachowania zwiększające przyjmowanie pokarmów [13]. Do czynników hamujących syntezę tego hormonu należą glukoza lub tłuszcze wprowadzane drogą pokarmową bądź parenteralną [14]. Uwalnianie greliny jest zróżnicowane w zakresie płci; w modelu zwierzęcym u samic cechuje się względnie stałym poziomem wydzielania, u samców ma charakter pulsacyjny [15]. Rola greliny w fizjologii żołądka łączy się ze stymulacją motoryki i opróżniania tego narządu, a także zwiększaniem wydzielania kwasu żołądkowego [16, 17]. Równocześnie stwierdzany jest silny gastroprotekcyjny efekt, zapobiegający występowaniu uszkodzeń indukowanych etanolem, prawdopodobnie w mechanizmie zależnym od uwalniania tlenku azotu [18]. Niewiele wiadomo o efektach metabolicznych działania greliny w następstwie stymulacji receptorów obwodowych GHS-R. W wątrobie grelina indukuje ekspresję genów odpowiadających za stymulację lipogenezy i glukogenezy, z redukcją utleniania kwasów tłuszczowych i zwiększeniem zawartości trójglicerydów [19]. Szeroka dystrybucja badanego związku w tkankach obwodowych wskazuje na jego istotną biologicznie funkcję. Źródła wątrobowej greliny pozostają nieznane. Jej obecność może łączyć się z regulacją przedstawionych powyżej procesów metabolicznych, degradacją greliny pochodzącej z osocza krwi. W przypadku analizowanego materiału dotyczącego chorych z przewlekłym zapaleniem, grelina może pochodzić z komórek immunologicznych nacieku zapalnego [20]. Dwudziestokrotnie większe stężenie greliny w śluzówce żołądka w stosunku do miąższu wątroby wskazuje na dominującą rolę żołądka jako głównego źródła tego hormonu (ryc. 1.). Otrzymane wyniki potwierdzają obecność greliny w miąższu wątroby, z wydzielaniem in vitro spoczynkowym i w następstwie stymulacji czynnikami potencjalnie pobudzającymi lub hamującymi, niższymi, ale statystycznie nieistotnymi w stosunku do śluzówki dna i trzonu żołądka (ryc. 2.–4.). Wyniki niniejszej pracy stanowią podstawę do dalszych badań, umożliwiających poznanie i przeciwdziałanie zaburzeniom metabolicznym oraz niedoborom żywieniowym rozwijającym się w chorobach wątroby.
Wnioski
Tkanka wątrobowa wykazuje 20-krotnie niższe stężenie greliny niż tkanki żołądka. Wydzielanie podstawowe greliny oraz w następstwie stymulacji czynnikami potencjalnie hamującymi lub pobudzającymi jest zbliżone w obu badanych tkankach.
Piśmiennictwo
1. Tomasetto C, Wendling C, Rio MC i wsp. Identification of cDNA encoding motilin related peptide/ghrelin precursor from dog fundus. Peptides 2001; 22: 2055-9. 2. De Vriese C, Gregoire F, Lema-Kisoka R i wsp. Ghrelin degradation by serum and tissue homogenates: identification of the cleavage sites. Endocrinology 2004; 145: 4997-5005. 3. Wu R, Zhou M, Cui X i wsp. Ghrelin clearance is reduced at the late stage of polymicrobial sepsis. Int J Mol Med 2003; 12: 777-81. 4. Tacke F, Brabant G, Kruck E i wsp. Ghrelin in chronic liver disease. J Hepatol 2003; 38: 447-54. 5. Breidert M, Zimmermann TF, Schneider R i wsp. Ghrelin/Leptin-imbalance in patients with primary biliary cirrhosis. Exp Clin Endocrinol Diabetes 2004; 112: 123-6. 6. Meier U, Gressner AM. Endocrine regulation of energy metabolism: review of pathobiochemical and clinical chemical aspects of leptin, ghrelin, adiponectin, and resistin. Clin Chem 2004; 50: 1511-25. 7. Marchesini G, Bianchi G, Lucidi P i wsp. Plasma ghrelin concentrations, food intake, and anorexia in liver failure. J Clin Endocrinol Metab 2004; 89: 2136-41. 8. Nieminen P, Mustonen AM. Effects of peripheral ghrelin on the carbohydrate and lipid metabolism of the tundra vole (Microtus oeconomus). Gen Comp Endocrinol 2004; 138: 182-7. 9. Mustonen AM, Nieminen P, Hyvarinen H. Leptin, ghrelin, and energy metabolism of the spawning burbot (Lota lota, L.). J Exp Zool 2002; 293: 119-26. 10. Marchesini G, Pagotto U, Bugianesi E i wsp. Low ghrelin concentrations in nonalcoholic fatty liver disease are related to insulin resistance. J Clin Endocrinol Metab 2003; 88: 5674-9. 11. Gnanapavan S, Kola B, Bustin SA i wsp. The tissue distribution of the mRNA of ghrelin and subtypes of its receptor, GHS-R, in humans. J Clin Endocrinol Metab 2002; 87: 2988. 12. Kowalski C, Giraud P. Dopamine decreased striatal enkephalin turnover and proenkephalin messenger RNA abundance via D2 receptor activation in primary striatal cell cultures. Neuroscience 1993; 53: 665-72. 13. Dockray GJ. Gastrointestinal Hormones: Gastrin, Cholecystokinin, Somatostatin, and Ghrelin. W: Physiology of the Gastrointestinal Tract. Johnson LR, Barrett KE, Ghishan FK i wsp. (red.). Elsevier Academic Press. USA 2006; 91-120. 14. Shiiya T, Nakazato M, Mizuta M i wsp. Plasma ghrelin levels in lean and obese humans and the effect of glucose on ghrelin secretion. J Clin Endocrinol Metab 2002; 87: 240-4. 15. Liu YL, Yakar S, Otero-Corchon V i wsp. Ghrelin gene expression is age-dependent and influenced by gender and the level of circulating IGF-1. Mol Cell Endocrinol 2002; 189: 97-103. 16. Masuda Y, Tanaka T, Inomata N i wsp. Ghrelin stimulates gastric acid secretion and motility in rats. Biochem Biophys Res Commun 2000; 276: 905-8. 17. Sibilia V, Pagani F, Guidobono F i wsp. Evidence for a central inhibitory role of growth hormone secretagogues and ghrelin on gastric acid secretion in conscious rats. Neuroendocrinology 2002; 75: 92-97. 18. Sibilia V, Rindi G, Pagani F i wsp. Ghrelin protects against ethanol-induced gastic ulcers in rats: studies on mechanisms of action. Endocrinology 2003; 144: 353-9. 19. Barazzoni R, Bosutti A, Stebel M i wsp. Ghrelin regulates mitochondrial-lipid metabolism gene expression and tissue fat distribution in liver and skeletal muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab 2005; 288: E228-35. 20. Hattori N, Saito T, Yagyu T i wsp. GH, GH receptor, GH secretagogue receptor, and ghrelin expression in human T cells, B cells, and neutrophils. J Clin Endocrinol Metab 2001; 86: 4284-91.