BADANIA KLINICZNE I DOŚWIADCZALNE W CHOROBACH SERCA, PŁUC I NACZYŃ
A novel method for isolation of endothelial progenitor cells for cardiac stem cell therapy

Wstęp
Transplantacja komórek macierzystych stanowi obiecującą metodę leczenia w terapii choroby niedokrwiennej serca i profilaktyce przewlekłej niewydolności serca [1], ponieważ transplantowane komórki macierzyste są zdolne różnicować się w kardiomiocyty i dojrzałe komórki endotelialne oraz mogą indukować regenerację mięśnia sercowego poprzez mechanizmy parakrynne [2]. W naszym badaniu podaliśmy dosercowo endotelialne komórki progenitorowe (EPCs). Są to dojrzałe komórki, które mogą być izolowane ze szpiku kostnego, krwi obwodowej lub pępowinowej oraz tkanki tłuszczowej [3]. Komórki te mają zdolność proliferacji, samopona-wiania się, różnicowania się w endotelialną linię komórkową oraz wykazują oporność na zmiany środowiskowe [4]. W ostatnich latach celem przewodnim badań zdaje się być izolacja optymalnego typu komórek do transplantacji komórkowej. Do klasycznych metod izolacji EPCs należy m.in. metoda adherencyjna i negatywna selekcja. Jednak wystarczającą liczbę EPCs można uzyskać wy-łącznie w wyniku hodowli komórkowej na mediach z określonymi czynnikami wzrostu [5]. Zatem jest potrzebna szybka i skuteczna metoda do izolacji komórek macierzystych zarówno w celach terapeutycznych, jak i w inżynierii tkankowej. W ostatnich naszych badaniach opracowaliśmy szybką i skuteczną metodę bezpośredniej izolacji EPCs przy udziale aptamerów ze szpiku kostanego świń [6, 7]. W porównaniu z przeciwciałami aptamery wykazują wysokie powinowactwo, specyficzność i selektywność wiązania określo-nych cząsteczek docelowych, jak również nie wywołują odpowiedzi immunologicznej i są szybciej syntezowane, a ich biodostępność i farmakokinetyka może być modyfikowana [8]. Ze względu na korzystne właściwości i łatwy proces syntezy i selekcji aptamery znaj-dują zastosowanie w diagnostyce i terapii.

Cel pracy
Celem pracy było zbadanie wpływu EPCs, wyizolowanych przy udziale aptamerów, na unaczynienie i funkcję serca in vivo.

Materiał i metody
Charakterystyka ogólna projektu badawczego
Wszystkie badania zostały przeprowadzone zgodnie z rekomendacją Federacji Europejskiego Towarzystwa Badań na Zwierzę-tach Laboratoryjnych (FELASA) oraz zatwierdzone przez Komisję Etyczną do spraw Doświadczeń na Zwierzętach przy Uniwersyte-cie w Tuebingen. Zwierzęta były randomizowane do 4 grup. W grupie I (4 zwierzęta) został sztucznie wywołany zawał serca, na-tomiast w grupie II (u kolejnych 4 zwierząt) dodatkowo wstrzyknięto 0,9-procentowy roztwór NaCl w obszar zainicjowawnego zawału serca. Obydwie grupy służyły jako grupa kontrolna dla 2 grup badawczych (grupa III i IV). Przy czym w grupie III (6 zwie-rząt) podano dosercowo EPCs wyizolowane ze szpiku kostnego przy użyciu aptamerów, zaś w grupie IV (5 zwierząt) EPCs z krwi obwodowej, wyizolowane przy użyciu przeciwciał CD31. We wszystkich grupach przeprowadzono badanie echokardiograficzne w celu oceny frakcji wyrzutowej lewej komory serca (LVEF) przed zawałem serca oraz pooperacyjnie w tygodniowych odcinkach czasu. Po 4-tygodniowym okresie obserwacji zwierzęta zostały poddane eutanazji.

Izolacja i barwienie Epos
Przed interwencją chirurgiczną pobrano szpik kostny poprzez punkcję kości udowej w grupie III, a w grupie IV krew obwodową z żyły głównej doczaszkowej. Komórki szpiku i krwi obwodowej bezpośrednio po pobraniu izolowano metodą wirowania w gra-diencie gęstości na Histopaque 1.077 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Wyizolowane EPCs inkubowano z 5 mg M280 Streptavidin Dynabeads® (Invitrogen, D-Karlsruhe), które były pokryte 20 µl (100 µM) aptameru 36 albo przeciwciałami CD31 skierowanymi przeciwko EPCs, zgodnie z badaniami Hoffmanna i wsp. [7]. 4 × 107 komórek barwiono przyżyciowym barwnikiem fluorescencyj-nym PKH26 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA).

Sztuczne wywołanie zawału serca i transplantacja komórkowa
Interwencję chirurgiczną przeprowadzono w znieczuleniu ogólnym z intubacją dotchawiczą i wentylacją kontrolowaną objęto-ścią. Dostęp operacyjny uzyskano poprzez boczną torakotomię lewostronną. Sztuczny zawał serca wywołano poprzez podwiąza-nie pierwszej gałęzi diagonalnej odchodzącej od gałęzi międzykomorowej przedniej (LAD). W godzinnym odstępie czasu wstrzyk-nięto dosercowo 1 ml 0,9-procentowego NaCl (grupa II) albo 4 × 107 EPCs (grupa III i IV) w obrębie strefy granicznej niedokrwienia mięśnia sercowego.

Ocena histologiczna
Cztery tygodnie po zabiegu chirurgicznym zwierzęta poddano eutanazji poprzez podanie letalnej dawki NaCl, którą poprzedzono głęboką sedacją. Po eksplantacji serca pobrano 4 biopsje z obszaru mięśnia sercowego zaopatrywanego przez pierwszą gałąź diago-nalną i 2 kontrolne z prawej komory serca (5 × 5 × 5 mm). W naszym badaniu nie przeprowadzono oceny wielkości obszaru sztucz-nego zawału serca za pomocą diagnostyki obrazowej. Cztery biopsje zamrożono w płynnym azocie, a następnie utrwalono w Tissue Freezing Medium i pocięto mikrotomem na skrawki 10-mikrometrowe. Zamrożone skrawki oceniano pod mikroskopem fluorescen-cyjnym (powiększenie 20 ×). Natomiast 2 pozostałe biopsje utrwalono w 4-procentowym formaldehydzie, po czym pocięto na 5-mikrometrowe skrawki i zabarwiono odczynnikiem Masson Trichrome (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). W mikroskopie świetlnym (powiększenie 40 ×) oceniano gęstość kapilar w 5 polach każdego preparatu parafinowego. Wyróżniono 2 rodzaje kapilar: o średniej i dużej średnicy światła, które oceniono na podstawie zawartości erytrocytów w świetle kapilary; odpowiednio 2–5 i 6–10 erytrocytów. Przy czym średnica erytrocytu wynosi 7–8 µm.
Analiza statystyczna
Uzyskane dane przedstawiono jako wartość średnią ± odchylenie standardowe. Gęstość kapilar oceniono za pomocą jedno-czynnikowej analizy wariancji. Natomiast pomiar powtarzalny analizy wariancji zastosowano do porównania LVEF pomiędzy ko-lejnymi pomiarami. Za pomocą testu Bonferroni analizowano zależność pomiędzy LVEF a gęstością kapilar. Jeżeli test jednorodno-ści wariancji nie był znaczący, użyto nieparametrycznego testu U Manna-Whitneya albo Kruskala-Wallisa. Za poziom istotności przyjęto p ≤ 0,05. Analizę statystyczną wykonano przy użyciu Excel 2007 i SPSS software (wersja 15.0).

Wyniki
Funkcja serca
Pomiary tygodniowe frakcji wyrzutowej lewej komory serca różniły się istotnie zarówno wewnątrz (p ≤ 0,001), jak
i pomiędzy grupami (p ≤ 0,01), ale nie wykazano żadnych statystycznie istotnych interakcji pomiędzy grupami. Znaleziono również istotną różnicę w pomiarze LVEF przed zawałem serca i kolejnymi pomiarami po zawale (p ≤ 0,05). Natomiast pomiary LVEF pomię-dzy tygodniem drugim a trzecim i trzecim a czwartym nie różniły się istotnie. We wszystkich grupach wartość LVEF wzrosła istotnie po zawale serca w dwutygodniowym okresie czasu, a następnie nie zmieniła się istotnie statystycznie aż do czwartego tygodnia (ryc. 1.).

Ocena angiogenezy
Ilościową ocenę neowaskularyzacji przeprowadzono cztery tygodnie po zawale serca. Średnica światła naczynia włosowatego wyno-siła 0,014–0,035 mm oraz 0,056–0,070 mm dla kapilar o średniej i dużej średnicy. W grupie III, która otrzymała EPCs wyizolowane przy udziale aptamerów, znaleziono istotnie większą liczbę kapilar o dużej średnicy w porównaniu z pozostałymi grupami (p ≤ 0,05). Nato-miast liczba kapilar o średniej i dużej średnicy w grupie I, II i IV nie wykazały istotnych różnic (ryc. 2.).

Śledzenie znakowanych fluorescencyjnie Epos
Jedynie w grupie III wykazano luźno rozproszone barwione EPCs w obszarze perfuzji. W żadnej z grup nie zaobserwowano Dyna-beads pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Dyskusja
Bezpośrednia izolacja komórek macierzystych stanowi obecnie duży problem w transplantacji komórek macierzystych u osób z chorobą niedokrwienną mięśnia sercowego. W naszym badaniu zastosowaliśmy po raz pierwszy opisaną powyżej metodę izola-cji EPCs in vivo, przy czym porównaliśmy ją z klasyczną techniką separacji z zastosowaniem przeciwciał. Tylko w grupie z przeszczepionymi EPCs wyizolowanymi przy udziale aptamerów wykazaliśmy istotny wzrost gęstości naczyń włosowatych, po-dobnie jak Kawamoto i wsp. [9] i Schuster i wsp. [10]. W naszym badaniu ocenialiśmy także frakcję wyrzutową lewej komory ser-ca. Choć we wszystkich grupach LVEF wzrosła do wartości wyjściowej sprzed zawału serca, pomiar LVEF w grupie
z wyizolowanymi przy udziale aptamerów EPCs nie wykazał statystycznej istotności w porównaniu z pozostałymi grupami. Nasze wyniki dotyczące LVEF pokrywają się z badaniami Strauera i wsp., Janssensa i wsp., ASTAMI oraz BOOST [11–14], ale nie z wyni-kami Assmusa i wsp., Bartunek i wsp., Chena i wsp., Fernandez-Avilesa i wsp., Meluzina i wsp. oraz Schachingera i wsp. [15–20]. Na wyżej wymienioną rozbieżność wyników mogą wpływać następujące czynniki: metody izolacji, liczba komórek czy czas trans-plantacji komórek macierzystych. W większości badań klinicznych zastosowano tę samą metodę izolacji komórek – wirowanie w gradiencie Ficoll [12–14, 16, 17, 20]. Jedynie w badaniach ASTAMI i BOOST użyto całkowicie odmiennych technik izolacji, co mogło-by wyjaśnić istotnie mniejszą liczbę komórek mezenchymalnych uzyskanych w badaniu ASTAMI [21].
W naszym badaniu użyliśmy aptameru 36 do izolacji EPCs, który wykazuje wysoką zdolność wiązania EPCs (72,8%), zarówno in vitro, jak i in vivo [7]. Ponadto transplantowaliśmy EPCs w dniu izolacji bez dodatkowej inkubacji, która mogłaby wpły-nąć na funkcję komórek. Odmienne wyniki końcowe przeprowadzonych badań można tłumaczyć również liczbą przeszczepionych komórek macierzystych. W naszym badaniu transplantowaliśmy 4 × 107 EPCs. Dla porównania Kawamoto i wsp. podali przy użyciu katetera NOGA taką samą liczbę komórek (autologiczne EPCs) i wykazali istotny wzrost zarówno neowaskularyzacji, jak i LVEF w badanej grupie [9]. W badaniach klinicznych z mniejszą liczbą transplantowanych komórek tylko Strauer potwierdził istotny wpływ MNCs na funkcję serca [13]. Natomiast w badaniach TOPCARE-AMI i BOOST, w których podano większą liczbę komórek, nie znaleziono żadnej korelacji między liczbą komórek i skutecznością leczenia [11, 14]. W przeciwieństwie do powyższych badań Meluzin i wsp. i Lipinski i wsp. wykazują związek między liczbą wstrzykiwanych komórek a funkcją serca [15, 22].
Również czas transplantacji komórek może odgrywać ważną rolę w terapii komórkowej. W naszym badaniu przeszczepialiśmy komórki bezpośrednio po ich wyizolowaniu, podobnie jak Kawamoto i wsp. [9]. W innych badaniach klinicznych podawano MNCs dowieńcowo w ciągu 7 dni albo po 14 dniach. Tylko w tych ostatnich badaniach osiągnięto istotny wzrost funkcji serca [16, 18, 19], natomiast pozostałe badania kliniczne różniły się wynikami [11–15, 17, 20]. Dotychczas idealny czas transplantacji komórek nie został zdefiniowany. Strauer i wsp. sugerują, że okres między 7. a 14. dniem jest najlepszy na transplantację komórek, gdyż bez-pośrednio po zawale serca reakcja zapalna dominuje nad fazą zdrowienia [13]. Natomiast Janssens i wsp. twierdzą, że zwężenie naczyń po reperfuzji oraz ograniczony homing w pierwszych dniach po zawale może sprzyjać transplantacji komórek [12]. Ponadto kwestionuje się zdolność komórek progenitorowych szpiku do różnicowania się w kardiomiocyty [23, 24], a dokładny mechanizm poprawy funkcji i perfuzji serca nie jest jeszcze znany. W 2008 r. Flaherty przedstawił badanie, w którym pierwszy raz wykazano zdolność różnicowania się niefrakcjonowanych MNCs in vitro bez hodowli z kardiomiocytami [25]. Również homing EPCs może mieć wpływ na LVEF. Chociaż w badaniu Schäfera i wsp. wykazano gęste nagromadzenie komórek w obszarze krioblizny, w naszym badaniu homing był niewielki, a beads nie zaobserwowano. Należy dodać, że nasze badanie przeprowadziliśmy cztery tygodnie po transplantacji komórek, a Schäfer po 20 godzinach [26]. Podsumowując, w naszym badaniu wykazaliśmy istotną neowaskularyzację w grupie, w której przeszczepiliśmy wyizolowane przy udziale aptamerów EPCs.

Wnioski
W naszym badaniu wykazaliśmy, że wyizolowane przy udziale aptamerów EPCs w porównaniu z EPCs wyizolowanymi przy użyciu przeciwciał przyczyniły się do istotniejszego wzrostu gęstości naczyń włosowatych o dużej średnicy, ale nie wpłynęły na poprawę funkcji serca. Na powyższe wyniki mógł wpłynąć niewielki homing komórek. Poza tym należy zauważyć, że w przepro-wadzeniu naszego badania posłużyliśmy się młodymi świniami, które wykazały dużą zdolność regeneracji funkcji serca. Nasze badanie jest pierwszym, które zastosowało nową technikę izolacji komórek macierzystych in vivo, dlatego są konieczne dalsze badania, które ulepszyłyby i wyjaśniły mechanizmy transplantacji komórek macierzystych izolowanych przy udziale apta-merów. W przyszłości technika izolacji przy udziale aptamerów może przynieść nowe perspektywy w zakresie terapii komórkowej.
Piśmiennictwo
1. Chachques JC, Acar C, Herreros J, Trainini JC, Prosper F, D’Attellis N, Fabiani JN, Carpentier AF. Cellular cardiomyoplasty: clinical application. Ann Thorac Surg 2004; 73: 1121-1130.
2. van den Bos EJ, van der Giessen WJ, Duncker DJ. Cell transplantation for cardiac regeneration: where do we stand? Neth Heart J 2008; 16: 88-95.
3. Hur J, Yoon CH, Kim HS, Choi JH, Kang HJ, Hwang KK, Oh BH, Lee MM, Park YB. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contribu-tions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004; 24: 288-293.
4. Dernbach E, Urbich C, Brandes RP, Hofmann WK, Zeiher AM, Dimmeler S. Antioxidative stress-associated genes in circulating progenitor cells: evidence for enhanced resis-tance against oxidative stress. Blood 2004; 104: 3591-3597.
5. Hristov M, Erl W, Weber PC. Endothelial progenitor cells: mobilization, differentiation, and homing. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003; 23: 1185-1189.
6. Guo KT, Schäfer R, Paul A, Gerber A, Ziemer G, Wendel HP. A new technique for the isolation and surface immobilization of mesenchymal stem cells from whole bone mar-row using high-specific DNA aptamers. Stem Cells 2006; 24: 2220-2231.
7. Hoffmann J, Paul A, Harwardt M, Groll J, Reeswinkel T, Klee D, Moeller M, Fischer H, Walker T, Greiner T, Ziemer G, Wendel HP. Immobilized DNA aptamers used as potent attractors for porcine endothelial precursor cells. J Biomed Mater Res A 2008; 84: 614-621.
8. Nimjee SM, Rusconi CP, Sullenger BA. Aptamers: an emerging class of therapeutics. Annu Rev Med 2005; 56: 555-583.
9. Kawamoto A, Tkebuchava T, Yamaguchi J, Nishimura H, Yoon YS, Milliken C, Uchida S, Masuo O, Iwaguro H, Ma H, Hanley A, Silver M, Kearney M, Losordo DW, Isner JM, Asahara T. Intramyocardial transplantation of autologous endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization of myocardial ischemia. Circulation 2003; 107: 461-468.
10. Schuster MD, Kocher AA, Seki T, Martens TP, Xiang G, Homma S, Itescu S. Myocardial neovascularization by bone marrow angioblasts results in cardiomyocyte regenera-tion. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2004; 287: H525-H532.
11. Meyer GP, Wollert KC, Lotz J, Steffens J, Lippolt P, Fichtner S, Hecker H, Schaefer A, Arseniev L, Hertenstein B, Ganser A, Drexler H. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months’ follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation 2006; 113: 1287-1294.
12. Janssens S, Dubois C, Bogaert J, Theunissen K, Deroose C, Desmet W, Kalantzi M, Herbots L, Sinnaeve P, Dens J, Maertens J, Rademakers F, Dymarkowski S, Gheysens O, Van Cleemput J, Bormans G, Nuyts J, Belmans A, Mortelmans L, Boogaerts M, Van de Werf F. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet 2006; 367: 113-121.
13. Strauer BE, Brehm M, Zeus T, Köstering M, Hernandez A, Sorg RV, Kögler G, Wernet P. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. Circulation 2002; 106: 1913-1918.
14. Lunde K, Solheim S, Forfang K, Arnesen H, Brinch L, Bjørnerheim R, Ragnarsson A, Egeland T, Endresen K, Ilebekk A, Mangschau A, Aakhus S. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N Engl J Med 2006; 355: 1199-1209.
15. Meluzín J, Mayer J, Groch L, Janousek S, Hornácek I, Hlinomaz O, Kala P, Panovský R, Prásek J, Kamínek M, Stanícek J, Klabusay M, Korístek Z, Navrátil M, Dusek L, Vinklárk-ová J. Autologous transplantation of mononuclear bone marrow cells in patients with acute myocardial infarction: the effect of the dose of transplanted cells on myocar-dial function. Am Heart J 2006; 152: 975.e9-15.
16. Fernández-Avilés F, San Román JA, García-Frade J, Fernández ME, Peńarrubia MJ, de la Fuente L, Gómez-Bueno M, Cantalapiedra A, Fernández J, Gutierrez O, Sánchez PL, Hernández C, Sanz R, García-Sancho J, Sánchez A. Experimental and clinical regenerative capability of human bone marrow cells after myocardial infarction. Circ Res 2004; 95: 742-748.
17. Assmus B, Honold J, Schächinger V, Britten MB, Fischer-Rasokat U, Lehmann R, Teupe C, Pistorius K, Martin H, Abolmaali ND, Tonn T, Dimmeler S, Zeiher AM.
Transcoronary transplantation of progenitor cells after myocardial infarction. N Engl J Med 2006; 355: 1222-1232.
18. Bartunek J, Vanderheyden M, Vandekerckhove B, Mansour S, De Bruyne B, De Bondt P, Van Haute I, Lootens N, Heyndrickx G, Wijns W. Intracoronary injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells promotes cardiac recovery after recent myocardial infarction: feasibility and safety. Circulation 2005; 112 (Suppl.): I178-183.
19. Chen SL, Fang WW, Ye F, Liu YH, Qian J, Shan SJ, Zhang JJ, Chunhua RZ, Liao LM, Lin S, Sun JP. Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autolo-gous bone marrow mesenchymal stem cell in patients with acute myocardial infarction. Am J Cardiol 2004; 94: 92-95.
20. Schächinger V, Assmus B, Britten MB, Honold J, Lehmann R, Teupe C, Abolmaali ND, Vogl TJ, Hofmann WK, Martin H, Dimmeler S, Zeiher AM. Transplantation of progenitor cells and regeneration enhancement in acute myocardial infarction: final one-year results of the TOPCARE-AMI Trial. J Am Coll Cardiol 2004; 44: 1690-1699.
21. Seeger FH, Tonn T, Krzossok N, Zeiher AM, Dimmeler S. Cell isolation procedures matter: a comparison of different isolation protocols of bone marrow mononuclear cells used for cell therapy in patients with acute myocardial infarction. Eur Heart J 2007; 28: 766-772.
22. Lipinski MJ, Biondi-Zoccai GG, Abbate A, Khianey R, Sheiban I, Bartunek J, Vanderheyden M, Kim HS, Kang HJ, Strauer BE, Vetrovec GW. Impact of intracoronary cell therapy on left ventricular function in the setting of acute myocardial infarction: a collaborative systematic review and meta-analysis of controlled clinical trials. J Am Coll Cardiol 2007; 50: 1761-1767.
23. Balsam LB, Wagers AJ, Christensen JL, Kofidis T, Weissman IL, Robbins RC. Haematopoietic stem cells adopt mature haematopoietic fates in ischaemic myocardium. Nature 2004; 428: 669-673.
24. Murry CE, Soonpaa MH, Reinecke H, Nakajima H, Nakajima HO, Rubart M, Pasumarthi KB, Virag JI, Bartelmez SH, Poppa V, Bradford G, Dowell JD, Williams DA, Field LJ. Haematopoietic stem cells do not transdifferentiate into cardiac myocytes in myocardial infarcts. Nature 2004; 428: 664-668.
25. Flaherty MP, Abdel-Latif A, Li Q, Hunt G, Ranjan S, Ou Q, Tang XL, Johnson RK, Bolli R, Dawn B. Noncanonical Wnt11 signaling is sufficient to induce cardiomyogenic differ-entiation in unfractionated bone marrow mononuclear cells. Circulation 2008; 117: 2241-2252.
26. Schäfer R, Wiskirchen J, Guo K, Neumann B, Kehlbach R, Pintaske J, Voth V, Walker T, Scheule AM, Greiner TO, Hermanutz-Klein U, Claussen CD, Northoff H, Ziemer G, Wendel HP. Aptamer-based isolation and subsequent imaging of mesenchymal stem cells in ischemic myocard by magnetic resonance imaging. Rofo, 2007; 179: 1009-1015.