BRCA2 mutation analysis in male breast cancer patients in Poland

WSTĘP


Rak piersi u mężczyzn jest w Europie Zachodniej i w Stanach Zjednoczonych chorobą rzadką. Stanowi mniej niż 1 proc. wszystkich nowotworów złośliwych występujących u mężczyzn [1, 2]. Częstość występowania raka piersi u mężczyzn zmienia się wraz z położeniem geograficznym, np. nowotwór ten występuje rzadziej w Finlandii i Japonii niż w Stanach Zjednoczonych czy Wielkiej Brytanii [1]. W Europie najwyższy odsetek zgonów mężczyzn z powodu raka piersi występuje na Węgrzech [3]. W Polsce rak piersi stanowi 0,2 proc. wszystkich nowotworów złośliwych u mężczyzn i odpowiada za 0,1 proc. zgonów z powodu nowotworów [4].



Częstość zachorowań na raka piersi u mężczyzn wzrasta z wiekiem. Choroba ta występuje rzadko przed 30. rokiem życia, a średni wiek chorych wynosi 60–65 lat [1, 5]. Rozpiętość wieku zachorowania jest duża, waha się od 25. do 90. roku życia. W stosunku do kobiet średni wiek zachorowania mężczyzn jest wyższy o ok. 5–10 lat [1].



Etiologia raka piersi u mężczyzn nie została w pełni wyjaśniona. Głównym czynnikiem przyczynowym wydają się być zaburzenia hormonalne, prowadzące do zachwiania równowagi między estrogenami i androgenami, spowodowane przez choroby jąder, otyłość, marskość wątroby czy przyjmowanie estrogenów [1]. Ryzyko raka piersi jest 50-krotnie wyższe u mężczyzn z zespołem Klinefeltera, który może odpowiadać nawet za 7,5 proc. przypadków tej choroby [6]. Z powstawaniem raka piersi u mężczyzn związane są czynniki środowiskowe, takie jak promieniowanie jonizujące, pole elektromagnetyczne i wysoka temperatura [1]. Część przypadków raka piersi u mężczyzn ma podłoże genetyczne związane z mutacjami genu receptora androgenowego (AR) i genu BRCA2. Rola genu supresorowego BRCA2 w powstawaniu raka piersi u mężczyzn była przedmiotem badań w kilku krajach europejskich: w Szwecji, Islandii, Hiszpanii, Wielkiej Brytanii, na Węgrzech oraz w Stanach Zjednoczonych. Częstość występowania mutacji genu BRCA2 w tych populacjach wahała się od 4–40 proc. [7, 8, 9, 10, 11, 12]. Obok mutacji genu BRCA2 za czynnik predysponujący do występowania raka piersi u mężczyzn uważane są także mutacje genu receptora androgenowego [13, 14]. Dwie różne mutacje genu AR zidentyfikowano u mężczyzn chorych na raka piersi z zespołem braku wrażliwości na androgeny.



Celem pracy było określenie częstości występowania mutacji genów BRCA2 i AR u mężczyzn chorych na raka piersi w populacji polskiej.



MATERIAŁ I METODY


Badaniami objęto grupę 38 mężczyzn chorych na raka piersi, leczonych w latach 1986–2000 w Wielkopolskim Centrum Onkologii. Wszyscy chorzy, którzy zgłosili się do Poradni Genetycznej WCO w celu przystąpienia do badań, uzyskali poradę genetyczną i wyrazili pisemną zgodę na udział w badaniach. Od wszystkich uzyskano informacje o rodzinnej historii chorób nowotworowych. Średni wiek chorych w momencie zgłoszenia się do leczenia wynosił 60 lat. Rozpiętość wieku była duża i wynosiła od 29 do 85 lat. Jedenastu spośród 38 chorych (29 proc.) było w Io zaawansowania klinicznego, 17/38 (45 proc.) było w stopniu IIA, 8/38 (21 proc.) w stopniu IIB, a 2/38 (5 proc.) w IIIo zaawansowania klinicznego. W badanej grupie 66 proc. (25/38) stanowiły nowotwory inwazyjne typu przewodowego. Grupę kontrolną, w której określano populacyjną częstość wariantów zmiany sensu, które zostały wykryte w trakcie analizy genu BRCA2 stanowiło 100 zdrowych mężczyzn.



Genomowe DNA izolowano z limfocytów krwi obwodowej stosując metodę opartą o proteinazę K. Amplifikację 26 kodujących eksonów genu BRCA2, wraz z fragmentami intronów obejmującymi miejsca spicingu, prowadzono metodą PCR z wykorzystaniem 63 par starterów. Długość amplifikowanych fragmentów wynosiła 136–300 par zasad. Do analizy mutacji genu BRCA2 zastosowano metodę SSCA-HA. Po amplifikacji metodą PCR zdenaturowane fragmenty DNA rozdzielano w 8-procentowym natywnym żelu poliakryloamidowym z dodatkiem glicerolu (5 proc.). Fragmenty DNA wykazujące zmieniony sposób migracji podczas elektoforezy wycinano z żelu i poddawano reamplifikacji. Po oczyszczeniu z użyciem zestawu QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy) fragmenty te sekwencjonowano stosując zestaw fmol DNA Sequencing System (Promega, Madison, USA) w celu określenia charakteru mutacji.



WYNIKI


Analizę mutacji genu BRCA2 wykonano u 38 mężczyzn chorych na raka piersi. Zidentyfikowano 14 różnych wariantów sekwencji genu BRCA2. Wśród nich znajdowało się (tab. 1.):

· 5 mutacji zmiany ramki odczytu: 2 insercje i 3 delecje,

· 6 mutacji punktowych: 5 zmiany sensu i 1 cicha,

· 3 polimorfizmy.



3 mutacje zmiany ramki odczytu: 6495del3insC, 6621del4, 8457insA, a także 2 mutacje punktowe: Ser1179Asn (3764G/A) i Val1438Val (5972C/T) stanowią nowe warianty sekwencji genu BRCA2.



Aby określić charakter wariantów zmiany sensu zbadano częstość ich występowania w ogólnej populacji. Grupę kontrolną stanowiło 100 zdrowych mężczyzn. W grupie tej zidentyfikowano jedynie 2 warianty sekwencji: Asp1420Tyr w 4 przypadkach i Thr1915Met w 3 przypadkach.


Charakterystykę kliniczną i histopatologiczną mężczyzn objętych badaniami przedstawia tab. 2. Średni wiek chorych w momencie diagnozy wynosił 60 lat (przy rozpiętości od 29 do 85 lat). Ponad połowa przypadków raka piersi (58 proc.) wystąpiła u mężczyzn w wieku 60–75 lat. Chorzy dziedzicznie obciążeni mutacjami genu BRCA2 byli młodsi w momencie diagnozy. Średnia wieku w tej grupie wyniosła 50 lat, natomiast w grupie chorych, u których nie wykryto mutacji genu BRCA2 – 62 lata.



U wszystkich mężczyzn chorych na raka piersi – nosicieli mutacji genu BRCA2, wystąpił rak inwazyjny typu przewodowego. Od wszystkich chorych uzyskano informacje na temat rodzinnej historii występowania raka piersi i/lub jajnika. Przypadki raka piersi w rodzinie występowały u 15,5 proc. (6/38) chorych, u 10,5 proc. (4/38) wśród krewnych Io, a u 5 proc. (2/38) wśród krewnych IIo. Dwóch spośród 5 nosicieli mutacji genu BRCA2 miało pozytywną historię rodzinną raka piersi: 10Y (siostra ojca, 40 lat) i 46Y (ojciec, 88 lat). W żadnej rodzinie nie wystąpił więcej niż jeden przypadek raka piersi wśród krewnych, nie było również przypadków raka jajnika.



OMÓWIENIE


Pierwsze badania dotyczące występowania mutacji genu BRCA2, prowadzone wkrótce po jego odkryciu, objęły przede wszystkim duże rodziny z licznymi przypadkami raka piersi, w których występowały również przypadki tej choroby u mężczyzn [15, 16, 17]. Badania populacyjne BRCA2 w raku piersi u mężczyzn zostały dotychczas przeprowadzone w Stanach Zjednoczonych [12], Wielkiej Brytanii [10], Islandii [8], Szwecji [7], Hiszpanii [9] i na Węgrzech [11]. Częstość występowania mutacji genu BRCA2 u mężczyzn chorych na raka piersi w tych populacjach jest bardzo zróżnicowana. Friedman i wsp. [12] wśród 54 badanych zidentyfikowali jedynie 2 (4 proc.) nosicieli mutacji genu BRCA2. Podobnie niską częstość zaobserwowano w Wielkiej Brytanii, gdzie mutacje BRCA2 wykryto u 7 proc. chorych [10]. Z drugiej strony, spośród wszystkich mężczyzn, którzy zachorowali na raka piersi w Islandii w ciągu ostatnich 40 lat, aż 40 proc. to nosiciele mutacji 999del5 [8]. Dużą częstość występowania mutacji BRCA2 wśród chorych na raka piersi mężczyzn obserwowano również na Węgrzech (30 proc.) [11]. W populacji polskiej mutacje genu BRCA2 występują z umiarkowaną częstością (13 proc.), podobnie jak w Szwecji (21 proc.) i w Hiszpanii (14 proc.) [7, 9].

W badanej grupie chorych zidentyfikowano 5 różnych mutacji genu BRCA2, które zlokalizowane były w eksonach 10, 11, 17 i 18 (tab. 1.). Wszystkie mutacje powodowały zmianę ramki odczytu, a w konsekwencji wprowadzenie kodonu stop i przedwczesną terminację translacji kodowanego białka, połączoną z utratą sygnału lokalizacji jądrowej [18, 19]. Wielkość zmutowanych białek stanowiłaby 12 proc., 61 proc., 62 proc., 77 proc., 81 proc. długości prawidłowego białka BRCA2. Wg Spaina i wsp. [19] zmutowane formy białka BRCA2, które nie posiadają sygnału lokalizacji jądrowej nie są przenoszone do jądra komórkowego, przez co nie mogą spełniać swoich funkcji mimo obecności niektórych domen funkcjonalnych.



Oprócz mutacji zmiany ramki odczytu zidentyfikowano 3 częste polimorfizmy oraz 6 rzadkich wariantów sekwencji: 5 typu zmiany sensu i 1 cichą (tab. 1.). Substytucja tyrozyny w miejsce kwasu asparaginowego w pozycji 1420 (ekson 11, Asp1420Tyr, 4486C/T) została dotychczas 104-krotnie zgłoszona w bazie danych BIC. Wariant ten wykryto również w czterech przypadkach w grupie kontrolnej, co sugeruje, że jest to najprawdopodobniej rzadki polimorfizm genu BRCA2. Podobna sytuacja dotyczy substytucji Thr1915Met (ekson 11, 5972C/T), którą 3-krotnie zidentyfikowano w populacji kontrolnej. Żaden z 3 pozostałych wariantów zmiany sensu nie wystąpił w grupie 200 kontrolnych chromosomów. Substytucję Asn3142Ile (9599A/T) w eksonie 25 genu BRCA2 wykryto dotychczas 4-krotnie (wg BIC), m.in. w populacji polskiej u kobiety chorej na raka piersi [20]. Polega ona na zamianie konserwatywnej, hydrofilowej asparaginy na hydrofobową izoleucynę. Asparagina 3124 jest ponadto położona w dużej konserwatywnej domenie na karboksylowym końcu białka BRCA2, o 77 proc. identyczności na poziomie aminokwasowym między białkiem ludzkim i homologami u gryzoni [18]. Wariant ten może być zatem interpretowany jako potencjalna mutacja zmiany sensu genu BRCA2. Kolejny z wariantów missensowych zlokalizowany był w eksonie 26 (9814A/G). Konserwatywna, obdarzona dodatnim ładunkiem lizyna w pozycji 3196 została zastąpiona przez ujemnie naładowaną resztę glutaminianu. Biorąc pod uwagę konserwatywny charakter tej pozycji aminokwasowej w białku BRCA2 [18] może on stanowić kolejną mutację zmiany sensu genu BRCA2. Niejasne znaczenie dla funkcji białka BRCA2 ma natomiast mutacja Ser1179Asp. Choć aminokwas ten zlokalizowany jest w regionie białka BRCA2, który jest zaangażowany w oddziaływanie z białkiem RAD51 (między pierwszym i drugi motywem BRC), nie jest zachowawczy międzygatunkowo, a zarówno seryna, jak i asparagina są hydrofilowymi aminokwasami o podobnej wielkości [21, 22, 23].



Z badań epidemiologicznych wynika, że rodzinne obciążenie nowotworami piersi jest czynnikiem ryzyka tej choroby u mężczyzn [2]. Zgodnie z ta hipotezą w grupie badanej przez Friedman i wsp. [12] 30 proc. mężczyzn miało krewnych I lub IIo chorych na raka piersi lub jajnika. Odsetek ten w innych populacjach wahał się od 13 proc. do nawet 80 proc. [7, 24]. W populacji polskiej dodatkowe przypadki raka piersi wystąpiły w rodzinach jedynie 15,5 proc. mężczyzn chorych na raka piersi, u 10,5 proc. wśród krewnych Io i 5 proc. wśród krewnych IIo. Biorąc pod uwagę fakt, że w ogólnej populacji 7 proc. mężczyzn ma krewnych Io chorych na raka piersi lub jajnika [12], rodzinna historia raka piersi nie należy do najistotniejszych czynników ryzyka raka piersi u mężczyzn w Polsce. Mutacje genu BRCA2 występują często u mężczyzn, którzy nie mają rodzinnej historii raka piersi i w związku z tym wszystkie przypadki powinny być uważane za potencjalnie dziedziczne, a chorzy powinni uzyskać poradę genetyczną i możliwość wykonania badań genetycznych.


PIŚMIENNICTWO

1. Ravandi-Kashani F, Hayes TG. Eur J Cancer 1998; 34: 1341-1347.

2. Sasco AJ, Lowenfels AB, Pasker-de Jong P. Int J Cancer 1993; 53: 538-549.

3. La Vecchia C, Levi F, Lucchini F. Int J Cancer 1992; 51: 62-66.

4. Zatoński W, Tyczyński J. (red.). Cancer in Poland in 1996. Warszawa 1999.

5. Donegan WL, Redlich PN, Lang PJ, Gall MT. Cancer 1998; 83: 498-509.

6. Hultborn R, Hanson C, Kopf I, Verbiene I, Warnhammar E, Weimarck A. Anticancer Res 1997; 17: 4293-4297.

7. Haraldsson K, Loman N, Zhang QX, Johannsson O, Olsson H, Borg A. Cancer Res 1998; 58: 1367-1371.

8. Thorlacius S, Olafsdottir G, Tryggvadottir L i wsp. Nat Genet 1996; 13: 117-119.

9. Diez O, Cortez J, Domenech M, Pericay C, Brunet J, Alonso C, Baiget M. Ann Oncol 2000; 11: 81-84.

10. Mavraki E, Gray IC, Bishop DT, Spurr NK. Br J Cancer 1997; 76: 1428-1431.

11. Csokay B, Udvarhelyi N, Sulyok Z, Besznyak I, Ramus S, Ponder B, Olah E. Cancer Res 1999; 59: 995-998.

12. Friedman LS, Gayther SA, Kurosaki T, Gordon D, Noble B, Casey G, Ponder BAJ, Anton-Culver H. Am J Hum Genet 1997; 60: 313-319.

13. Wooster R, Mangion J, Eeles R i wsp. Nat Genet 1992; 2: 132-134.

14. Lobaccaro JM, Lumbroso S, Belon C i wsp. Hum Mol Genet 1993; 2: 1799-1802.

15. Wooster R, Neuhausen S, Mangion J i wsp. Science 1995; 265: 2088-2090.

16. Tavtigian SV, Simard J, Rommens J i wsp. Nat Genet 1996; 12: 333-337.

17. Phelan CM, Lancaster JM, Tonin P i wsp. Nat Genet 1996; 13: 120-122.

18. McAlister KA, Haugen-Strano A, Hagevik S, Brownlee HA, Colins NK. Futreal PA, Bennett LM; Wiseman RW. Cancer Res 1997; 57: 3121-3125.

19. Spain BH, Larson CJ, Shihabuddin LS, Gage FH, Verma IM. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 13920-13925.

20. Grzybowska E, Zientek H, Jasińska J i wsp. Human Mut 2000; 16: 482-490.

21. Wong AKC, Pero R, Ormonde PA, Tavtigian SV, Bartel PL. J Biol Chem 1997; 272: 31941-31944.

22. Chen PL, Chen CF, Chen Y, Xiao J, Sharp D, Lee WH. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 5287-5292.

23. Bignell G, Micklem G, Stratton MR, Ashworth A, Wooster R. Hum Mol Genet 1997; 6: 53-58.

24. Couch FJ, Farid LM, DeShano ML i wsp. Nat Genet 1996; 13: 123-125.


ADRES DO KORESPONDENCJI

mgr Eliza Kwiatkowska

Zakład Immunologii Nowotworów

Wielkopolskie Centrum Onkologii

ul. Garbary 15, 61-866 Poznań

tel.: 854 06 68, fax: 852 85 02

e-mail: elizakw@mail.wco.pl



Praca finansowana z grantu KBN nr 0603/P05/99/17



Rozszerzony tekst pracy w języku angielskim został opublikowany w Human Mutation, Mutation in Brief #, 2000. Publikacja we Współczesnej Onkologii za zgodą Wiley-Liss. Inc.