Badanie molekularnych markerów wykorzystywanych w leczeniu chorych na raka jelita grubego

1. Wstęp

Terapia spersonalizowana, tzn. skrojona na miarę i potrzeby konkretnego pacjenta, stanowi ideał, do którego dąży współczesne leczenie nowotworów. Rak jelita grubego jest jednym z czterech raków, obok raka sutka, żołądka i płuca, w których do praktyki klinicznej wprowadzono udane próby terapii celowanej. Aby taka terapia była skuteczna, powinna być dostosowana do tego i tylko do tego unikalnego nowotworu, który występuje u danego pacjenta. Inaczej mówiąc, powinna to być terapia precyzyjnie celowana, a ona wymaga oceny markerów predykcyjnych, takich jak mutacje, amplifikacje lub białka (białka receptorowe lub inne białka, które odgrywają istotną rolę w procesach: proliferacji, apoptozy, angiogenezy, inwazji i migracji komórek nowotworowych lub naprawy uszkodzonego DNA). Wyniki oceny tych markerów stanowią integralny element rozpoznania histopatologicznego, ponieważ tylko pacjenci, których nowotwory będą wykazywały obecność pewnych czynników predykcyjnych, mogą odnieść korzyści z leczenia celowanego. Terapia celowana wymaga precyzyjnej diagnostyki opartej na testach diagnostycznych wykorzystujących materiał tkankowy i to materiał utrwalony w formalinie i zatopiony w parafinie, jeżeli mają mieć rutynowe zastosowanie kliniczne. Od współczesnego patologa wymaga się, aby rozpoznanie raka jelita grubego zawierało ocenę odpowiednich markerów predykcyjnych, co pozwala na identyfikację chorych, którzy mogą odnieść korzyści z leczenia celowanego. Rutynowy test predykcyjny powinien być względnie prosty w wykonaniu, szybki, niezbyt drogi oraz charakteryzować się wysoką czułością i specyficznością [1].
Dotychczas sposób leczenia nowotworów wyznaczały typ histologiczny, stopień histologicznej złośliwości i stadium klinicznego zaawansowania choroby. Jednak cechy mikroskopowe nowotworów, szczególnie w raku jelita grubego, chociaż mogą mieć znaczenie prognostyczne, nie mają niestety znaczenia predykcyjnego. Wprowadzenie terapii celowanej do pewnego stopnia zrewolucjonizowało diagnostykę histopatologiczną nowotworów, ponieważ terapeuta oczekuje precyzyjnej informacji predykcyjnej. Zagadnienie to jest jeszcze nieco bardziej skomplikowane, ponieważ może się zdarzyć, że dany nowotwór wykazuje ekspresję kilku markerów predykcyjnych i wtedy odpowiednie opcje terapeutyczne są dostępne tylko dla pacjentów z takimi nowotworami [2, 3]. A zatem scharakteryzowanie nowotworu pod względem znanych markerów predykcyjnych umożliwia zastosowanie opcji terapeutycznych, które są dostępne tylko dla pacjenta z danym nowotworem (nawet jeżeli odsetek takich nowotworów w ogólnej populacji jest niewielki) [4]. W erze terapii spersonalizowanej, aby uniknąć nadmiernej toksyczności leczenia, pacjent ma prawo oczekiwać, że stosowane leczenie będzie odpowiednie do statusu molekularnego jego nowotworu. Aby takie leczenie było możliwe, potrzebna jest precyzyjna ocena celów terapii. W raku jelita grubego dla oceny celów predykcyjnych wykorzystuje się markery molekularne (np. mutacje w genach KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA) [1, 5–7] i immunohistochemiczne (np. białka TS, P21, PTEN) [8–12]. Markery molekularne w raku jelita grubego można podzielić na mutacje somatyczne i niestabilność mikrosatelitarną (microsatellite instability – MSI).

2. Mutacje somatyczne

2.1. KRAS

Ocena mutacji w KRAS jest przykładem zastosowania testu molekularnego potrzebnego do wprowadzenia terapii celowanej w określonej grupie chorych, w tym przypadku chorych na raka jelita grubego z przerzutami. Współcześnie stanowi ona badanie rutynowe niezbędne do podjęcia decyzji w leczeniu tej grupy chorych.

2.1.1. Ścieżki sygnałowe związane z mutacją w KRAS

Gen KRAS koduje małe białko, które bierze udział w aktywacji kaskady ścieżek sygnałowych, w tym ścieżki sygnałowej receptora dla naskórkowego czynnika wzrostu (epidermal growth factor receptor – EGFR), która jest uważana za podstawową w regulacji proliferacji, wzrostu i transformacji nowotworowej komórek nabłonkowych [13]. Białko RAS funkcjonuje jako przekaźnik sygnału od aktywowanego EGFR. Aktywacja EGFR (przez połączenie z jego ligandem) prowadzi do aktywacji ścieżek sygnałowych RAS/RAF/MAPK i PI3K/AKT, a następnie do wzmożonej proliferacji i zahamowania apoptozy komórek nowotworowych [14]. Zastosowanie monoklonalnych przeciwciał przeciw EGFR (mAb anty-EGFR), takich jak cetuksimab i panitumumab, powoduje, że w komórkach raka jelita grubego bez mutacji w RAS uniemożliwione zostaje połączenie EGFR z jego ligandem i w następstwie dochodzi do inaktywacji ww. ścieżek sygnałowych i do apoptozy komórek rakowych. W komórkach prawidłowych białko RAS oscyluje między stanem aktywnym (RAS-GTP) a nieaktywnym (RAS-GDP). W wyniku mutacji w RAS powstaje kodowane przez zmutowany gen białko, które ze względu na utrudnioną hydrolizę ciągle pozostaje w postaci aktywnej (RAS-GTP). W komórkach z mutacją w KRAS dochodzi zatem do konstytutywnej (permanentnej) aktywacji ścieżek sygnałowych RAS/RAF/MAPK i PI3K/AKT i ciągłego przekazywania sygnału indukującego mitogenezę, niezależnie od tego, czy receptor EGF jest aktywowany, czy też nie [15].

2.1.2. Przesłanki kliniczne

W związku z powyższym, leczenie chorych na raka jelita grubego z przerzutami, w którym stwierdza się mutacje KRAS za pomocą mAb anty-EGFR rozpoznających i inaktywujących zewnątrzkomórkową domenę EGFR, jest nieskuteczne (badania kliniczne II i III fazy) [16–18]. Na podstawie opublikowanych wyników 5 kontrolowanych badań klinicznych z randomizacją dotyczących stosowania cetuksimabu i panitumumabu oraz 5 badań retrospektywnych Amerykańskie Towarzystwo Onkologii Klinicznej (American Society for Clinical Oncology – ASCO) wydało w 2009 r. wstępną opinię, która precyzowała, że raki wszystkich pacjentów z rakami jelita grubego z przerzutami, którzy są kandydatami do terapii anty-EGFR, powinny być testowane w akredytowanych laboratoriach na obecność mutacji w KRAS i jeżeli stwierdza się mutacje w kodonie 12 lub 13 eksonu 2, pacjenci ci nie powinni otrzymać tego rodzaju leczenia [16]. Odpowiednia selekcja pacjentów z rakiem jelita grubego z przerzutami do terapii za pomocą mAb anty-EGFR ma istotne znaczenie, ponieważ ten rodzaj leczenia może powodować poważne powikłania oraz oporność po kilku miesiącach stosowania, a także jest bardzo kosztowny [19].

2.1.3. Spektrum badanych mutacji

Analiza mutacji w KRAS pozwala stratyfikować chorych na raka jelita grubego z przerzutami do terapii za pomocą mAb anty-EGFR, a mutacje w KRAS stanowią negatywny czynnik predykcyjny dla tej terapii [20]. Mutacje w KRAS w raku jelita grubego najczęściej występują w kodonach 12, 13 eksonu 2 (w blisko 40% raków jelita grubego). Rzadziej spotyka się aktywujące mutacje KRAS w kodonach 59, 61, 117 i 146. Pierwotnie zarówno Europejska Agencja ds. Leków (European Medicines Agency – EMEA), jak i Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (Food and Drug Administration – FDA) zaaprobowały stosowanie tej terapii tylko u chorych na raka jelita grubego z przerzutami bez mutacji w KRAS. W lipcu 2013 r. EMEA uaktualniła kryteria kwalifikacji do terapii anty-EGFR, wprowadzając obowiązkowe badanie nie tylko mutacji w eksonie 2 genu KRAS, lecz także w eksonach 3 i 4 KRAS oraz eksonach 2, 3 i 4 NRAS, ponieważ profile ekspresji genów i cechy kliniczno-patologiczne „nietypowych” rzadkich mutacji, a także przeżycie pacjentów z rakiem jelita grubego z przerzutami z tymi mutacjami są podobne do mutacji KRAS w kodonach 12 i 13 [21]. Pacjenci z tymi rzadkimi mutacjami w KRAS i NRAS będą niewrażliwi na leczenie anty-EGFR, do którego zostali zakwalifikowani tylko na podstawie braku mutacji w KRAS 12/13 [7]. Również wg opublikowanych w 2014 r. rekomendacji dla Wielkiej Brytanii [22] analiza mutacji w KRAS i NRAS jako czynnika predykcyjnego powinna obejmować mutacje w KRAS przynajmniej w kodonach 12, 13, 59, 61, 117 i 146 (eksony 2, 3 i 4), podobnie w NRAS (chociaż autorzy nie rekomendują na razie badania kodonów 117 i 146 w NRAS ze względu na brak wystarczających dowodów na kliniczne znaczenie tych mutacji).
Według szczegółowej metaanalizy 9 artykułów, obejmującej blisko 6000 pacjentów, przypuszczalnie ok. 53% raków jelita grubego (42% z mutacjami w eksonie 2 KRAS i 11% z mutacjami w eksonach 3 lub 4 KRAS lub 2, 3 i 4 NRAS) będzie opornych na leczenie za pomocą mAb anty-EGFR [7]. Ponadto stosowanie tego leczenia u chorych na raka jelita grubego z przerzutami i mutacjami w KRAS może nawet wpływać negatywnie na przeżycie pacjentów [23]. Na obecnym etapie badań nie wiadomo, czy efekty leczenia pacjentów z rakiem jelita grubego za pomocą mAb anty-EGFR (OS, DFS) zależą od typu mutacji w KRAS i NRAS. Uważa się, że obecność jakiejkolwiek mutacji w KRAS i NRAS stanowi przeciwwskazanie do terapii anty-EGFR, jednak zagadnienie to wymaga dalszych badań. Jednoznacznie wykazano natomiast, że efekty leczenia anty-EGFR zależą od metody zastosowanej do oceny mutacji KRAS. Im czułość metody wykrywania mutacji KRAS jest wyższa, tym wyniki leczenia są lepsze [24–32].

2.1.4. Status KRAS jako czynnik predykcyjny

Ostatnio prowadzone są przedkliniczne i kliniczne badania nad zastosowaniem inhibitorów (inhibitory BRAF w rakach jelita grubego z przerzutami z mutacją w BRAF, inhibitory MEK i SEK, inhibitory transferazy farnezylowej), które mogą uczulać raka jelita grubego z przerzutami z mutacją w KRAS na działanie cetuksimabu [33]. Można więc powiedzieć, że czynnikiem predykcyjnym jest nie tylko mutacja w KRAS, ale w ogóle status KRAS. Gdy mutacja nie występuje, chory na raka jelita grubego z przerzutami może być leczony cetuksimabem. Jeżeli stwierdza się mutację, możliwe są inne metody leczenia, analizowane obecnie w próbach przedklinicznych i klinicznych.

2.2. NRAS

Mutacje w NRAS są również czynnikiem predykcyjnym wskazującym na oporność na leczenie cetuksimabem [34, 35]. Z dotychczasowych badań wynika, że mutacje w NRAS występują w ok. 3–5% kolejnych raków jelita grubego (głównie są to mutacje w kodonie 61) [36, 37]. Związek tych mutacji z czynnikami kliniczno-patologicznymi znajduje się obecnie w fazie badań [38]. Tym niemniej, ocena mutacji w NRAS w przypadkach, w których nie stwierdzono mutacji w KRAS, pozwala dokładniej wyselekcjonować chorych na raka jelita grubego z przerzutami do leczenia cetuksimabem [35]. Podobnie jak w BRAF, mutacje w NRAS i KRAS wzajemnie się wykluczają [34, 39]. Od 2013 r. badanie mutacji w eksonach 2, 3 i 4 NRAS jest elementem rutynowego testu predykcyjnego w kwalifikacji pacjentów z rakiem jelita grubego z przerzutami do terapii anty-EGFR.

2.3. BRAF

BRAF to cytoplazmatyczna niereceptorowa kinaza serynowo-treoninowa. Uczestniczy w przekazywaniu sygnałów z zewnątrz komórki do jądra komórkowego w szlaku RAS/RAF/MAPK [40]. Jest to jedna z częściej zmutowanych kinaz w nowotworach. Najczęściej wykrywana jest mutacja c.1799T>A (p.V600E) w eksonie 15. W eksonie tym mogą również występować inne mutacje lokujące się w pobliżu kodonu 600. Zmutowane białko BRAF jest ciągle aktywne [40]. Częstość występowania mutacji jest zróżnicowana w różnych nowotworach. W przypadku czerniaka może dochodzić nawet do ok. 70% [40]. Bardzo często, w ok. 50–70% przypadków, mutacje w BRAF wykrywa się w rakach brodawkowatych tarczycy [41, 42]. Z kolei w rakach jelita grubego mutacje w BRAF stwierdza się w zależności od badanej populacji w ok. 5–20% przypadków [5, 43, 44]. Mutacje w genie BRAF korelują z subtypem molekularnym raka jelita grubego, który charakteryzuje się MSI i fenotypem zmutowanych wysp CpG (CpG-island methylator phenotype – CIMP) [45]. Zmutowane białko BRAF wykrywa się również w zmianach przednowotworowych. Bardzo rzadko wykrywa się mutacje w BRAF w gruczolakach (0,4%), natomiast znacznie częściej w gruczolakach ząbkowanych (ok. 70–100%) [46, 47]. BRAF jako składnik szlaku RAS/RAF/MAPK oceniano jako czynnik prognostyczny i predykcyjny w raku jelita grubego. Mutacje w BRAF w raku jelita grubego są związane z niekorzystnym przebiegiem choroby, natomiast znaczenie predykcyjne BRAF nie jest jednoznaczne i jest ciągle intensywnie badane [43, 44].

2.4. PIK3CA

PI3K to lipidowe kinazy cytoplazmatyczne uczestniczące w przekazywaniu sygnału z białka RAS do wnętrza jądra komórkowego za pośrednictwem szlaku PI3K/AKT/PKB. Szlak odpowiada za blokowanie apoptozy oraz stymulacje wzrostu i proliferacji komórek. Szlak ten podlega negatywnej regulacji przez białko PTEN. Utrata funkcjonowania PTEN poprzez mutacje może również prowadzić do aktywacji tego szlaku [48]. Gen PIK3CA koduje podjednostkę p110 kinazy PI3K. Mutacje w PIK3CA występują w ok. 15–30% raków jelita grubego. Mutacje grupują się w hot spotach w eksonie 9 w kodonach E542K i E545K oraz w eksonie 20 w kodonie H1047R [49, 50]. Obecność mutacji w PIK3CA jest związana z niekorzystnym przebiegiem choroby, jak również z brakiem odpowiedzi na leczenie mAb anty--EGFR [50–52]. Siła prognostyczna i predykcyjna PIK3CA w raku jelita grubego zwiększa się, gdy jest on oceniany w kombinacji z ekspresją PTEN. Obecnie trwają intensywne badania dotyczące ich użyteczności klinicznej [53, 54].

2.5. Związek mutacji somatycznych z czynnikami kliniczno-patologicznymi

Określono specyficzne kliniczno-patologiczne i epidemiologiczne cechy związane z mutacjami w KRAS [55]. Stwierdzono związek lokalizacji raka jelita grubego oraz miejsca występowania przerzutów z obecnością mutacji w KRAS. U pacjentów z mutacjami w kodonach 12 i 13 występowało większe prawdopodobieństwo umiejscowienia raka jelita grubego prawostronnie w porównaniu z chorymi na raka jelita grubego bez mutacji KRAS [21]. Również mutacje w BRAF też mają związek z prawostronnym rakiem jelita grubego w porównaniu z nowotworami bez mutacji. Raki jelita grubego z mutacjami w KRAS (również z rzadkimi) częściej dają przerzuty do płuc w porównaniu z rakami jelita grubego bez tych mutacji.

3. Sygnatura genowej ekspresji RAS jako czynnik predykcyjny

Następstwem mutacji w KRAS lub NRAS jest permanentna aktywacja ścieżki sygnałowej RAS i ta informacja, jak wspomniano powyżej, została wykorzystana do selekcji chorych na raka jelita grubego z przerzutami do celowanego leczenia za pomocą mAb anty-EGFR. Trzeba sobie jednak zdawać sprawę z tego, że badanie mutacji w KRAS lub NRAS pozwala określić tylko jeden z wielu możliwych sposobów (mechanizmów) aktywacji RAS. Aktywowany RAS oddziałuje na ponad 20 białek efektorowych, które m.in. regulują proliferację i różnicowanie komórek [56]. Molekularna ścieżka sygnałowa RAS jest skomplikowaną siecią połączeń. Ścieżkę tę aktywuje nie tylko EGFR, lecz także szereg innych czynników wzrostu, takich jak np. receptor płytkopochodnego czynnika wzrostu (platelet-derived growth factor receptor – PDGFR), transformujący czynnik wzrostu  (transforming growth factor  – TGF-), epiregulina, amfiregulina. Deregulacja elementów składowych tej ścieżki powyżej lub poniżej RAS może spowodować jej aktywację nawet bez mutacji w RAS, ponieważ mutacja jest tylko jednym z wielu sposobów aktywacji ścieżki RAS. Możliwość aktywacji RAS przez wiele mechanizmów utrudnia w znacznym stopniu precyzyjne określenie nowotworów z rzeczywiście aktywowanym RAS. Dlatego istotnym zagadnieniem jest wyselekcjonowanie tych nowotworów, które mają aktywną ścieżkę sygnałową RAS niezależnie od mechanizmu tej aktywacji (tzn. nie tylko przez mutacje w KRAS lub NRAS). W przeciwieństwie do oceny pojedynczych mutacji w RAS, zastosowanie sygnatury genowej ekspresji RAS pozwala mierzyć aktywację (lub jej brak) sieci ścieżek sygnałowych RAS. W badaniach na komórkach raka drobnokomórkowego płuc wykazano ostatnio, że zastosowanie kombinacji erlotinibu (inhibitor EGFR) i trametinibu (inhibitor MEK) blokuje dwa ramiona ścieżek sygnałowych aktywnego RAS, tzn. EGFR-RAS-RAF-ERK i EGFR-PI3K-AKT-RPS6, co prowadzi do apoptozy komórek nowotworowych. Z badań tych wynika, że pacjenci z wysoką aktywnością ścieżki sygnałowej RAS mogą być kandydatami do leczenia wspólnie inhibitorami EGFR i MEK [56].
Podsumowując, badanie mutacji pozwala określić tylko jeden z wielu możliwych sposobów (mechanizmów) aktywacji RAS, a genomowy marker (sygnatura genowa) określa aktywność całej ścieżki sygnałowej.

4. Niestabilność mikrosatelitarna jako marker predykcyjny

W patogenezie raka jelita grubego odgrywają ważną rolę zaburzenia różnych ścieżek molekularnych. Większość raków jelita grubego powstaje na drodze niestabilności chromosomowej, ale w mniej więcej 15% sporadycznych raków jelita grubego oraz w zespole Lyncha stwierdza się inaktywację genów mutatorowych (MLH1, MSH2, PMS2 i MSH6), co prowadzi do MSI [57]. Ocena MSI na podstawie wyizolowanego DNA jest procedurą dość skomplikowaną i kosztowną. Nowotwór wykazuje MSI, jeżeli określona w rekomendacjach Bethesda [58] liczba sekwencji mikrosatelitarnych uległa mutacji. Gdy nie ma mutacji w panelu mikrosatelitarnym, to guz uważa się za mikrosatelitarnie stabilny (MSS) [57]. Wśród sporadycznych raków jelita grubego z fenotypem mutatorowym większość (ok. 95%) wykazuje inaktywację MLH1 (spowodowaną hipermetylacją promotora). Inaktywacja MSH2 i MSH6 występuje znacznie rzadziej (odpowiednio 5% i 1%) [59].
Niestabilność mikrosatelitarna jest markerem dobrego rokowania (czynnik prognostyczny), szczególnie w stadium II i III raka jelita grubego [60]. Przyczyny tego związku z dobrym rokowaniem nie zostały dokładnie poznane. Jedną z nich może być rzadkie występowanie mutacji APC, TP53 i KRAS w rakach jelita grubego z MSI. Alternatywną hipotezą wyjaśniającą dobre rokowanie raka jelita grubego z MSI jest obecność masywnego nacieku guza przez limfocyty [61]. Wydatną aktywację przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej tłumaczy się produkowaniem dużej liczby swoistych dla nowotworu antygenów typu frameshift powstałych w wyniku niesprawności układu naprawy niesparowanych zasad DNA (miss match repair – MMR). Komórki nowotworowe opłaszczone takimi antygenami mogą silnie aktywować układ odpornościowy chorego [62]. Raki jelita grubego powstałe na drodze inaktywacji genów mutatorowych mają charakterystyczny obraz kliniczno-patologiczny: zwykle umiejscowione są proksymalnie, są rakami śluzotwórczymi z naciekiem limfocytarnym i odczynem zapalnym.
Status MSI jest uważany za marker predykcyjny dla terapii opartej na 5-fluorouracylu. Na etapie badań jest status MSI jako markera predykcyjnego terapii z wykorzystaniem inhibitorów topoizomerazy, inhibitorów PARP1 i inhibitorów ścieżki PI3K-AKT-mTOR. Wysoki stopień MSI znamionuje brak wrażliwości na terapię adiuwantową z zastosowaniem 5-fluorouracylu, a korzyści z takiego leczenia odnoszą chorzy na raka jelita grubego MSS [63, 64]. Brak korzyści z tego typu leczenia sugeruje, że pacjenci ci nie powinni otrzymywać leczenia adiuwantowego opartego na 5-fluorouracylu. Trzeba jednak wspomnieć, że wyniki niektórych badań sugerują, że podział raków jelita grubego na MSI i MSS jest wprowadzającą w błąd nadmierną symplifikacją [65].
Z badań przedklinicznych wynika, że linie komórkowe raka jelita grubego z MSI mogą być bardziej wrażliwe na irinotekan [66]. Jednak wyniki badań związku MSI z odpowiedzią na chemioterapię opartą na irinotekanie w raku jelita grubego są niejednoznaczne. Ostatnio podjęto próby wykorzystania mechanizmu synthetic lethality [67, 68], testując inhibitory PARP1 na liniach komórkowych raka jelita grubego z MSI. Wykazano też, że takie komórki są wrażliwe na inhibitory ścieżki PI3K-AKT-mTOR [69].
Ekwiwalentem testu na obecność MSI jest ocena immunohistochemiczna (IHC) ekspresji białek kodowanych przez geny MLH1, MSH2, MSH6 i PMS2 z wykorzystaniem odpowiednich przeciwciał [57, 70]. Test IHC jest stosunkowo prosty, wyniki powtarzalne w zautomatyzowanej procedurze i łatwo można go włączyć do rutynowej oceny patomorfologicznej raka jelita grubego. Sposób interpretacji wyników zilustrowano w tabeli I. Ponadto brak ekspresji jednego lub kilku białek wskazuje, który z genów mutatorowych najprawdopodobniej uległ inaktywacji (mutacji). Białka kodowane przez geny mutatorowe tworzą heterodimery. Znajomość ekspresji białek tworzących te heterodimery umożliwia analizę inaktywacji poszczególnych genów (tab. I). Potencjalnym ograniczeniem testu IHC jest zależność uzyskiwanych wyników od jakości utrwalenia tkanki, barwienia i subiektywnej oceny reakcji IHC.

5. Nowe molekularno-predykcyjne klasyfikacje raka jelita grubego łączące fenotyp komórki z odpowiedzią na leczenie

Najprostszą molekularną klasyfikacją raków jelita grubego jest podział ze względu na niestabilność mikro-satelitarną i niestabilność chromosomową. Raki wykazujące cechy MSI (ok. 15%) dzieli się z kolei na raki jelita grubego na podłożu konstytucyjnych mutacji przynajmniej w jednym z genów mutatorowych (zespół Lyncha, ok. 3–5% raków jelita grubego) oraz raki jelita grubego sporadyczne (na podłożu inaktywacji MLH1, stanowiące ok. 10–15%). Raki jelita grubego z cechami niestabilności chromosomowej (ok. 85%) dzieli się również na raki o podłożu mutacji konstytucyjnych (zespoły FAP lub MAP, ok. 0,5–1%) oraz raki jelita grubego sporadyczne (ok. 85%). Klasyfikacja ta ma duże znaczenie patogenetyczne, ale niewielkie znaczenie predykcyjne, ponieważ nie dostarcza informacji predykcyjnej w 85% raków jelita grubego (tylko MSI jest markerem braku skuteczności leczenia adiuwantowego opartego na 5-fluorouracylu).
Na podstawie analizy profilu ekspresji genów opublikowano w ostatnich latach wiele propozycji klasyfikacji molekularnych raka jelita grubego o znaczeniu prognostycznym i/lub predykcyjnym [71–73] w nadziei, że poprawią one stratyfikację chorych do leczenia, szczególnie do leczenia celowanego. Poniżej omówiono pokrótce dwie z nich. Nie wiadomo jeszcze, które z tych klasyfikacji ostaną się w przyszłości w praktyce klinicznej i w jakim stopniu oraz pod jakim względem uzupełniają się nawzajem.
Sadanandam i wsp. [74, 75] przedstawili molekularno-predykcyjną klasyfikację raków jelita grubego, która łączy molekularny fenotyp komórek z odpowiedzią na leczenie, czyli jest to klasyfikacja o znaczeniu predykcyjnym. Wyróżniono 3, a następnie 6 podtypów raka jelita grubego w zależności od genów, których ekspresja występuje preferencyjnie:
1) goblet-like (GL) – rak typu komórek kubkowych, o fenotypie podobnym do komórek kubkowych),
2) enterocyte (E) – rak typu enterocytów, enterocytarny,
3) stem-like (SL) – rak typu komórek macierzystych, o fenotypie podobnym do komórek macierzystych,
4) inflammatory (I) – rak zapalny,
5) transit-amplifying (TA), w którym występują dwa podtypy:
5a) oporny na cetuksimab (CR TA),
5b) wrażliwy na cetuksimab (CS TA).
Podtyp GL charakteryzuje wysoka ekspresja typowych dla komórek kubkowych genów MUC2 i TFF3. Podtyp enterocytarny cechuje się wysoką ekspresją genów typowych dla enterocytu. Podtyp SL wyróżniony został na podstawie wysokiej ekspresji markerów docelowych ścieżki sygnałowej WNT, genów komórek macierzystych, mioepitelialnych i genów mezenchymalnych oraz niskiej ekspresji markerów różnicowania. Podtyp zapalny charakteryzuje się wysoką ekspresją genów kodujących chemokiny i interferon. Podtyp TA cechuje różna ekspresja genów typowych dla komórek macierzystych oraz markerów ścieżki sygnałowej WNT.
Każdy z tych molekularnych podtypów raka jelita grubego wykazuje podobieństwo do odpowiadającej mu pod względem profilu ekspresji genów komórki prawidłowej krypty jelita grubego, a jednocześnie różny stopień stemness (podobieństwa do profilu ekspresji genów komórek macierzystych) i ekspresji ścieżki sygnałowej WNT. Na przykład sygnatura genowa podtypu SL jest prawie identyczna z sygnaturą genową komórek macierzystych, które znajdują się w pobliżu dna krypt. Podtyp SL jest najbardziej niezróżnicowanym rakiem i ma najwyższą ekspresję ścieżki sygnałowej WNT oraz markerów komórek macierzystych. Z drugiej strony, podtyp o fenotypie podobnym do komórek kubkowych (GL) charakteryzuje się niską ekspresją markerów komórek macierzystych i ścieżki WNT (profil ekspresji dobrze zróżnicowanych raków).
Wyżej wymienione podtypy raka jelita grubego można rozpoznać, stosując markery wykrywane za pomocą qRT-PCR albo za pomocą immunohistochemii. W metodzie IHC wykorzystywane są następujące markery: ZEB1, RARRES3, CFTR, FLNA, MUC2, TFF3. Charakterystykę poszczególnych podtypów przedstawiono w tabeli II.
Chociaż cetuksimab stosowany jest w leczeniu raka jelita grubego z przerzutami bez mutacji w KRAS i NRAS, to jednak wyniki leczenia adiuwantowego są niezadowalające, niezależnie od genotypu RAS [76]. W związku z tym podejmowane są próby poszukiwania precyzyjniejszego określenia grupy pacjentów z rakiem jelita grubego, którzy odniosą korzyść z leczenia cetuksimabem. Omawiana w niniejszej pracy nowa molekularna klasyfikacja raka jelita grubego zdaje się spełniać to zadanie. Wykazano związek tej klasyfikacji z odpowiedzią na cetuksimab u chorych na raka jelita grubego z przerzutami do wątroby. Ocena ekspresji CFTR, a następnie FLNA pozwala wyróżnić wśród raków TA takie, które są wrażliwe na cetuksimab (niska ekspresja FLNA) – ok. 50%, i takie, które są niewrażliwe na cetuksimab, a reagują na inhibitory c-MET (wysoka ekspresja FLNA). Z kolei tylko ok. 22% raków typu GL i SL wykazało odpowiedź na leczenie cetuksimabem.
Molekularne podtypy raka jelita grubego różnią się nie tylko pod względem odpowiedzi na cetuksimab, ale również na standardową (FOLFIRI) chemioterapię. Wyniki leczenia za pomocą FOLFIRI w leczeniu adiuwantowym lub w leczeniu raka jelita grubego z przerzutami mogą zależeć od podtypu molekularnego (w leczeniu nieselekcjonowanych raków jelita grubego FOLFIRI nie poprawia przeżycia). Najlepsze wyniki leczenia w schemacie FOLFIRI uzyskuje się w leczeniu pacjentów z podtypem SL (w leczeniu adiuwantowym i u chorych z przerzutami) oraz w leczeniu podtypu zapalnego (w leczeniu adiuwantowym). Podtypy TA i GL prawdopodobnie nie będą wrażliwe na FOLFIRI w adiuwancie. Pacjentom tym można oszczędzić toksyczności tego leczenia. Omawiana klasyfikacja ma też znaczenie prognostyczne (tab. II).
Roepman i wsp. [71] opublikowali trzystopniową molekularną klasyfikację raków jelita grubego. Raki typu A charakteryzowały się wysokim odsetkiem aktywujących mutacji w KRAS i BRAF (ok. 60%), niskim indeksem proliferacyjnym, cechami MSI, brakiem wyraźnego związku z odpowiedzią na leczenie adiuwantowe oparte na 5-fluorouracylu i dobrym rokowaniem. Raki typu B cechowały: niski odsetek ww. mutacji, wysoki indeks proliferacyjny, brak niestabilności mikrosatelitarnej (MSS), dobra odpowiedź na chemioterapię adiuwantową z 5-fluorouracylem, ale złe rokowanie. Raki typu C (o fenotypie mezenchymalnym) charakteryzowały się: niskim indeksem proliferacji, opornością na terapię opartą na 5-fluorouracylu i złym rokowaniem.

6. Krążące komórki nowotworowe i pozakomórkowe DNA (cfNA) jako źródło materiału diagnostycznego w przyszłości, tzw. biopsja płynów

Wśród chorych onkologicznych za 90% zgonów odpowiada uogólniona choroba nowotworowa [77]. Nierzadko w przypadku zaawansowania choroby nowotworowej (rak płuca, jelita czy piersi) są trudności w pozyskaniu materiału diagnostycznego. Sytuacja ta wprowadza dodatkowy czynnik obciążający i stresujący, obok choroby nowotworowej dla pacjenta. Potrzeba więc poszukiwania innych źródeł materiału, który byłby łatwo pobierany, dostarczał danych diagnostycznych do regularnego monitorowania skuteczności leczenia. Materiałem o takich cechach jest krew obwodowa, która dociera do wszystkich komórek organizmu [78]. Od XIX w. wiadomo, że we krwi pacjentów z nowotworami niehematologicznymi krążą komórki nowotworowe (circulating tumour cells – CTC) [79]. Krążące komórki nowotworowe biorą udział w powstawaniu przerzutów odległych. Są to komórki, które pochodzą z guza pierwotnego i za pośrednictwem krwiobiegu docierają w miejsca utworzenia przerzutu odległego [80]. Pierwszy opis CTC pochodzi z 1869 r. [79]. Dotyczy obserwacji występowania we krwi komórek podobnych do tworzących guzy poczynionej przez australijskiego lekarza Thomasa Ashwortha [79]. Jednakże dopiero ponad 130 lat później dzięki postępowi technologicznemu udało się zacząć systematycznie badać CTC [81]. Opublikowane dane wskazują na znaczenie prognostyczne monitorowania ilości CTC w leczeniu raka jelita grubego. Pomiar ilości CTC jest niezależnym czynnikiem rokowniczym w raku jelita grubego [82, 83]. Obecnie dzięki selektywnemu wzbogacaniu tych komórek możliwe stało się wykrywanie w nich mutacji predykcyjnych [24]. Obecnie trwają intensywne badania kliniczne oceniające znaczenie CTC w diagnostyce i monitorowaniu skuteczności leczenia nowotworów litych [84, 85].
W XX w. dowiedziono również, że w osoczu pobranym od pacjentów onkologicznych można wykryć pozakomórkowe kwasy nukleinowe (circulating tumor DNA – ctDNA) [86]. Wolno krążące kwasy nukleinowe (circulating free nucleic acids – cfNA) mogą być uwalniane przez normalne komórki, komórki podścieliska nowotworu oraz same komórki nowotworowe. Uwalnianie cfNA może być spowodowane nekrozą i apoptozą. ródłem ctDNA są komórki nowotworowe, które ulegają apoptozie [86, 87]; ctDNA stanowi 1,4–47,9% cfNA w krwiobiegu pacjentów onkologicznych [88]. ctDNA jest obecne u 50–75% pacjentów z zaawansowanym, jak również zlokalizowanym nowotworem (np. rak trzustki, piersi, jelita, nerki, mózgu). W przypadku raka jelita grubego ctDNA można wykryć u 70% pacjentów z chorobą zlokalizowaną oraz do 100% z chorobą uogólnioną [89, 90]. Pochodzące z komórek nowotworowych ctDNA jest zwykle pofragmentowane i małej długości ok. 100 bp [91]. Inni autorzy wskazują, że wielkość ctDNA uwolniona z komórek w wyniku apoptozy wynosi 200 bp. Z kolei cfDNA uwolnione w wyniku nekrozy może być dłuższe niż 200 bp (wielkość nukleosomalnego DNA) [92, 93]. W przypadku raka jelita grubego proporcja zmutowanego allelu KRAS może sięgać 0,13–69% (mediana 10,5%) w porównaniu z allelem bez mutacji [90, 91]. Wykazano, że czułość i specyficzność oceny mutacji BRAF V600E w ctDNA w porównaniu z tkanką guza wyniosły 100%. W przypadku mutacji w KRAS specyficzność i czułość wyniosły odpowiednio 98% i 92% [90]. Udowodniono, że analiza ctDNA (obecność mutacji KRAS) może mieć znaczenie diagnostyczne, prognostyczne i predykcyjne (dla terapii celowanych) w raku jelita grubego [92]. Dużą zaletą analizy ctDNA jest możliwość wcześniejszego – nawet do 10 miesięcy – wykrycia progresji choroby w porównaniu z metodami radiologicznymi [28, 94]. W przypadku raka jelita grubego za pomocą analizy ctDNA zrekonstruowano mutacje w całym genomie na poziomie chromosomów (translokacje, delecje, amplifikacje) [88]. Próbuje się również wykorzystać ctDNA jako narzędzie skriningowe [95]. Jednak potrzeba jeszcze czulszych metod do detekcji ctDNA, opartych np. na masowym równoległym sekwencjonowaniu, zdolnych wykryć w próbce allel z mutacją stanowiącą ok. 0,2% cfNA [96].

7. Wybór przypadku

7.1. Wskazania do wykonania testu – zalecenia kliniczne

Zgodnie z zaleceniami NCCN (National Comprehensive Cancer Network) [97] wszyscy pacjenci z przerzutowym rakiem jelita grubego (stadium IV) powinni mieć oznaczony status genów KRAS i NRAS zwalidowaną metodą. Badanie mutacji w BRAF i PIK3CA nie jest zalecane jako rutynowy test predykcyjny. Na razie NCCN rekomenduje badanie mutacji w BRAF jako markera prognostycznego u chorych na raka jelita grubego z przerzutami.

7.2. Kiedy powinny zostać wykonane testy KRAS i NRAS?

Obecnie rekomenduje się oznaczenie mutacji w KRAS i NRAS u pacjentów z rakiem jelita grubego w momencie zdiagnozowania przerzutów. Nie jest to równoznaczne z rekomendacją stosowania leczenia anty-EGFR w pierwszej linii chemioterapii u pacjentów z rakiem jelita grubego z przerzutami, ale ma na celu lepsze zaplanowanie leczenia. Ten sposób wymaga sprawnego dostarczenia bloczków do pracowni, w której takie badania się wykonuje. Najszybciej można to zrobić, gdy genotypowanie odbywa się w zakładzie patomorfologii, który wykonał badanie histopatologiczne, ponieważ bloczki i preparaty histologiczne (potrzebne do wyboru odpowiedniego bloczka) już się tam znajdują lub gdy pracownie histopatologii i biologii molekularnej są w strukturach jednej jednostki w bliskim kontakcie. Alternatywna propozycja, aby genotypowanie RAS wykonywać w każdym przypadku po ustaleniu rozpoznania raka jelita grubego, ma pewne zalety, ale również poważne ograniczenia. Główną zaletą jest to, że od razu wiadomo, czy celowana terapia anty-EGFR w ogóle będzie możliwa u danego chorego. Istnieją dwa ważne argumenty przeciwko takiemu postępowaniu:
• wykonywanie pewnej liczby kosztownych, a jednocześnie niepotrzebnych badań (chorzy, którzy nie będą mieli przerzutów); problem ten można częściowo rozwiązać, ograniczając się do wykonywania genotypowania w momencie ustalenia rozpoznania tylko w ściśle określonej podgrupie chorych na raka jelita grubego z cechami złego rokowania (dużego prawdopodobieństwa wystąpienia przerzutów);
• w miarę jak rośnie liczba genów, w których powinno się oceniać mutacje, aby podjąć decyzję co do leczenia anty-EGFR, należałoby powtórnie testować raki jelita grubego, które już uprzednio genotypowano tylko w ograniczonym zakresie.

7.3. Czy ekspresja białka EGFR ma znaczenie w kwalifikacji pacjentów do badania mutacji w RAS i w kwalifikacji do leczenia anty-EGFR?

Nadekspresja białka EGFR występuje w różnych rakach, w tym w 72–97% raków jelita grubego [98, 99]. Immunohistochemiczna ocena ekspresji EGFR jako czynnika predykcyjnego dla terapii za pomocą mAb anty-EGFR nie spełniła pokładanych w niej nadziei, chociaż początkowo (2004 r.) FDA zaaprobowała diagnostyczny test (EGFR PharmDx™ Kit) i leczenie cetuksimabem lub panitumumabem w raku jelita grubego z ekspresją białka EGFR [100]. W wielu pracach wykazano jednak, że ocena ekspresji białka EGFR w raku jelita grubego za pomocą IHC nie pozwala na przewidywanie odpowiedzi na leczenie, które może być skuteczne również w rakach jelita grubego niewykazujących ekspresji EGFR [101–104].
Oprócz możliwych przyczyn związanych z metodyką IHC i oceną reakcji IHC możliwe są także inne istotne powody, dla których ocena IHC ekspresji EGFR nie zyskała rangi czynnika predykcyjnego w raku jelita grubego. Jakość reakcji IHC na obecność ekspresji EGFR zależy w dużym stopniu od sposobu utrwalenia tkanki oraz czasu przechowywania materiału (nawet w tak krótkim okresie jak 3–24 miesięcy) [105]. Ze względu na powyższe można stwierdzić, że publikowane wyniki korelacji immunohistochemicznej ekspresji EGFR z rokowaniem lub terapią są mało wiarygodne, ponieważ zwykle wykorzystują bloczki z różnych instytucji przechowywane przez różny czas (od miesięcy do lat), w różnych warunkach archiwizacji oraz różnie utrwalone [106]. Ponadto EGFR na powierzchni komórki znajduje się w dwóch postaciach: high-affinity i low-affinity (stanowi większość receptorów, ale w niewielkim stopniu aktywuje kinazę tyrozynową, co jest niezbędne do aktywacji ścieżki sygnałowej poniżej EGFR). Niestety, stosowane przeciwciała nie „widzą” różnicy między tymi dwoma rodzajami receptorów [107, 108].
Z podanych wyżej powodów rutynowe badanie białka EGFR obecnie nie jest rekomendowane. Zgodnie ze współczesnym stanem wiedzy i jednoznacznymi rekomendacjami, żaden pacjent nie powinien zostać wykluczony z leczenia cetuksimabem lub panitumumabem na podstawie braku ekspresji białka EGFR w guzie! [106] Niestety obecnie w Polsce zgodnie z Obwieszczeniem Ministra Zdrowia z dnia 1 stycznia 2015 r. [109] ocena ekspresji białka EGFR jest wymagana przy kwalifikacji do leczenia cetuksimabem i panitumumabem. Za dodatni jest uznawany odczyn „w co najmniej 1% komórek nowotworowych” [109], niezależnie od tego, czy jest to odczyn błonowy czy cytoplazmatyczny, gdyż obwieszczenie tego nie precyzuje. Szczególnie odczyn cytoplazmatyczny daje dużą dowolność interpretacji, co można w obecnym stanie prawnym wykorzystać na korzyść pacjenta. Wiele wysiłku w ostatnich latach włożono, aby badanie mutacji RAS wykonywać zwalidowanymi metodami w ośrodkach, które poddają się zewnętrznej kontroli jakości. Niestety, wysiłek ten jest marnowany poprzez badanie ekspresji białka EGFR w rakach jelita grubego z przerzutami niezwalidowanymi metodami, a jakość tych badań nie jest w żaden sposób kontrolowana.

7.4. Znaczenie heterogenności nowotworu pod względem występowania mutacji w KRAS

Wyniki ostatnich badań dostarczyły dowodów na niezwykłą heterogenność raka jelita grubego pod względem występowania mutacji w KRAS (a również w BRAF i PIK3CA) [3]. W raku jelita grubego, w którym stwierdza się tzw. klonalną heterogenność pod względem obecności mutacji KRAS, występują dwie subpopulacje komórek nowotworowych: jedna z mutacją w KRAS i druga bez mutacji, albo dwie subpopulacje, z których każda charakteryzuje się innymi mutacjami. Istnienie niewielkiego klonu komórek nowotworowych z mutacją w KRAS w raku jelita grubego „bez mutacji”, może nie tylko mieć znaczenie dla kwalifikacji chorych do leczenia anty-EGFR, ale również zwiastować możliwość powstania oporności w trakcie takiej terapii, ponieważ w czasie leczenia komórki rakowe z mutacją mają szansę uzyskać liczebną przewagę [28, 94]. Niestwierdzenie takiej subpopulacji poważnie utrudnia przewidywanie reakcji na leczenie anty-EGFR [110–112]. Początkowo tylko w pojedynczych pracach w piśmiennictwie opisano przypadki heterogenności pod względem mutacji w KRAS w raku jelita grubego (w obrębie guza pierwotnego) [113–117]. Z badań tych wynikało, że mniejszość raków jelita grubego wykazuje mieszaninę subpopulacji komórek rakowych z mutacją w eksonach 2 i 3 KRAS i subpopulacji bez mutacji. Ponadto, nawet gdy taka sytuacja miała miejsce, komórki nowotworowe z mutacją KRAS zajmowały ponad 80% powierzchni badanego skrawka w ponad 75% przypadków raka jelita grubego [116]. Z kolei w 30 przypadkach wykazano całkowitą zgodność genotypu KRAS w biopsji z rakiem jelita grubego i w całym usuniętym guzie [118]. Porównując występowanie mutacji w centrum guza i na jego inwazyjnym obwodzie, stwierdzono heterogenność obecności mutacji w KRAS, BRAF i PIK3CA odpowiednio w 8%, 1% i 5% pierwotnych raków jelita grubego [115]. Pirosekwencjonowanie dostarczyło dowodów na dużego stopnia klonalną heterogenność pomiędzy centrum i obwodem raka jelita grubego (różnice występowały w blisko 44% przypadków). Stwierdzono współwystępowanie mutacji w PIK3CA i BRAF lub KRAS w znacznym odsetku przypadków raka jelita grubego. Występowanie dwóch różnych mutacji KRAS w różnych częściach tego samego raka jelita grubego, jak również heterogenność mutacji wewnątrz guza (np. obecność mutacji w centrum a nieobecność na obwodzie lub odwrotnie) świadczy o bardzo dużej molekularnej heterogenności raka jelita grubego, która może znajdować odzwierciedlenie w przebiegu choroby i reakcji na leczenie. Z tego punktu widzenia szczególnie interesujące jest współwystępowanie mutacji w KRAS/PIK3CA, gdyż powoduje ono jednoczesną aktywację ścieżek sygnałowych PI3K/AKT/mTOR i RAS/RAF/MEK, co może mieć związek z opornością na leczenie inhibitorami PI3K/AKT/mTOR [3].
W świetle wyników omówionych powyżej badań trzeba podkreślić niezwykle istotne kliniczne znaczenie metod wykrywania mutacji RAS, które charakteryzują się wysoką czułością oraz powtarzalnością wyników i są certyfikowane do badań in vitro (CE-IVD), a jednocześnie są to procedury laboratoryjne stosunkowo proste i szybkie. Warto wspomnieć, że terapia anty-EGFR została zaaprobowana na podstawie wyników uzyskanych właśnie z wykorzystaniem metod o wysokiej czułości. Takie testy o wysokiej czułości pozwalają wykryć niewielkie liczbowo klony komórek z mutacjami w KRAS w guzach, które byłyby określone jako niewykazujące mutacji przy zastosowaniu metod detekcji mutacji o mniejszej czułości (jak np. sekwencjonowanie metodą Sangera), a tym samym pozwalają zidentyfikować pacjentów opornych na leczenie anty-EGFR. Malapelle i wsp. [26], wykorzystując metody o wysokiej czułości, zidentyfikowali o 8% więcej mutacji KRAS u chorych opornych na leczenie cetuksimabem, a Molinari i wsp. [24] wykazali obecność dodatkowo wykrytych mutacji KRAS w prawie 11% raków jelita grubego w porównaniu z wynikami sekwencjonowania. Wykazano też, że ocena mutacji w KRAS metodami o wysokiej czułości lepiej koreluje z wynikami terapii anty-EGFR niż ocena za pomocą sekwencjonowania [24–27, 29–31]. Opublikowana ostatnio (w 2014 r.) metaanaliza prowadzi do takich samych wniosków [31].
W podsumowaniu autorzy stwierdzają, że metody detekcji o wysokiej czułości i specyficzności wykorzystujące PCR, wykrywając dodatkowych pacjentów z mutacjami w KRAS zwiększają średnie przeżycie chorych i przeżycie do wystąpienia progresji choroby. Ponadto pozwalają chorym z mutacjami w KRAS uniknąć niepotrzebnego leczenia anty-EGFR z jego skutkami ubocznymi, a dają tym chorym szansę na wdrożenie odpowiedniego dla nich leczenia. Wykorzystanie metod opartych na PCR do oceny raka jelita grubego, w których uprzednio sekwencjonowaniem nie stwierdzono mutacji miało związek z wydłużeniem czasu przeżycia chorych. Natomiast w grupie chorych z wykrytą już mutacją w KRAS efektu tego nie stwierdzono. Zastosowanie metodologii o zwiększonej czułości pozwala wykryć klonalną heterogenność KRAS nawet w ok. 50% przypadków raków jelita grubego [3].
Wykrycie klonalnej heterogenności zależy zatem od czułości metody stosowanej do oceny mutacji KRAS. Nawet w materiale poddanym mikrodyssekcji subpopulacje komórek nowotworowych z mutacjami w KRAS mogą być liczbowo niewielkie, co wymaga metod analitycznych o dużej czułości. W idealnej sytuacji, jeżeli materiał uzyskany drogą mikrodyssekcji zawiera ok. 90% komórek rakowych, zastosowana metoda detekcji mutacji KRAS powinna dawać możliwość wykrycia subpopulacji ok. 1–2% komórek nowotworowych z mutacją. W odniesieniu do testu o znaczeniu predykcyjnym nie jest to wymaganie specjalnie wygórowane, biorąc pod uwagę, że minimalny wymagany odsetek komórek rakowych wykazujących ekspresję receptora estrogenów w raku sutka wynosi 1% dla terapii antyestrogenowej [119]. Podsumowując, należy stwierdzić, że tylko metody detekcji mutacji cechujące się wysoką czułością i specyficznością pozwalają na stratyfikację chorych na raka jelita grubego, która umożliwia najlepsze wykorzystanie istniejących obecnie sposobów celowanej terapii.
Z praktycznego punktu widzenia można ograniczyć się do następujących rekomendacji. Do badania mutacji RAS należy wykorzystywać materiał z usuniętego guza (cały przekrój guza), a nie z biopsji endoskopowej. Jeżeli jedynie taka biopsja jest dostępna i nie stwierdzono w niej mutacji RAS, nie ma uzasadnienia w piśmiennictwie dla ponawiania biopsji, aby wykluczyć ewentualną heterogenność.

7.5. Czy należy genotypować pierwotny rak jelita grubego czy przerzuty?

Wyniki przeprowadzonej metaanalizy [120] wskazują na bardzo wysoki stopień korelacji występowania mutacji w KRAS w guzie pierwotnym i w przerzutach (ok. 94% zgodności). Zastosowanie techniki sekwencjonowania następnej generacji (next generation sequencing – NGS) wykazało nawet 100-procentową zgodność w przypadku KRAS, NRAS i BRAF pod względem występowania mutacji w guzie pierwotnym i przerzucie (badano niemal wyłącznie przerzuty w wątrobie) [121]. Jednakże ta zgodność wyników w pewnym stopniu zależy od umiejscowienia przerzutów [122] i jest mniejsza w przypadku przerzutów do płuc i węzłów chłonnych. W odniesieniu do węzłów chłonnych heterogenność występowała w 31% (KRAS), 4% (BRAF) i 13% (PIK3CA) przypadków. Ze względu na zbyt duże rozbieżności między guzem pierwotnym i przerzutowym Baldus i wsp. [115] nie rekomendują pobierania materiału do oceny mutacji w KRAS z przerzutów w węzłach chłonnych. Chociaż wydaje się, że jeżeli tkanka z przerzutu jest dostępna (z wyjątkiem węzłów chłonnych), wskazane byłoby wykonanie genotypowania w tym materiale, to nie ma dostatecznie udokumentowanych danych w piśmiennictwie, aby rekomendować wykonywanie biopsji przerzutu specjalnie w celu genotypowania KRAS i NRAS.

8. Kwestie przedanalityczne badania mutacji somatycznych

8.1. Typ materiału przydatnego do diagnostyki

Do oceny mutacji somatycznych można wykorzystać różnego typu materiał biologiczny: tkankę pooperacyjną świeżą i utrwaloną, materiał cytologiczny świeży i utrwalony.

8.1.1. Tkanka pooperacyjna

Zdecydowanie najlepszym materiałem do diagnostyki jest materiał pooperacyjny. Zwykle wybiera się do diagnostyki materiał dostępny w laboratorium, ponieważ liczy się czas wykonania badania. Zaletą materiału pooperacyjnego jest możliwość oceny jego komórkowości. Umożliwia to wykonanie makro- lub mikrodyssekcji w celu wzbogacenia zawartości komórek nowotworowych wybranych do izolacji DNA. Ułatwia to wybór metody diagnostycznej.
Głównie do diagnostyki jest wykorzystywany materiał utrwalony w 10-procentowej zbuforowanej formalinie. Utrwalenie materiału i wykonanie w postaci bloczków parafinowych powoduje, że jakość tego materiału jest słabszej jakości. Proces wykonania bloczka prowadzi do fragmentacji DNA [123]. Może to powodować trudności w przeprowadzeniu badania lub nawet całkowicie je uniemożliwić. Opisano, że proces utrwalania może czasami wprowadzać modyfikacje chemiczne nukleotydów, których rezultatem są artefaktowe mutacje [124]. W rezultacie może spowodować to uzyskanie wyniku fałszywie dodatniego, który oznacza dla pacjenta wykluczenie z potencjalnie skutecznej terapii. Obecnie opracowano strategie postępowania z materiałem utrwalonym w formalinie, które minimalizują ryzyko wykrycia artefaktowej mutacji zarówno w badaniu pojedynczych mutacji, jak i w technice NGS [125–127]. Do izolacji DNA potrzeba 3–5 niebarwionych skrawków w zależności od masy guza oraz preparatu HE z zaznaczoną masą guza. Należy nadmienić, że preparaty histopatologiczne po skrojeniu należy wykorzystać w ciągu kilku dni, ponieważ DNA może degradować w wyniku oksydacji.
Diagnostykę raka jelita grubego można również przeprowadzić, wykorzystując do tego celu świeży materiał pooperacyjny, wybrany przez patologa i przekazany do diagnostyki lub materiał uprzednio zamrożony i przechowywany w temperaturze –80°C. Materiał ten jest bardzo dobrej jakości. Wadą jest natomiast brak mikroskopowej oceny zawartości komórek nowotworowych. Rozwiązaniem tego problemu mogłoby być wykonanie preparatu mrożonego i ocena jego komórkowości. W obu przypadkach (materiał świeży lub mrożony) możliwe jest zabezpieczenie materiału metodą awers–rewers. W trakcie pobierania przez patologa materiału do diagnostyki awers jest przekazywany do wykonania preparatu mrożonego lub histopatologicznego (klasycznego), natomiast rewers do mrożenia lub bezpośredniego wykonania badania molekularnego. Dlatego po zakończonej ocenie mikroskopowej możliwe jest oszacowanie komórkowości materiału świeżego lub mrożonego, który zostanie przeznaczony do wykonywania diagnostyki molekularnej.
Obecnie standardem jest prowadzenie diagnostyki molekularnej na bazie bloków parafinowych. Jest to proces najmniej skomplikowany, a badania molekularne są naturalnym uzupełnieniem badania histopatologicznego. Z kolei w przypadku wykorzystania materiału świeżego powstają trudności wynikające z reorganizacji pracy oraz dodatkowych nakładów finansowych.

8.1.2. Materiał cytologiczny

W przypadku braku materiału pooperacyjnego do diagnostyki raka jelita grubego można wykorzystać materiał cytologiczny, który również umożliwia ocenę liczby komórek nowotworowych. Wykorzystanie rozmazów wiąże się ze zniszczeniem preparatu w sytuacji, gdy jest dostępne kilka szkiełek. Z kolei w przypadku tylko jednego preparatu możliwe jest wybranie przez patologa części preparatu do zeskrobania w celu wykonania badania molekularnego, a następnie powtórne zaklejenie preparatu. W ten sposób reszta preparatu pozostaje diagnostyczna i jest ciągle elementem dokumentacji pacjenta. Bezpośrednie i szybkie utrwalanie w alkoholu powoduje, że DNA jest bardzo dobrej jakości do wykonania analiz molekularnych. Nie zaleca się stosowania innych utrwalaczy.
W celu przyspieszenia diagnostyki można również po zakończeniu biopsji i wykonaniu rozmazów zabezpieczyć resztki materiału, dodatkowo przepłukując igłę zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej. Tak uzyskany materiał zamraża się w temperaturze –80°C. Decyzję o wykonaniu badania z tego materiału podejmuje się po uzyskaniu wyników z biopsji oceniającej obecność wystarczającej liczby komórek nowotworowych. Jest to bardzo dobrej jakości materiał do wykonania analiz molekularnych.

8.1.3. Cytoblok

Materiał zabezpieczony w postaci cytobloku również może zostać wykorzystany do analizy molekularnej w przypadku, gdy nie ma materiału pooperacyjnego oraz nie można wykorzystać rozmazów. Technika cytobloku umożliwia procentową ocenę zawartości komórek nowotworowych. DNA jest dobrej jakości do wykonania badań molekularnych.

8.2. Zawartość komórek nowotworowych w preparacie

W zależności od czułości zastosowanej metody wymagana zawartość komórek nowotworowych w preparacie może wynosić od 1–5% (techniki qPCR) do 50% (technika sekwencjonowania metodą Sangera; tab. III).

8.3. Makro- i mikrodyssekcja

W celu zwiększenia odsetka komórek rakowych w badanym preparacie, a co za tym idzie – zwiększenia ilości DNA pochodzącego z komórek rakowych w stosunku do DNA pochodzącego z komórek podścieliska, stosuje się makro- lub mikrodyssekcję [128]. Mikrodyssekcję można podzielić na manualną (pod mikroskopem) i laserową. Mikrodyssekcja laserowa jest najdokładniejszą techniką, zapewniającą niemal 100-procentową populację komórek rakowych w badanym materiale. Jednak aż taki poziom dokładności nie jest wymagany w badaniu mutacji somatycznych, dlatego techniki tej nie wykorzystuje się do rutynowych badań. Poza tym mikrodyssekcja laserowa wymaga drogiego sprzętu i jest czasochłonna.
W makrodyssekcji preparat zabarwiony HE używany jest jako wzorzec, na którym obrysowuje się utkanie raka. Następnie na niezabarwionym preparacie przeznaczonym do izolacji DNA należy postarać się zidentyfikować miejsce korespondujące z rakiem na preparacie HE i zdrapać do probówki za pomocą sterylnego skalpela lub igły bez otaczającej tkanki (na ile jest to możliwe). Makrodyssekcja jest techniką najprostszą, najszybszą, ale najmniej dokładną.
Manualna mikrodyssekcja [129] wykonywana jest pod standardowym mikroskopem świetlnym lub mikroskopem odwróconym na zabarwionych preparatach, najczęściej fioletem krezylu lub hematoksyliną. Barwniki te nie wpływają na ilość i jakość izolowanego DNA [130–132]. Użycie barwnika umożliwia łatwe zidentyfikowanie miejsca, gdzie jest rak, i jego dokładniejsze wycięcie bez otaczających tkanek, bez większych pól martwicy i ognisk włóknienia wewnątrz guza oraz bez niezmienionej błony śluzowej jelita oraz części adenomatycznej. Następnie utkanie raka jest zdrapywane ze szkiełka podstawowego do probówki za pomocą sterylnego skalpela lub igły. Można również zrobić odwrotnie – najpierw usunąć za pomocą skalpela lub igły podścielisko i otaczającą tkankę, a później zdrapać to, co zostało, do probówki. Technika ta jest bardzo prosta, nieznacznie bardziej czasochłonna niż makrodyssekcja, ale zapewnia większą dokładność i daje pewność, że miejsce, które zostało wycięte, na pewno zawiera utkanie raka. W połączeniu z technikami diagnostycznymi o wysokiej czułości zapewnia jeszcze wyższą jakość badania i daje możliwość wykrycia klonów komórek z mutacjami, co ma znaczenie kliniczne i zapewnia lepszą odpowiedź na leczenie anty-EGFR [24–27, 29–31]. Kombinacja najlepszych technik możliwych do zastosowania w badaniach rutynowych (manualna mikrodyssekcja plus technika diagnostyczna o wysokiej czułości) eliminuje konieczność oceny komórkowości w badanym preparacie, która jest elementem bardzo subiektywnym [128, 133, 134] i ocenianym w preparacie HE, który nie zawsze odpowiada zawartości głębiej skrojonych preparatów. Dlatego też manualna mikrodyssekcja jako technika najbardziej optymalna powinna być stosowana w każdym przypadku badania mutacji somatycznych.

8.4. Izolacja DNA

Metoda izolacji DNA jest bardzo ważna, ponieważ brak wydajnej izolacji, szczególnie z materiału zdegradowanego lub skąpokomórkowego, może skutkować niemożnością wykonania badania. Ważnym etapem jest pomiar stężenia wyizolowanego DNA i jego czystości (mierzony spektrofotometrycznie stosunek 260/280 powinien zawierać się w przedziale pomiędzy 1,8 a 2,0). Ostatnie badania wskazują jednak, że pomiar spektrofotometryczny pięciokrotnie zawyża wartość stężenia DNA w stosunku do pomiaru prowadzonego za pomocą metod opartych na fluorescencyjnych barwnikach interkalujących DNA czy qPCR [135]. Na rynku jest obecnych wiele zestawów do izolacji DNA z bloków parafinowych. Dobrej jakości DNA uzyskuje się, wykorzystując zestawy zawierające kolumienki ze złożem krzemionkowym oraz kulki magnetyczne (np. Maxwell 16 z CE-IVD, Promega, USA). Użycie zestawów do izolacji zapewnia dobrą jakość i powtarzalność izolacji DNA na potrzeby diagnostyki molekularnej.

9. Metody diagnostyczne wykorzystywane w patologii molekularnej raka jelita grubego

Wybór metody diagnostycznej powinien być uzależniony od jakości materiału oraz zawartości komórek rakowych. Laboratorium powinno dysponować przynajmniej dwiema technikami służącymi do wykrywania mutacji somatycznych, najlepiej testem CE-IVD opartym na qPCR oraz testem z zastosowaniem sekwencjonowania metodą Sangera. W Polsce wciąż jednak jest to kosztowne, podraża wykonanie badania oraz wydłuża czas jego wykonania. Porównanie najważniejszych metod diagnostycznych wykorzystywanych do wykrywania mutacji somatycznych przedstawiono w tabeli III.

9.1. Sekwencjonowanie metodą Sangera

Sekwencjonowanie metodą Sangera jest uznawane za złoty standard w diagnostyce molekularnej (ryc. 1.). Limit detekcji tej metody to tylko ok. 10–20% komórek nowotworowych w analizowanej próbce (tab. III), co uznaje się za jej wadę [136, 137]. Metoda ta jest czaso-chłonna i wymaga inwestycji w drogi sprzęt. Jest też wrażliwa na degradację DNA – niejednokrotnie degradacja uniemożliwia uzyskanie wyniku badania. Wielką zaletą tej metody jest to, że wykrywa wszystkie mutacje obecne w porównaniu z testami qPCR, które wykrywają tylko hot spoty. W trakcie analizy i interpretacji wyników sekwencjonowania należy zwrócić uwagę na: zawartość komórek nowotworowych w preparacie, wykrycie niespotykanych mutacji nieopisywanych w bazie COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) czy piśmiennictwie, gdyż mogą być wynikiem procesu utrwalania.

9.2. Pirosekwencjonowanie

Pirosekwencjonowanie to metoda, która opiera się na sekwencjonowaniu poprzez syntezę łańcucha DNA i identyfikowaniu ilości wbudowanego nukleotydu za pomocą wykrycia ilości uwolnionego w czasie wbudowywania nukleotydu pirofosforanu. Charakteryzuje się większą czułością w porównaniu z sekwencjonowaniem metodą Sangera (1–5%; tab. III) i wysoką przepustowością (analiza 96 próbek w jednym etapie reakcji) [137, 138]. Jest jednak metodą czasochłonną i wymaga specjalistycznego sprzętu. Wadą jej jest również analiza stosunkowo krótkich odcinków DNA, co powoduje, że aby zanalizować cały ekson trzeba wykonać kilka reakcji. Z drugiej strony wada ta staje się jej zaletą w przypadku zdegradowanego DNA. Zaletą tej metody jest obecność dostępnych na rynku testów CE-IVD. Jest również metodą ilościową. Pozwala zmierzyć ilość allelu z mutacją w stosunku do allelu bez mutacji [139].

9.3. Wysokorozdzielcza analiza krzywych topnienia

Dzięki postępowi w syntezie fluorescencyjnych interkalujących pomiędzy parami zasad w DNA barwników stała się możliwa precyzyjna ocena denaturacji DNA. Rezultatem tego postępu jest powstanie metody wysokorozdzielczej analizy krzywych topnienia (high resolution melting – HRM). Jest to metoda szybka, mało pracochłonna oraz tania. Ma niewielkie wymagania sprzętowe. Charakteryzuje się czułością na poziomie ok. 5% (tab. III). Jej wadą jest brak identyfikacji mutacji, ponieważ metoda ta wykrywa tylko jej obecność. W przypadku wykrycia mutacji w celu jej identyfikacji należy wykonać sekwencjonowanie metodą Sangera. W przypadku obecności mutacji w próbce poniżej 10% nie jest jednak możliwe zidentyfikowanie mutacji za pomocą sekwencjonowania. Metoda ta jest wrażliwa na jakość DNA, ponieważ nierównomierna amplifikowalność może wprowadzić zmiany w profilu denaturacji DNA [140–143].

9.4. Real-time PCR (qPCR)

Niewątpliwie jedną z najbardziej rozpowszechnionych metod diagnostycznych jest metoda reakcji łańcuchowej polimerazy (polymerase chain reaction – PCR) w czasie rzeczywistym (qPCR) (ryc. 2.). W porównaniu z innymi przedstawionymi w niniejszej pracy metodami jest uważana za jedną z najczulszych (ok. 1% allelu z mutacją) (tab. III), a przy tym metoda jest mało pracochłonna i szybka do wykonania [144]. Dodatkowo na rynku dostępnych jest wiele testów do diagnostyki ze znakiem CE-IVD. Dzięki stosowaniu testów możliwe staje się porównywanie diagnostyki pomiędzy laboratoriami. Metoda qPCR wykazuje mniejszą wrażliwość na degradację DNA oraz ma mniejsze wymagania, jeśli chodzi o ilość DNA. Do jej wykonania potrzeba tylko termocyklera PCR z odczytem fluorescencji w czasie rzeczywistym [145]. Wadą tej metody jest wykrywanie tylko określonej liczby mutacji oraz koszt testów. Obecnie na rynku jest dostępnych wiele zestawów do diagnostyki in vitro opartych na metodzie qPCR, których wyczerpujący przegląd czytelnik znajdzie w innym opracowaniu [1].

9.5. Sekwencjonowanie nowej generacji

Masowe równoległe sekwencjonowanie jest metodą polegającą na jednoczesnym sekwencjonowaniu wielu milionów pojedynczych fragmentów DNA czy cDNA o długości 30–500 pz. To metoda bardzo czuła (1–5% zmutowanego allelu; tab. III), wykrywająca wszystkie mutacje w próbce w jednej reakcji. Można zwiększyć czułość metody kosztem liczby analizowanych próbek w jednym cyklu pracy, jednak zwiększa to koszt analizy jednej próbki. Dodatkowo jest to także metoda ilościowa, ponieważ oprócz wiadomości o sekwencji poszczególnej molekuły DNA użytkownik dostaje również informacje o liczbie poszczególnych cząsteczek z mutacją i bez mutacji [146]. Sekwencjonowanie nowej generacji umożliwia kompleksową ocenę mutacji w materiale diagnostycznym. Wadą tej metody jest złożoność analizy, pracochłonność oraz koszt, jednak metodologia NGS ciągle ewoluuje i się upraszcza. Dotyczy to również analizy danych. Dodatkowo tempo redukcji kosztów wykonania badania tą techniką systematycznie rośnie. W związku z tym należy oczekiwać, że już w niedługim czasie metoda ta prawdopodobnie wyprze wszystkie inne metody diagnostyczne. Zarówno ilość dostarczanych danych, jak i czułość metody są bezkonkurencyjne. Z punktu widzenia personalizacji terapii wielką zaletą NGS jest analiza większej liczby genów w jednym teście (od kilkunastu genów poprzez kilkaset, eksomy czy całe genomy) [147]. Inną wielką zaletą tej metody jest możliwość zastosowania do analizy DNA wyizolowanego z bloczków parafinowych (ryc. 3.). Obecnie w diagnostyce stosuje się panele genowe. W panelu analizuje się zwykle kilka do kilkudziesięciu genów w jednej reakcji. To rozwiązanie ekonomiczne, a przy tym dostarczające bardzo dużej liczby danych [148–150]. W 2013 r. jedno z urządzeń dostało certyfikat do diagnostyki przyznany przez FDA [147]. Niewątpliwe przyszłość należy do technologii NGS.

9.6. Walidacja testów home made

W przypadku testów z wykorzystaniem metod, takich jak sekwencjonowanie metodą Sangera, HRM czy NGS, przed rozpoczęciem badań diagnostycznych konieczna jest walidacja metody. Walidacja metody polega na określeniu czułości, precyzji i dokładności. Czułość, czyli limit detekcji (limit of detection – LOD), oblicza się zwykle na podstawie próbek o znanej zawartości procentowej mutacji w przygotowanych na bazie DNA z nowotworowych linii komórkowych zmieszanych z DNA bez mutacji. Precyzję ocenia się poprzez powtarzanie analizy tej samej próbki w tym samym eksperymencie, pomiędzy eksperymentami, pomiędzy operatorami i w różnym czasie oraz warunkach. Dokładność odnosi się do prawidłowego wykrycia i zaklasyfikowania w próbce referencyjnej mutacji lub braku mutacji. Ocenia się czułość i specyficzność testu. Wykorzystuje się próbki kliniczne wcześniej genotypowane zwalidowanymi metodami [151].

10. Zewnętrzna kontrola jakości

Złotym standardem w ocenie zdolności laboratorium do oceny mutacji jest zewnętrzna kontrola jakości (external quality control – EQC). W odniesieniu do mutacji w KRAS, NRAS i BRAF tego rodzaju kontrola prowadzona jest m.in. pod auspicjami European Society of Pathology (ESP) [152, 153]. Medycyna oparta na faktach w dziedzinie badań laboratoryjnych wymaga, aby ocena mutacji somatycznych oraz formułowanie wyniku takiego badania przez różne laboratoria, podlegały walidacji w programie EQC. Udział w zewnątrzlaboratoryjnej kontroli jakości pozwala na identyfikacje błędów i ich eliminację, a zarazem na sprawdzenie i walidację zaadaptowanej metodologii i procesu diagnostycznego w laboratorium [133]. W celu zapewnienia odpowiednio wysokiej jakości oceny mutacji powinna być ona przeprowadzana zwalidowanymi metodami, najlepiej z wykorzystaniem testów zaaprobowanych do diagnostyki in vitro (CE-IVD) z obowiązkiem periodycznego uczestnictwa w programach EQA (External Quality Asessment) organizowanych przez niezależne organizacje europejskie, takie jak np. ESP.

11. Raport badania molekularnego

Raport badania molekularnego jest tylko jednym, ale bardzo ważnym elementem spośród 10 etapów badania molekularnego mutacji somatycznych, w które patolog i diagnosta laboratoryjny są zaangażowani [1]. Wynik badania ma znaczenie kliniczne, dlatego raport badania powinien być zrozumiały zarówno dla pacjenta, jak i dla lekarza (onkologa). Powinien być swego rodzaju syntezą wyników badania mikroskopowego i molekularnego (raport zintegrowany) i zawierać informacje zebrane w tabeli IV [16, 133, 152, 154–162]. Dlatego też optymalnym rozwiązaniem jest autoryzowanie wyniku jednocześnie przez patomorfologa i diagnostę laboratoryjnego (najczęściej biologa molekularnego). W tym układzie patomorfolog odpowiada przede wszystkich za właściwe rozpoznanie nowotworu i wybór najbardziej wartościowego materiału do analizy molekularnej, zaś diagnosta laboratoryjny (biolog molekularny) – za wybór i właściwą walidację użytych testów diagnostycznych oraz wynik badania molekularnego. Wspólnie ponoszą odpowiedzialności za interpretację wartości predykcyjnej wyniku przeprowadzonego testu. Gdy stwierdzono występowanie mutacji, należy podać szczegółowo genotyp wg nomenklatury podanej w rekomendacjach Human Genome Variation Society (HGVS) [163]. Istotnym elementem raportu jest interpretacja znaczenia predykcyjnego wyników w kontekście danych klinicznych danego pacjenta. Interpretacja powinna opierać się na najnowszej literaturze przedmiotu, ponieważ rekomendacje precyzujące zasady kwalifikacji chorych na raka jelita grubego do odpowiedniej terapii ulegają zmianom w miarę, jak publikowane są nowe wyniki badań. Interpretacja wyników badania powinna ułatwić onkologowi podjęcie decyzji terapeutycznych.

Piśmiennictwo

1. Domagala P, Hybiak J, Sulzyc-Bielicka V, et al. KRAS mutation testing in colorectal cancer as an example of the pathologist’s role in personalized targeted therapy: a practical approach. Pol J Pathol 2012; 63: 145-164.

2. Domagala P, Huzarski T, Lubinski J, et al. Immunophenotypic predictive profiling of BRCA1-associated breast cancer. Virchows Arch 2011; 458: 55-64.
3. Kosmidou V, Oikonomou E, Vlassi M, et al. Tumor heterogeneity revealed by KRAS, BRAF, and PIK3CA pyrosequencing: KRAS and PIK3CA intratumor mutation profile differences and their therapeutic implications. Hum Mutat 2014; 35: 329-340.
4. Dietel M, Johrens K, Laffert M, et al. Predictive molecular pathology and its role in targeted cancer therapy: a review focussing on clinical relevance. Cancer Gene Ther 2013; 20: 211-221.
5. Lasota J, Kowalik A, Wasag B, et al. Detection of the BRAF V600E mutation in colon carcinoma: critical evaluation of the imunohistochemical approach. Am J Surg Pathol 2014; 38: 1235-1241.
6. Cathomas G. PIK3CA in colorectal cancer. Front Oncol 2014; 4: 35.
7. Sorich MJ, Wiese MD, Rowland A, et al. Extended RAS mutations and anti-EGFR monoclonal antibody survival benefit in metastatic colorectal cancer: a meta-analysis of randomized, controlled trials. Ann Oncol 2015; 26: 13-21.
8. Paradiso A, Simone G, Petroni S, et al. Thymidilate synthase and p53 primary tumour expression as predictive factors for advanced colorectal cancer patients. Br J Cancer 2000; 82: 560-567.
9. Sulzyc-Bielicka V, Domagala P, Bielicki D, et al. Thymidylate synthase expression and p21(WAF1)/p53 phenotype of colon cancers identify patients who may benefit from 5-fluorouracil based therapy. Cell Oncol (Dordr) 2014; 37: 17-28.
10. Sulzyc-Bielicka V, Domagala P, Urasinska E, et al. Expression of p21WAF1 in Astler-Coller stage B2 colorectal cancer is associated with survival benefit from 5FU-based adjuvant chemotherapy. Virchows Arch 2011; 458: 431-438.
11. Showalter SL, Showalter TN, Witkiewicz A, et al. Evaluating the drug-target relationship between thymidylate synthase expression and tumor response to 5-fluorouracil. Is it time to move forward? Cancer Biol Ther 2008; 7: 986-994.
12. Laurent-Puig P, Cayre A, Manceau G, et al. Analysis of PTEN, BRAF, and EGFR status in determining benefit from cetuximab therapy in wild-type KRAS metastatic colon cancer. J Clin Oncol 2009; 27: 5924-5930.
13. Takai Y, Sasaki T, Matozaki T. Small GTP-binding proteins. Physiol Rev 2001; 81: 153-208.
14. Grossmann AH, Samowitz WS. Epidermal growth factor receptor pathway mutations and colorectal cancer therapy. Arch Pathol Lab Med 2011; 135: 1278-1282.
15. Harari PM, Allen GW, Bonner JA. Biology of interactions: antiepidermal growth factor receptor agents. J Clin Oncol 2007; 25: 4057-4065.
16. Allegra CJ, Jessup JM, Somerfield MR, et al. American Society of Clinical Oncology provisional clinical opinion: testing for KRAS gene mutations in patients with metastatic colorectal carcinoma to predict response to anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody therapy. J Clin Oncol 2009; 27: 2091-2096.
17. Karapetis CS, Khambata-Ford S, Jonker DJ, et al. K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer. N Engl J Med 2008; 359: 1757-1765.
18. Amado RG, Wolf M, Peeters M, et al. Wild-type KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol 2008; 26: 1626-1634.
19. Nowak F, Soria JC, Calvo F. Tumour molecular profiling for deciding therapy-the French initiative. Nat Rev Clin Oncol 2012; 9: 479-486.
20. Lievre A, Bachet JB, Le Corre D, et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res 2006; 66: 3992-3995.
21. Morris VK, Lucas FA, Overman MJ, et al. Clinicopathologic characteristics and gene expression analyses of non-KRAS 12/13, RAS-mutated metastatic colorectal cancer. Ann Oncol 2014; 25: 2008-2014.
22. Wong NA, Gonzalez D, Salto-Tellez M, et al. RAS testing of colorectal carcinoma-a guidance document from the Association of Clinical Pathologists Molecular Pathology and Diagnostics Group. J Clin Pathol 2014; 67: 751-757.
23. Douillard JY, Oliner KS, Siena S, et al. Panitumumab-FOLFOX4 treatment and RAS mutations in colorectal cancer. N Engl J Med 2013; 369: 1023-1034.
24. Molinari F, Felicioni L, Buscarino M, et al. Increased detection sensitivity for KRAS mutations enhances the prediction of anti-EGFR monoclonal antibody resistance in metastatic colorectal cancer. Clin Cancer Res 2011; 17: 4901-4914.
25. Bando H, Yoshino T, Tsuchihara K, et al. KRAS mutations detected by the amplification refractory mutation system-Scorpion assays strongly correlate with therapeutic effect of cetuximab. Br J Cancer 2011; 105: 403-406.
26. Malapelle U, Carlomagno C, Salatiello M, et al. KRAS mutation detection by high-resolution melting analysis significantly predicts clinical benefit of cetuximab in metastatic colorectal cancer. Br J Cancer 2012; 107: 626-631.
27. Kimura T, Okamoto K, Miyamoto H, et al. Clinical benefit of high-sensitivity KRAS mutation testing in metastatic colorectal cancer treated with anti-EGFR antibody therapy. Oncology 2012; 82: 298-304.
28. Misale S, Yaeger R, Hobor S, et al. Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer. Nature 2012; 486: 532-536.
29. Tougeron D, Lecomte T, Pages JC, et al. Effect of low-frequency KRAS mutations on the response to anti-EGFR therapy in metastatic colorectal cancer. Ann Oncol 2013; 24: 1267-1273.
30. Natalicchio MI, Improta G, Zupa A, et al. Pyrosequencing evaluation of low-frequency KRAS mutant alleles for EGF receptor therapy selection in metastatic colorectal carcinoma. Future Oncol 2014; 10: 713-723.
31. Shan L, Li M, Ma J, et al. PCR-based assays versus direct sequencing for evaluating the effect of KRAS status on anti-EGFR treatment response in colorectal cancer patients: a systematic review and meta-analysis. PLoS One 2014; 9: e107926.
32. Parsons BL, Myers MB. Personalized cancer treatment and the myth of KRAS wild-type colon tumors. Discov Med 2013; 15: 259-267.
33. Brand TM, Wheeler DL. KRAS mutant colorectal tumors: past and present. Small GTPases 2012; 3: 34-39.
34. De Roock W, Claes B, Bernasconi D, et al. Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis. Lancet Oncol 2010; 11: 753-762.
35. De Roock W, De Vriendt V, Normanno N, et al. KRAS, BRAF, PIK3CA, and PTEN mutations: implications for targeted therapies in metastatic colorectal cancer. Lancet Oncol 2011; 12: 594-603.
36. Vaughn CP, Zobell SD, Furtado LV, et al. Frequency of KRAS, BRAF, and NRAS mutations in colorectal cancer. Genes Chromosomes Cancer 2011; 50: 307-312.
37. Custodio A, Feliu J. Prognostic and predictive biomarkers for epidermal growth factor receptor-targeted therapy in colorectal cancer: beyond KRAS mutations. Crit Rev Oncol Hematol 2013; 85: 45-81.
38. Irahara N, Baba Y, Nosho K, et al. NRAS mutations are rare in colorectal cancer. Diagn Mol Pathol 2010; 19: 157-163.
39. Haigis KM, Kendall KR, Wang Y, et al. Differential effects of oncogenic K-Ras and N-Ras on proliferation, differentiation and tumor progression in the colon. Nat Genet 2008; 40: 600-608.
40. Davies H, Bignell GR, Cox C, et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature 2002; 417: 949-954.
41. Xing M. BRAF mutation in thyroid cancer. Endocr Relat Cancer 2005; 12: 245-262.
42. Walczyk A, Kowalska A, Kowalik A, et al. The BRAF(V600E) mutation in papillary thyroid microcarcinoma: does the mutation have an impact on clinical outcome? Clin Endocrinol (Oxf) 2014; 80: 899-904.
43. Venderbosch S, Nagtegaal ID, Maughan TS, et al. Mismatch Repair Status and BRAF Mutation Status in Metastatic Colorectal Cancer Patients: A Pooled Analysis of the CAIRO, CAIRO2, COIN, and FOCUS Studies. Clin Cancer Res 2014; 20: 5322-5330.
44. Di Nicolantonio F, Martini M, Molinari F, et al. Wild-type BRAF is required for response to panitumumab or cetuximab in metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol 2008; 26: 5705-5712.
45. Weisenberger DJ, Siegmund KD, Campan M, et al. CpG island methylator phenotype underlies sporadic microsatellite instability and is tightly associated with BRAF mutation in colorectal cancer. Nat Genet 2006; 38: 787-793.
46. Spring KJ, Zhao ZZ, Karamatic R, et al. High prevalence of sessile serrated adenomas with BRAF mutations: a prospective study of patients undergoing colonoscopy. Gastroenterology 2006; 131: 1400-1407.
47. Mesteri I, Bayer G, Meyer J, et al. Improved molecular classification of serrated lesions of the colon by immunohistochemical detection of BRAF V600E. Mod Pathol 2014; 27: 135-144.
48. Courtney KD, Corcoran RB, Engelman JA. The PI3K pathway as drug target in human cancer. J Clin Oncol 2010; 28: 1075-1083.
49. Samuels Y, Wang Z, Bardelli A, et al. High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers. Science 2004; 304: 554.
50. Rosty C, Young JP, Walsh MD, et al. PIK3CA activating mutation in colorectal carcinoma: associations with molecular features and survival. PLoS One 2013; 8: e65479.
51. Sartore-Bianchi A, Martini M, Molinari F, et al. PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies. Cancer Res 2009; 69: 1851-1857.
52. Ogino S, Nosho K, Kirkner GJ, et al. PIK3CA mutation is associated with poor prognosis among patients with curatively resected colon cancer. J Clin Oncol 2009; 27: 1477-1484.
53. Sood A, McClain D, Maitra R, et al. PTEN gene expression and mutations in the PIK3CA gene as predictors of clinical benefit to anti-epidermal growth factor receptor antibody therapy in patients with KRAS wild-type metastatic colorectal cancer. Clin Colorectal Cancer 2012; 11: 143-150.
54. Razis E, Pentheroudakis G, Rigakos G, et al. EGFR gene gain and PTEN protein expression are favorable prognostic factors in patients with KRAS wild-type metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. J Cancer Res Clin Oncol 2014; 140: 737-748.
55. Gonsalves WI, Mahoney MR, Sargent DJ, et al. Patient and tumor characteristics and BRAF and KRAS mutations in colon cancer, NCCTG/Alliance N0147. J Natl Cancer Inst 2014; 106: dju106.
56. El-Chaar NN, Piccolo SR, Boucher KM, et al. Genomic classification of the RAS network identifies a personalized treatment strategy for lung cancer. Mol Oncol 2014; 8: 1339-1354.
57. Pino MS, Chung DC. Microsatellite instability in the management of colorectal cancer. Expert Rev Gastroenterol Hepatol 2011; 5: 385-399.
58. Umar A, Boland CR, Terdiman JP, et al. Revised Bethesda Guidelines for hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch syndrome) and microsatellite instability. J Natl Cancer Inst 2004; 96: 261-268.
59. Cunningham JM, Kim CY, Christensen ER, et al. The frequency of hereditary defective mismatch repair in a prospective series of unselected colorectal carcinomas. Am J Hum Genet 2001; 69: 780-790.
60. Popat S, Hubner R, Houlston RS. Systematic review of microsatellite instability and colorectal cancer prognosis. J Clin Oncol 2005; 23: 609-618.
61. Dolcetti R, Viel A, Doglioni C, et al. High prevalence of activated intraepithelial cytotoxic T lymphocytes and increased neoplastic cell apoptosis in colorectal carcinomas with microsatellite instability. Am J Pathol 1999; 154: 1805-1813.
62. Schwitalle Y, Kloor M, Eiermann S, et al. Immune response against frameshift-induced neopeptides in HNPCC patients and healthy HNPCC mutation carriers. Gastroenterology 2008; 134: 988-997.
63. Ribic CM, Sargent DJ, Moore MJ, et al. Tumor microsatellite-instability status as a predictor of benefit from fluorouracil-based adjuvant chemotherapy for colon cancer. N Engl J Med 2003; 349: 247-257.
64. Sargent DJ, Marsoni S, Monges G, et al. Defective mismatch repair as a predictive marker for lack of efficacy of fluorouracil-based adjuvant therapy in colon cancer. J Clin Oncol 2010; 28: 3219-3226.
65. Whitehall VL, Wynter CV, Walsh MD, et al. Morphological and molecular heterogeneity within nonmicrosatellite instability-high colorectal cancer. Cancer Res 2002; 62: 6011-6014.
66. Vilar E, Scaltriti M, Balmana J, et al. Microsatellite instability due to hMLH1 deficiency is associated with increased cytotoxicity to irinotecan in human colorectal cancer cell lines. Br J Cancer 2008; 99: 1607-1612.
67. Dedes KJ, Wilkerson PM, Wetterskog D, et al. Synthetic lethality of PARP inhibition in cancers lacking BRCA1 and BRCA2 mutations. Cell Cycle 2011; 10: 1192-1199.
68. Sulzyc-Bielicka V, Domagala P, Hybiak J, et al. Colorectal cancers differ in respect of PARP-1 protein expression. Pol J Pathol 2012; 63: 87-92.
69. Vilar E, Mukherjee B, Kuick R, et al. Gene expression patterns in mismatch repair-deficient colorectal cancers highlight the potential therapeutic role of inhibitors of the phosphatidylinositol 3-kinase-AKT-mammalian target of rapamycin pathway. Clin Cancer Res 2009; 15: 2829-2839.
70. Shia J. Immunohistochemistry versus microsatellite instability testing for screening colorectal cancer patients at risk for hereditary nonpolyposis colorectal cancer syndrome. Part I. The utility of immunohistochemistry. J Mol Diagn 2008; 10: 293-300.
71. Roepman P, Schlicker A, Tabernero J, et al. Colorectal cancer intrinsic subtypes predict chemotherapy benefit, deficient mismatch repair and epithelial-to-mesenchymal transition. Int J Cancer 2014; 134: 552-562.
72. Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature 2012; 487: 330-337.
73. Perez-Villamil B, Romera-Lopez A, Hernandez-Prieto S, et al. Colon cancer molecular subtypes identified by expression profiling and associated to stroma, mucinous type and different clinical behavior. BMC Cancer 2012; 12: 260. doi: 10.1186/1471-2407-12-260.
74. Sadanandam A, Lyssiotis CA, Homicsko K, et al. A colorectal cancer classification system that associates cellular phenotype and responses to therapy. Nat Med 2013; 19: 619-625.
75. Sadanandam A, Wang X, de Sousa E Melo F, et al. Reconciliation of classification systems defining molecular subtypes of colorectal cancer: interrelationships and clinical implications. Cell Cycle 2014; 13: 353-357.
76. Ogino S, Meyerhardt JA, Irahara N, et al. KRAS mutation in stage III colon cancer and clinical outcome following intergroup trial CALGB 89803. Clin Cancer Res 2009; 15:7322-7329.
77. Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin 2011; 61: 69-90.
78. Pantel K, Alix-Panabieres C, Riethdorf S. Cancer micrometastases. Nat Rev Clin Oncol 2009; 6: 339-351.
79. Ashworth, TR. A case of cancer in which cells similar to those in the tumours were seen in the blood after death. Australian Med Journal 1869; 14:146-7.
80. Valastyan S, Weinberg RA. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell 2011; 147: 275-292.
81. Cristofanilli M, Budd GT, Ellis MJ, et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med 2004; 351: 781-791.
82. Cohen SJ, Punt CJ, Iannotti N, et al. Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol 2008; 26: 3213-3221.
83. Lu CY, Tsai HL, Uen YH, et al. Circulating tumor cells as a surrogate marker for determining clinical outcome to mFOLFOX chemotherapy in patients with stage III colon cancer. Br J Cancer 2013; 108: 791-797.
84. Torino F, Bonmassar E, Bonmassar L, et al. Circulating tumor cells in colorectal cancer patients. Cancer Treat Rev 2013; 39: 759-772.
85. Lim SH, Becker TM, Chua W, et al. Circulating tumour cells and circulating free nucleic acid as prognostic and predictive biomarkers in colorectal cancer. Cancer Lett 2014; 346: 24-33.
86. Crowley E, Di Nicolantonio F, Loupakis F, et al. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nat Rev Clin Oncol 2013; 10: 472-484.
87. Schwarzenbach H, Hoon DS, Pantel K. Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients. Nat Rev Cancer 2011; 11: 426-437.
88. Leary RJ, Sausen M, Kinde I, et al. Detection of chromosomal alterations in the circulation of cancer patients with whole-genome sequencing. Sci Transl Med 2012; 4: 162ra154.
89. Bettegowda C, Sausen M, Leary RJ, et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci Transl Med 2014; 6: 224ra24.
90. Thierry AR, Mouliere F, El Messaoudi S, et al. Clinical validation of the detection of KRAS and BRAF mutations from circulating tumor DNA. Nat Med 2014; 20: 430-435.
91. Mouliere F, Robert B, Arnau Peyrotte E, et al. High fragmentation characterizes tumour-derived circulating DNA. PLoS One 2011; 6: e23418.
92. Hao TB, Shi W, Shen XJ, et al. Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer. Br J Cancer 2014; 111: 1482-1489.
93. Diehl F, Li M, Dressman D, et al. Detection and quantification of mutations in the plasma of patients with colorectal tumors. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102: 16368-16373.
94. Diaz LA,Jr, Williams RT, Wu J, et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature 2012; 486: 537-540.
95. Perrone F, Lampis A, Bertan C, et al. Circulating free DNA in a screening program for early colorectal cancer detection. Tumori 2014; 100:115-121.
96. Newman AM, Bratman SV, To J, et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat Med 2014; 20: 548-554.
97. National Comprehensive Cancer Network. NCCN clinical practice guidelines in oncology: colon cancer V2.2015. Dostępne na: www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/colon.pdf (dostęp 5.12.2014).
98. Spano JP, Lagorce C, Atlan D, et al. Impact of EGFR expression on colorectal cancer patient prognosis and survival. Ann Oncol 2005; 16: 102-108.
99. McKay JA, Murray LJ, Curran S, et al. Evaluation of the epidermal growth factor receptor (EGFR) in colorectal tumours and lymph node metastases. Eur J Cancer 2002; 38: 2258-2264.
100. Ensinger C, Sterlacci W. Implications of EGFR PharmDx kit for cetuximab eligibility. Expert Rev Mol Diagn 2008; 8: 141-148.
101. Chung KY, Shia J, Kemeny NE, et al. Cetuximab shows activity in colorectal cancer patients with tumors that do not express the epidermal growth factor receptor by immunohistochemistry. J Clin Oncol 2005; 23: 1803-1810.
102. Saltz LB, Meropol NJ, Loehrer PJ S, et al. Phase II trial of cetuximab in patients with refractory colorectal cancer that expresses the epidermal growth factor receptor. J Clin Oncol 2004; 22: 1201-1208.
103. Kang MJ, Hong YS, Kim KP, et al. Biweekly cetuximab plus irinotecan as second-line chemotherapy for patients with irinotecan-refractory and KRAS wild-type metastatic colorectal cancer according to epidermal growth factor receptor expression status. Invest New Drugs 2012; 30: 1607-1613.
104. Hecht JR, Mitchell E, Neubauer MA, et al. Lack of correlation between epidermal growth factor receptor status and response to Panitumumab monotherapy in metastatic colorectal cancer. Clin Cancer Res 2010; 16: 2205-2213.
105. Atkins D, Reiffen KA, Tegtmeier CL, et al. Immunohistochemical detection of EGFR in paraffin-embedded tumor tissues: variation in staining intensity due to choice of fixative and storage time of tissue sections. J Histochem Cytochem 2004; 52: 893-901.
106. Younes M. Is immunohistochemistry for epidermal growth factor receptor expression a poor predictor of response to epidermal growth factor receptor-targeted therapy? J Clin Oncol 2005; 23: 923; author reply 923-924.
107. Lax I, Bellot F, Howk R, et al. Functional analysis of the ligand binding site of EGF-receptor utilizing chimeric chicken/human receptor molecules. EMBO J 1989; 8: 421-427.
108. Mattoon D, Klein P, Lemmon MA, et al. The tethered configuration of the EGF receptor extracellular domain exerts only a limited control of receptor function. Proc Natl Acad Sci U S A 2004; 101: 923-928.
109. Obwieszczenie Ministra Zdrowia z dnia 1 stycznia 2015 r. w sprawie wykazu refundowanych leków, środków spożywczych specjalnego przeznaczenia żywieniowego oraz wyrobów medycznych. Dostępne na: http://www.bip.mz.gov.pl/__data/assets/pdf_file/0004/26842/Zalacznik-do-obwieszczenia.pdf (dostęp 8.01.2015 r.).
110. Marchetti A, Milella M, Felicioni L, et al. Clinical implications of KRAS mutations in lung cancer patients treated with tyrosine kinase inhibitors: an important role for mutations in minor clones. Neoplasia 2009; 11: 1084-1092.
111. Turner NC, Reis-Filho JS. Genetic heterogeneity and cancer drug resistance. Lancet Oncol 2012; 13: e178-85.
112. Palmirotta R, Ludovici G, De Marchis ML, et al. A comprehensive procedural approach to genotyping KRAS and BRAF from paraffin embedded tissues for diagnostic purposes. In Vivo 2012; 26: 537-547.
113. Giaretti W, Monaco R, Pujic N, et al. Intratumor heterogeneity of K-ras2 mutations in colorectal adenocarcinomas: association with degree of DNA aneuploidy. Am J Pathol 1996; 149: 237-245.
114. Losi L, Baisse B, Bouzourene H, et al. Evolution of intratumoral genetic heterogeneity during colorectal cancer progression. Carcinogenesis 2005; 26: 916-922.
115. Baldus SE, Schaefer KL, Engers R, et al. Prevalence and heterogeneity of KRAS, BRAF, and PIK3CA mutations in primary colorectal adenocarcinomas and their corresponding metastases. Clin Cancer Res 2010; 16: 790-799.
116. Goranova TE, Ohue M, Shimoharu Y, et al. Dynamics of cancer cell subpopulations in primary and metastatic colorectal tumors. Clin Exp Metastasis 2011; 28: 427-435.
117. Richman SD, Chambers P, Seymour MT, et al. Intra-tumoral heterogeneity of KRAS and BRAF mutation status in patients with advanced colorectal cancer (aCRC) and cost-effectiveness of multiple sample testing. Anal Cell Pathol (Amst) 2011; 34: 61-66.
118. Fadhil W, Ibrahem S, Seth R, et al. The utility of diagnostic biopsy specimens for predictive molecular testing in colorectal cancer. Histopathology 2012; 61: 1117-1124.
119. Hammond ME, Hayes DF, Dowsett M, et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer (unabridged version). Arch Pathol Lab Med 2010; 134: e48-72.
120. Han CB, Li F, Ma JT, et al. Concordant KRAS mutations in primary and metastatic colorectal cancer tissue specimens: a meta-analysis and systematic review. Cancer Invest 2012; 30: 741-747.
121. Brannon AR, Vakiani E, Sylvester BE, et al. Comparative sequencing analysis reveals high genomic concordance between matched primary and metastatic colorectal cancer lesions. Genome Biol 2014; 15: 454, doi: 10.1186/s13059-014-0454-7.
122. Kim MJ, Lee HS, Kim JH, et al. Different metastatic pattern according to the KRAS mutational status and site-specific discordance of KRAS status in patients with colorectal cancer. BMC Cancer 2012; 12: 347, doi: 10.1186/1471-2407-12-347.
123. Srinivasan M, Sedmak D, Jewell S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol 2002; 161: 1961-1971.
124. Williams C, Ponten F, Moberg C, et al. A high frequency of sequence alterations is due to formalin fixation of archival specimens. Am J Pathol 1999; 155: 1467-1471.
125. Do H, Dobrovic A. Dramatic reduction of sequence artefacts from DNA isolated from formalin-fixed cancer biopsies by treatment with uracil-DNA glycosylase. Oncotarget 2012; 3: 546-558.
126. Do H, Wong SQ, Li J, et al. Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates. Clin Chem 2013; 59: 1376-1383.
127. Do H, Dobrovic A. Sequence Artifacts in DNA from Formalin-Fixed Tissues: Causes and Strategies for Minimization. Clin Chem 2015; 61: 64-71.
128. Ross JS. Clinical implementation of KRAS testing in metastatic colorectal carcinoma: the pathologist’s perspective. Arch Pathol Lab Med 2012; 136: 1298-1307.
129. Kristiansen G. Manual microdissection. Methods Mol Biol 2010; 576: 31-38.
130. Burgemeister R. Nucleic acids extraction from laser microdissected FFPE tissue sections. Methods Mol Biol 2011; 724: 117-129.
131. Ludyga N, Grunwald B, Azimzadeh O, et al. Nucleic acids from long-term preserved FFPE tissues are suitable for downstream analyses. Virchows Arch 2012; 460: 131-140.
132. Morikawa T, Shima K, Kuchiba A, et al. No evidence for interference of h&e staining in DNA testing: usefulness of DNA extraction from H&E-stained archival tissue sections. Am J Clin Pathol 2012; 138: 122-129.
133. Bellon E, Ligtenberg MJ, Tejpar S, et al. External quality assessment for KRAS testing is needed: setup of a European program and report of the first joined regional quality assessment rounds. Oncologist 2011; 16: 467-478.
134. Dequeker E, Ligtenberg MJ, Vander Borght S, et al. Mutation analysis of KRAS prior to targeted therapy in colorectal cancer: development and evaluation of quality by a European external quality assessment scheme. Virchows Arch 2011; 459: 155-160.
135. Kapp JR, Diss T, Spicer J, et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol 2014; pii: jclinpath-2014-202644, doi: 10.1136/jclinpath-2014-202644.
136. Gonzalez de Castro D, Angulo B, Gomez B, et al. A comparison of three methods for detecting KRAS mutations in formalin-fixed colorectal cancer specimens. Br J Cancer 2012; 107: 345-351.
137. Weichert W, Schewe C, Lehmann A, et al. KRAS genotyping of paraffin-embedded colorectal cancer tissue in routine diagnostics: comparison of methods and impact of histology. J Mol Diagn 2010; 12: 35-42.
138. Dufort S, Richard MJ, de Fraipont F. Pyrosequencing method to detect KRAS mutation in formalin-fixed and paraffin-embedded tumor tissues. Anal Biochem 2009; 391: 166-168.
139. Sundström M, Edlund K, Lindell M, et al. KRAS analysis in colorectal carcinoma: analytical aspects of Pyrosequencing and allele-specific PCR in clinical practice. BMC Cancer 2010; 10: 660, doi: 10.1186/1471-2407-10-660.
140. Carbonell P, Turpin MC, Torres-Moreno D, et al. Comparison of allelic discrimination by dHPLC, HRM, and TaqMan in the detection of BRAF mutation V600E. J Mol Diagn 2011; 13: 467-473.
141. Wittwer CT. High-resolution DNA melting analysis: advancements and limitations. Hum Mutat 2009; 30: 857-859.
142. Do H, Krypuy M, Mitchell PL, et al. High resolution melting analysis for rapid and sensitive EGFR and KRAS mutation detection in formalin fixed paraffin embedded biopsies. BMC Cancer 2008; 8: 142, doi: 10.1186/1471-2407-8-142.
143. Negru S, Papadopoulou E, Apessos A, et al. KRAS, NRAS and BRAF mutations in Greek and Romanian patients with colorectal cancer: a cohort study. BMJ Open 2014; 4: e004652.
144. Morlan J, Baker J, Sinicropi D. Mutation detection by real-time PCR: a simple, robust and highly selective method. PLoS One 2009; 4: e4584.
145. Kotoula V, Charalambous E, Biesmans B, et al. Targeted KRAS mutation assessment on patient tumor histologic material in real time diagnostics. PLoS One 2009; 4: e7746.
146. Metzker ML. Sequencing technologies – the next generation. Nat Rev Genet 2010; 11: 31-46.
147. Bahassi el M, Stambrook PJ. Next-generation sequencing technologies: breaking the sound barrier of human genetics. Mutagenesis 2014; 29: 303-310.
148. Malapelle U, Vigliar E, Sgariglia R, et al. Ion Torrent next-generation sequencing for routine identification of clinically relevant mutations in colorectal cancer patients. J Clin Pathol 2015; 68: 64-68. 
149. Mafficini A, Amato E, Fassan M, et al. Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis. PLoS One 2014; 9: e104979.
150. Singh RR, Patel KP, Routbort MJ, et al. Clinical massively parallel next-generation sequencing analysis of 409 cancer-related genes for mutations and copy number variations in solid tumours. Br J Cancer 2014; 111: 2014-2023.
151. Mattocks CJ, Morris MA, Matthijs G, et al. A standardized framework for the validation and verification of clinical molecular genetic tests. Eur J Hum Genet 2010; 18: 1276-1288.
152. Tembuyser L, Ligtenberg MJ, Normanno N, et al. Higher quality of molecular testing, an unfulfilled priority: Results from external quality assessment for KRAS mutation testing in colorectal cancer. J Mol Diagn 2014; 16: 371-377.
153. van Krieken JH, Jung A, Kirchner T, et al. KRAS mutation testing for predicting response to anti-EGFR therapy for colorectal carcinoma: proposal for an European quality assurance program. Virchows Arch 2008; 453: 417-431.
154. Aubin F, Gill S, Burkes R, et al. Canadian Expert Group consensus recommendations: KRAS testing in colorectal cancer. Curr Oncol 2011; 18: e180-e184.
155. Gulley ML, Braziel RM, Halling KC, et al. Clinical laboratory reports in molecular pathology. Arch Pathol Lab Med 2007; 131: 852-863.
156. Scheuner MT, Hilborne L, Brown J, et al. A report template for molecular genetic tests designed to improve communication between the clinician and laboratory. Genet Test Mol Biomarkers 2012; 16: 761-769.
157. Plesec TP, Hunt JL. KRAS mutation testing in colorectal cancer. Adv Anat Pathol 2009; 16: 196-203.
158. ISO 15189:2012. Medical laboratories – Particular requirements for quality and competence. Geneva: International Organization for Standardization.
159. Organisation for Economic Co-operation and Development. OECD guidelines for quality assurance in molecular genetic testing. Dostępne na: www.oecd.org/science/biotech/38839788.pdf. Published 2007 (dostęp 5.12.2014).
160. European Molecular Genetics Quality Network. Final Report 2011 (Round 2) Pilot EQA scheme for EGFR mutation testing in non-small cell lung cancer. Dostępne na: http://www.amoydx.com/down/EGFR%20NEW%20Final%20Report%202011%20R2%20v3.pdf. Published May 17, 2012 (dostęp 20.12.2014).
161. Cree IA, Deans Z, Ligtenberg MJ, et al. Guidance for laboratories performing molecular pathology for cancer patients. J Clin Pathol 2014; 67: 923-931.
162. European Society of Pathology. General raport. ESP colon external quality assessment scheme 2013. Dostępne na: http://kras.eqascheme.org. Published 12.08.2014 (dostęp 20.12.2014).
163. Taschner PE, den Dunnen JT. Describing structural changes by extending HGVS sequence variation nomenclature. Hum Mutat 2011; 32: 507-511.