Oncolytic bacteria in cancer therapy

WSTĘP


Mimo znacznego rozwoju metod terapeutycznych, radioterapia jak i chemioterapia dalej są mało swoistymi metodami w terapii przeciwnowotworowej. Nadal poszukuje się skutecznej strategii terapeutycznej, która selektywnie eliminowałaby komórki nowotworowe, natomiast oszczędzała komórki prawidłowe. Wraz z rozwojem inżynierii genetycznej pojawiła się nowa możliwość leczenia nowotworów - terapia genowa. Podstawowym jej problemem jest jednak brak swoistego wprowadzania terapeutycznych genów in vivo. Zarówno nośniki wirusowe (np. adenowirusy), jak i nośniki niewirusowe (np. liposomy kationowe) lub szereg metod fizycznych (np. elektroporacja czy pistolet genowy) nie pozwalają na wysoce swoiste dostarczanie genów do komórek nowotworowych [1, 2].

Szereg badań wskazuje na znaczne różnice fizjologiczne między prawidłowymi tkankami a nowotworami, np. sieć okołonowotworowych naczyń krwionośnych wyraźnie różni się od sieci naczyń prawidłowych: jest nieregularna, kręta i o dużej przepuszczalności [3]. W miarę oddalania się od światła naczynia obserwuje się powstawanie niedotlenowanych i nekrotycznych obszarów w guzach. Od lat przypuszczano, że w regionach tych mogą rozwijać się bakterie beztlenowe. Toksyny wydzielane przez te mikroorganizmy mogłyby zabijać w swoisty sposób komórki nowotworowe. Jednak początkowe badania (lata 50.) z zastosowaniem bakterii z rodzaju Clostridium nie były zachęcające - nie zaobserwowano znacznych efektów terapeutycznych [4]. Nadal poszukuje się bakterii niepatogennych, które swoiście niszczyłyby wyłącznie komórki nowotworowe. Niektóre bakterie onkolityczne próbuje się wykorzystać także jako swoiste nośniki genów terapeutycznych. Przykładowo: enzymy kodowane przez geny samobójcze umożliwiają przekształcanie nieaktywnego proleku w lek, którego działanie prowadzi do śmierci komórek.

Celem niniejszej pracy jest przedstawienie wyników badań dotyczących wykorzystania bakterii onkolitycznych w terapii przeciwnowotworowej oraz stosowania niektórych z nich jako swoistych nośników genów terapeutycznych.



BAKTERIE ONKOLITYCZNE


Jedno z pierwszych doświadczeń dotyczyło wykorzystania w terapii przeciwnowotworowej ściśle beztlenowych laseczek z rodzaju Clostridium. Drobnoustroje te wybrano, ponieważ mogą rozwijać się przy nieobecności tlenu lub przy niskiej jego zawartości, a więc w warunkach, jakie istnieją w nowotworach. Wszystkie bakterie z rodzaju Clostridium mogą wytwarzać przetrwalniki (endospory) w odpowiedzi na niekorzystne warunki środowiskowe. Podczas podawania Clostridium sp. zwierzętom doświadczalnym lepiej jest użyć spor a nie komórek wegetatywnych, ze względu na wrażliwość bakterii beztlenowych na działanie tlenu. Powstawanie spor (sporulacja) zachodzi wieloetapowo i odbywa się wewnątrz komórek bakteryjnych. Dojrzała spora, dzięki specjalnej strukturze płaszcza, jest oporna na różne czynniki fizyczne i chemiczne, działające szkodliwie lub zabójczo na komórkę wegetatywną [5]. Po znalezieniu się w niedotlenowanych obszarach nowotworu przetrwalniki rozwijają się (tzw. germinacja spor) i czerpią składniki pokarmowe z obumierających komórek nowotworowych.

Po dożylnym podaniu spor patogennego szczepu Clostridium histolyticum myszom obarczonych mięsakiem, bakterie namnażały się w guzach, powodując lizę komórek nowotworowych i częściową regresję nowotworu [6] (tab.). Malmgren i Flanagan [7] zaobserwowali jednak, że po dożylnym wstrzyknięciu spor Clostridium tetani, następowała śmierć zwierząt po 48 godz. na skutek wytwarzania toksyny tężcowej przez bakterie rozwijające się w nowotworach. Möse i Möse (cyt. wg Carey i wsp. [8]) wyizolowali niepatogenny szczep Clostridium butyricum - M55, którego spory po podaniu myszom również rozwijały się w guzie, powodując lizę komórek nowotworowych. Wprawdzie obserwowano zwiększoną regresję nowotworu, niemniej zwierzęta ginęły, prawdopodobnie w wyniku toksemii. Eksperymenty te zapoczątkowały jednak pierwsze badania kliniczne na pacjentach chorych na raka. Mimo że bakterie lokalizowały się w nowotworze i powodowały lizę komórek nowotworowych doświadczenia zarzucono, gdyż terapia była mało efektywna [3].



MODYFIKACJE GENETYCZNE BAKTERII ONKOLITYCZNYCH


W ostatniej dekadzie znacznie rozwinęły się różne techniki inżynierii genetycznej. Możliwości te wykorzystano również przy modyfikowaniu bakterii onkolitycznych w terapii nowotworowej. Poprzez wklonowanie do plazmidu niepatogennej, bezwzględnie beztlenowej bakterii Clostridium beijerinckii (nazwę zmieniono na Clostridium acetobutylicum) genu Escherichia coli kodującego deaminazę cytozyny [9] czy nitroreduktazę [10], zaproponowano nową strategię terapeutyczną. Enzymy, takie jak deaminaza cytozyny czy nitroreduktaza kodowane przez geny samobójcze, syntetyzowane w cytoplazmie bądź w peryplazmie komórek bakteryjnych, metabolizują nieaktywny prolek do toksycznego leku (zarówno prolek, jak i aktywny lek przypuszczalnie dyfundują przez osłony bakteryjne). Lek dostaje się do komórek nowotworowych i indukuje w nich śmierć apoptotyczną [11].



Wstrzyknięte do krwiobiegu zwierząt obarczonych guzami, spory zmodyfikowanej bakterii Clostridium beijerinckii rozwijały się jedynie w niedotlenowanych obszarach nowotworu [10]. Bakterie produkowały nitroreduktazę, która z kolei aktywowała prolek 5-azyrydynylo-2,4-dinitrobenzamid (CB 1954) do jego toksycznej formy 5-azyrydynylo-4-hydroksyamino-2-nitrobenzamidu. Enzym ten wykryto tylko w lizatach komórek nowotworowych.

Natomiast bakterie Clostridium beijerinckii, będące nośnikami genu deaminazy cytozyny, wytwarzały enzym, który metabolizował nieaktywny prolek 5-fluorocytozynę (5-FC) do aktywnego leku, stosowanego powszechnie w terapii przeciwnowotworowej, 5-fluorouracylu [9]. Obserwowano wysokie stężenie leku w guzach oraz lizę komórek nowotworowych.

Szczep Clostridium acetobutylicum również był modyfikowany przez innych badaczy. Do bakterii wprowadzono dodatkowo gen deaminazy cytozyny z Escherichia coli, który znajdował się pod kontrolą promotora endoproteazy (ang. clostripain) z Clostridium histolyticum, poprzedzonego sekwencją sygnalną dla tego białka [12]. W lizatach i supernatantach komórek bakteryjnych zaobserwowano znaczne ilości wydzielanej deaminazy cytozyny. Spory Clostridium acetobutylicum, podawane doguzowo szczurom, rozwijały się w niedotlenowanych regionach nowotworu. Dodatkowo zwierzętom podano antyangiogenny lek - kombretastatynę A-4. Stwierdzono zwiększoną nekrozę nowotworów i dużo lepszy wzrost bakterii.

Trwały poszukiwania bakterii, która byłaby niepatogenna, namnażała się tylko w obrębie guza (włącznie z obszarami niedotlenowania i nekrozy) oraz odznaczała się znaczną zdolnością lizy komórek nowotworowych [4].
Grupa Vogelsteina [13] usiłowała wykorzystać w terapii nowotworowej silnie zjadliwy szczep Clostridium novyi. W celu zinaktywowania genu bakteryjnej toksyny spory tego drobnoustroju ogrzewano w 70^oC przez 15 min. Spory następnie wstrzyknięto dożylnie myszom. Zaobserwowano, iż rozwijały się one w niedotlenowanych obszarach nowotworu, powodując lizę komórek nowotworowych i całkowitą regresję guza. Efekt terapeutyczny został dodatkowo wzmocniony przez podanie chemioterapeutyków (dolastatyny-10 i mitomycyny C). Niemniej jednak, ok. 15-45 proc. leczonych myszy zginęło, prawdopodobnie w wyniku zbyt dużego stężenia toksycznych metabolitów, powstających ze zniszczonych komórek.
Ostatnio podjęto próby wykorzystania w terapii zmodyfikowanych genetycznie beztlenowych bakterii Clostridium sporogenes, będących nośnikami genu deaminazy cytozyny z Escherichia coli [14]. Produkt ekspresji samobójczego genu metabolizuje nieaktywny prolek 5-fluorocytozynę (5-FC) do aktywnego leku 5-fluorouracylu. W badaniach wykazano, że w niedotlenowanych regionach nowotworu, liczba rozwijających się ze spor bakterii Clostridium sporogenes wynosiła 1-2 x 10⁸ cfu/g tkanki (cfu, ang. colony forming units, jednostki koloniotwórcze), natomiast bakterii Clostridium beijerinckii jedynie 10⁵-10⁶ cfu/g tkanki. Liczba namnożonych bakterii Clostridium sporogenes, jak i stężenie powstającego w guzie nowotworowym leku (5-FU) były wystarczające, aby wywołać efekt terapeutyczny.
W terapii nowotworów próbuje się również wykorzystać bakterie z rodzaju Bifidobacterium [15, 16]. Te Gram-dodatnie, obligatoryjnie beztlenowe i niepatogenne pałeczki, występują w jelicie cienkim i grubym u człowieka i innych ssaków oraz w stolcu niemowląt karmionych piersią. Bakterie Bifidobacterium longum swoiście lokalizują się tylko w obrębie niedotlenowanych obszarów guza i mogą być użyte jako nośniki terapeutycznych genów w terapii przeciwnowotworowej [16].
Oprócz badań nad Clostridium sp. i Bifidobacterium sp. wykonano szereg doświadczeń, wykorzystując fakultatywnie beztlenowe bakterie Salmonella typhimurium, które mogą rozwijać się zarówno w warunkach beztlenowych, jak i tlenowych.

Raporty donoszą, iż bakterie używane jako czynniki przeciwnowotworowe mogą być bezpiecznie podawane zwierzętom doświadczalnym, pod warunkiem że zjadliwość tych bakterii jest pod stałą kontrolą. Proces pozbawiania mikroorganizmu właściwości chorobotwórczych nosi nazwę atenuacji. Pawelek i wsp. [17] skonstruowali atenuowany szczep Salmonella typhimurium w ten sposób, że drobnoustrój stracił zjadliwość na skutek wad metabolizmu wywołanych mutacją auksotroficzną (niezdolny do syntezy niektórych aminokwasów, puryn i pirymidyn). Za właściwości chorobotwórcze bakterii Gram-ujemnych odpowiedzialny jest immunologicznie czynny element strukturalny ściany komórkowej, tj. lipopolisacharyd (LPS) - silna endotoksyna. W celu wyeliminowania powstawania u zwierząt wstrząsu septycznego skonstruowano, w wyniku delecji genów msbB i purI, znacznie bardziej atenuowany szczep Salmonella typhimurium (VNP20009) [20]. Gen msbB koduje enzym, biorący udział w przyłączanie kwasu mirystynowego do lipidu A w lipopolisacharydzie [19]. Wykazano, że bakterie Salmonella typhimurium z zaburzoną syntezą lipidu A mają ograniczoną zdolność do indukowania czynnika martwicy nowotworów-α (TNF-α), zarówno in vivo, jak i in vitro [18, 19, 20]. Stąd atenuowany szczep VNP20009 nie wywołuje stanów zapalnych. Dodatkowo bakterie zmodyfikowano genetycznie genem samobójczym deaminazy cytozyny z Escherichia coli.

Po dożylnym podaniu szczepu VNP20009 w ilości 1 x 10⁴⁶ cfu/mysz obserwowano skuteczne zahamowanie wzrostu guzów pierwotnych, np. czerniaka mysiego. Liczba bakterii w nowotworze była 10³ razy większa niż w wątrobie [21]. Podanie szczepu VNP20009 w dawce 2 x 10⁶ cfu/mysz również spowodowało znaczne zahamowanie liczby przerzutów czerniaka do płuc w porównaniu z próbami kontrolnymi [20].

Najskuteczniejsze efekty terapeutyczne obserwowano przy bakteriolitycznej terapii skojarzonej z systemowym podawaniem proleku (5-FC), jak również z radioterapią [11].

Badania wykazały, że kombinacja zmodyfikowanych genetycznie bakterii Salmonella typhimurium (z delecją genów msbB i purI) z radioterapią znacznie zwiększa efektywność terapii [11, 22]. Aktywność przeciwnowotworową oceniano poprzez oznaczanie liczby dni (od zaszczepienia myszy komórkami nowotworowymi) potrzebnych do wytworzenia się 1 g guza. Skuteczne zahamowanie procesu nowotworowego i najdłuższy czas przeżywania zwierząt doświadczalnych zaobserwowano po podawaniu myszom bakterii Salmonella typhimurium oraz przy największej zakumulowanej dawce promieniowania (50 Gy). Dla tej kombinacji mysie czerniaki osiągnęły wielkości 1 g przeciętnie w ciągu 100 dni. Tę samą masę po podaniu do guza wyłącznie bakterii Salmonella lub po napromieniowaniu promieniami X uzyskano kolejno po czasie 5 razy i ok. 50 proc. krótszym.



SWOISTOŚĆ I MECHANIZM DZIAŁANIA BAKTERII ONKOLITYCZNYCH
W NOWOTWORZE


Jak już wspomniano, bakterie onkolityczne wykazują swoistą lokalizację w nowotworze w stosunku do prawidłowych tkanek. Bogate w składniki odżywcze środowisko nowotworu, zwiększony metabolizm komórek nieprawidłowych oraz hipoksja czy nekroza w guzach nowotworowych mogą powodować selektywny wzrost bakterii beztlenowych. Charakterystyczny sposób poruszania się niektórych drobnoustrojów onkolitycznych (posiadających rzęski) może ułatwiać ich rozprzestrzenianie się w obrębie nowotworu.
W odróżnieniu od obligatoryjnie beztlenowych bakterii Clostridium sp., które mogą się rozwijać tylko w niedotlenowanych i nekrotycznych regionach dużych guzów, fakultatywnie beztlenowe bakterie Salmonella typhimurium rozwijają się już w małych guzach o masie 0,1 g (cyt. wg Luo [20]).

Aby móc rozwijać się w tkankach, bakterie muszą znaleźć nie tylko odpowiednie środowisko odżywcze ale także ominąć szereg reakcji obronnych organizmu.

Mimo iż modyfikowane genetycznie bakterie Salmonella typhimurium są pozbawione zjadliwości, nie wyklucza się, że dzięki cytotoksycznym składnikom ich ściany komórkowej mogą indukować apoptozę makrofagów i granulocytów (cyt. wg Luo [20]). Inni sugerują, że niedotlenowane obszary nowotworów powodują nieprawidłowe funkcjonowanie makrofagów, a tym samym umożliwiają rozwój bakteriom beztlenowym [18]. Natomiast przeciwciała i komplement surowicy, mogłyby wspólnie niszczyć bakterie, ale ich przedostawanie się do środowiska nowotworowego jest silnie ograniczone poprzez nieregularną sieć naczyń oraz dodatnie ciśnienie wewnątrznowotworowe [18, 23]. W guzach nowotworowych nie wykryto granulocytów odpowiedzialnych za eliminowanie drobnoustrojów z organizmu gospodarza. Brak infiltracji granulocytów w nowotworach może być spowodowane, np. wydzielaniem transformującego czynnika wzrostu (TGF-b) przez komórki nowotworowe albo komórki zrębu [11, 18, 23]. Może to tłumaczyć, dlaczego usuwanie z nowotworu przez układ immunologiczny bakterii zmodyfikowanych genetycznie odbywa się wolniej i mniej efektywniej niż w prawidłowych tkankach [23]. Mimo wszystko, u myszy leczonych szczepem VNP20009 zaobserwowano, że neutrofile towarzyszyły jednak nekrozie guzów [20].

Przetrwalniki bakterii Clostridium sp. nie wywołują odpowiedzi immunologicznej [14]. Brak różnic w liczbie rozwijających się bakterii pomiędzy 7. a 14. dniem od podania spor sugeruje, że bakterie te rzeczywiście nie wywołują odpowiedzi immunologicznej.

Mechanizm przeciwnowotworowej aktywności atenuowanej bakterii Salmonella typhimurium w kombinacji z radioterapią również nie jest do końca wyjaśniony. Prawdopodobnie bakterie Salmonella typhimurium wydzielają związki, które zwiększają wrażliwość komórek na radioterapię, np. poprzez zahamowanie systemu naprawczego w komórkach nowotworowych. Promieniowanie zmienia środowisko nowotworu na bardziej dostępne dla bakterii i ich toksyn. Platt i wsp. [22] przypuszczają, iż bakterie te jednak rekrutują komponenty systemu immunologicznego (np. limfocyty, makrofagi, neutrofile) do guza i w ten sposób komórki nowotworowe stają się bardziej wrażliwe na atak układu immunologicznego.



PRÓBY KLINICZNE



Niepatogenny szczep Salmonella typhimurium (VNP20009) został wykorzystany w badaniach klinicznych. W fazie pierwszej próbowano określić bezpieczną dawkę i kolonizację drobnoustrojów u 9 osób, chorych m.in. na czerniaka, raka nerki, prostaty oraz neuroendokrynnego raka skóry (rak Merkla). Po doguzowym podaniu bakterii zaobserwowano u pacjentów gorączkę, ból w miejscu wstrzyknięcia oraz osłabienie organizmu. U większości chorych badania mikroskopowe wykazały ostre stany zapalne, obszary nekrozy oraz zwłóknienia w obrębie nowotworów. Jedynie u dwóch osób zaobserwowano widoczny wzrost guza nowotworowego, natomiast u pozostałych chorych guzy nie zmieniły się od momentu podania szczepu VNP20009. W fazie pierwszej znajdują się także próby wykorzystania bakterii onkolitycznych jako nośników terapeutycznych (samobójczych) genów [24].



ZAKOŃCZENIE/WNIOSKI


W artykule starano się przedstawić możliwości wykorzystania bakterii beztlenowych w terapii nowotworów.

Bakterie onkolityczne zdolne są do selektywnego namnażania się w niedotlenowanym środowisku nowotworowym oraz do niszczenia komórek nowotworowych. Mikroorganizmy te mogą być też swoistymi nośnikami terapeutycznych (samobójczych) genów, np. deaminazy cytozyny. Enzym kodowany przez samobójczy gen umożliwia przekształcanie nieaktywnego proleku w substancje, której działanie prowadzi do śmierci komórek.
Wykorzystanie bakterii onkolitycznych może przyczynić się do stworzenia nowej strategii terapeutycznej, polegającej na bezpośredniej, niezwykle selektywnej eliminacji komórek nowotworowych.

Bakteriolityczna terapia skojarzona jednocześnie z chemioterapią lub radioterapią może okazać się skutecznym rozwiązaniem w leczeniu guzów litych oraz przerzutów.



PIŚMIENNICTWO

1. Mountain A. Gene therapy: the first decade. Trends Biotechnol 2001; 18: 119-28.
2. Somia N, Verma IM. Gene therapy: trials and tribulations. Nat Rev Genet 2000; 1: 91-9.
3. Brown JM, Giaccia AJ. The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy. Cancer Res 1998; 58: 1408-16.
4. Jain RK, Forbes NS. Can engineered bacteria help control cancer? Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 14748-50.
5. Schlegel HG. Mikrobiologia ogólna. PWN Warszawa 1996.
6. Parker RC, Plummer HC, Siebenmann CO, Chapman M. Effect of histolyticus infection and toxin on transplantable mouse tumors. Proc Soc Exp Med 1947; 66: 461-7.
7. Malmgren RA, Flaningan CC. Localization of the vegetative form of Clostridium tetani in mouse tumors following intravenous spore administration. Cancer Res 1955; 15: 473-8.
8. Carey RW, Holland JF, Whang HY, Neter E, Bryant B. Clostridial oncolysis in man. Eur J Cancer 1967; 3: 37-46.
9. Fox ME, Lemmon MJ, Mauchline ML, Davis TO, Giaccia AJ, Minton NP, Brown JM. Anaerobic bacteria as a deliver system for cancer gene therapy: in vitro activation of 5- fluorocytosine by genetically engineered clostridia. Gene Ther 1996; 3: 173-78.
10. Lemmon MJ, Zij P, Fox ME, Mauchline ML, Giaccia AJ, Minton NP, Brown JM. Anaerobic bacteria as a gene delivery system that is controlled by the tumor microenvironment. Gene Ther 1997; 4: 791-6.
11. Bermudes D, Low KB, Pawelek J, Feng M, Belcourt M, Zheng LM, King I. Tumor-selective Salmonella-based cancer therapy. Biotechnol Genet Engineering Rev 2001; 18: 219-33.
12. Theys J, Landuyt W, Nuyts S, Van Mellaert L, van Oosterom A, Lambin P, Anne J. Specific targeting of cytosine deaminase to solid tumors by engineered Clostridium acetobutylicum. Cancer Gene Ther 2001; 8: 294-7.
13. Dang LH, Bettegowda C, Huso DL, Kinzler KW, Vogelstein B. Combination bacteriolytic therapy for the treatment of experimental tumors. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 15155-60.
14. Liu SC, Minton N, Giaccia A, Brown J. Anticancer efficacy of systemically delivered anaerobic bacteria as gene therapy vectors targeting tumur hypoxia/necrosis. Gene Ther 2002; 9: 291-6.
15. Yazawa K, Fujimori M, Amano J, Kano Y, Taniguchi S. Bifidobacterium longum as a delivery system for cancer gene therapy: selective localization and growth in hypoxic tumors. Cancer Gene Ther 2000; 7: 269-74.
16. Yazawa K, Fujimori M, Nakamura T, Sasaki T, Amano J, Kano Y, Taniguchi S. Bifidobacterium longum as a delivery system for gene therapy of chemically induced rat mammary tumors. Breast Cancer Res Treat 2001; 66: 165-70.
17. Pawelek JM, Low KB, Bermudes D. Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector. Cancer Res 1997; 57: 4537-44.
18. King I, Luo X, Feng M, et al. Tumour therapy using Salmonella. Emerging Drugs 2000; 5: 211-9.
19. Zheng LM, Luo X, Feng M, et al. Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor- selective protein delivery vector. Oncol Res 2000; 12: 127-35.
20. Luo X, Li Z, Lin S, et al. Antitumor effect of VNP20009, an attenuated Salmonella, in murine tumor models. Oncol Res 2001; 12; 501-8.
21. Tjuvajev J, Blasberg R, Luo X, Zheng LM, King I, Bermudes D. Salmonella-based tumor-targeted cancer therapy: tumor amplified protein expression therapy (TAPET) for diagnostic imaging. J Control Release 2001; 74: 313-5.
22. Platt J, Sodi S, Kelley M, Rockwell S, Bermudes D, Low KB, Pawelek J. Antitumour effects of genetically engineered Salmonella in combination with radiation. Eur J Cancer 2000; 36: 2397-402.
23. Sznol M, Lin SL, Bermudes D, Zheng LM, King I. Use of prefentially replicating bacteria for the treatment of cancer. J Clinic Invest 2000; 105: 1027-30.
24. Mier J, Olencki T, Atkins M, et al. Phase I trial of a live, attenuated Salmonella typhimurium (VNP20009) administered by direct intra-tumoral (IT) injection. Proc Am Soc Clin Oncol 2001; 20 (część 1): Abstr 1043.



ADRES DO KORESPONDENCJI

mgr Joanna Jazowiecka

Zakład Biologii Molekularnej

Centrum Onkologii - Instytut

im. M. Skłodowskiej-Curie

ul. Wybrzeże Armii Krajowej 15

44-101 Gliwice

tel. (032) 278 97 27

fax (032) 231 35 12

e-mail: jjazowiecka@io.gliwice.pl



Praca została sfinansowana z grantu KBN Nr 3 PO5A O44 22.