Protein inhibitors of angiogenesis in cancer therapy

Wstęp
Ponad 30 lat temu Judah Folkman [1] przedstawił hipotezę, że wzrost guzów nowotworowych zależy od wytworzenia własnej sieci naczyń krwionośnych. Hipoteza ta stała się podstawą terapii antyangiogennej. Celem tej strategii jest zahamowanie wzrostu guza poprzez zablokowanie procesu angiogenezy. Angiogeneza, inaczej neowaskularyzacja, to proces tworzenia nowych naczyń krwionośnych z już istniejących, regulowany czynnikami proangiogennymi i antyangiogennymi. W zależności od tego, która grupa czynników dominuje, ma miejsce indukcja angiogenezy lub jej zahamowanie [1].
Dotychczas zbadano ok. 370 inhibitorów angiogenezy, z czego część stanowią proteolityczne fragmenty większych białek [2]. Najbardziej znane czynniki to angiostatyna [3] i endostatyna [4]. Do grupy tej należą także m.in. wazostatyna – fragment kalretikuliny, tumstatyna, która jest C-końcowym fragmentem kolagenu IV, a także fragment prolaktyny o masie cząsteczkowej 16 kDa i fragment metaloproteazy 2 (PEX) [2]. W badaniach przedklinicznych fragmenty białek okazały się silnymi inhibitorami angiogenezy oraz wykazywały działanie przeciwnowotworowe [2, 5, 6]. Badania kliniczne ujawniły jednak wiele problemów, związanych z oceną działania czynników antyangiogennych. Ponadto angiostatyna i endostatyna nie wykazywały większej aktywności przeciwnowotworowej w I fazie badań [7, 8].

Rola białkowych czynników antyangiogennych
w terapii nowotworów
Znanych jest ponad 20 endogennych czynników antyangiogennych [1, 9, 10], które dzielą się na kilka podgrup. Są to: cytokiny (interleukina-12, -18, interferon α/β), inhibitory angiogenezy (angiopoetyna-2, inhibitory metaloproteaz – TIMPs, inhibitor aktywatorów plazminogenu – PAI, antytrombina-1, IP-10, maspina), antagoniści czynników proangiogennych (rozpuszczalny receptor naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu – VEGFR-1) oraz polipeptydy antyangiogenne – proteolityczne fragmenty białek (tab. 1.).
Wszystkie antyangiogenne polipeptydy są proteolitycznymi fragmentami białek. Białka te (z wyjątkiem kalretikuliny [11]) nie mają właściwości antyangiogennych i pełnią różne funkcje w organizmie [2]. Niektóre z polipeptydów powstają w warunkach fizjologicznych i biorą udział w regulacji angiogenezy. Należą do nich: angiostatyna, endostatyna, antytrombina, tumstatyna, fragment kolagenu XV [5] i fragment metaloproteinazy 2 (PEX) [12]. Wykazano, że sam guz nowotworowy może indukować powstawanie inhibitorów polipeptydowych poprzez wydzielanie lub aktywację proteaz, które biorą udział w powstaniu fragmentów antyangiogennych [2].
Wszystkie białkowe czynniki antyangiogenne hamują wzrost doświadczalnych guzów pierwotnych oraz przerzutów (tab. 2., 3.). Poprzez blokowanie różnych etapów angiogenezy, takich jak proliferacja komórek śródbłonkowych, migracja lub rekonstrukcja naczyń powodują one zahamowanie tworzenia nowych naczyń okołonowotworowych [2, 5, 6]. W konsekwencji wzrost guza zostaje zahamowany, a przerzuty pozostają w stanie uśpienia.
W doświadczeniach przedklinicznych obserwowano zahamowanie różnych typów nowotworów, gdy podawano zwierzętom zrekombinowane białka antyangiogenne, podczas stosowania antyangiogennej terapii genowej oraz kiedy zaszczepiano zwierzęta komórkami nowotworowymi wydzielającymi dany czynnik antyangiogenny. Przykładowe wyniki przedstawiono w tab. 2. i 3.

Czynniki antyangiogenne są lekami cytostatycznymi, dla których nie obserwuje się prostej zależności uzyskanego efektu od stężenia czynnika. Jednak w niektórych doświadczeniach uzyskany efekt terapeutyczny zależał od ilości podawanego białka [4, 13], a także od czasu trwania terapii (po zaprzestaniu leczenia guz odrastał) [4], wielkości guza w momencie rozpoczęcia terapii (im mniejszy guz, tym lepsze efekty terapeutyczne [14]) oraz od typu nowotworu. Wrażliwość guza na terapię antyangiogenną może zależeć od swoistego dla danego nowotworu fenotypu angiogennego, czyli rodzaju wytwarzanych przez komórki nowotworowe czynników proangiogennych, a także od możliwości wytworzenia oporności na lek antyangiogenny [9].

Zwiększoną skuteczność terapii antyangiogennej obserwuje się w wyniku skojarzenia inhibitorów angiogenezy z radioterapią [15] lub chemioterapią [16]. Również zastosowanie dwóch czynników antyangiogennych zwiększa efekt terapeutyczny [17–19]. Grupa Weischelbauma [20] zaobserwowała synergiczny efekt radioterapii i angiostatyny w leczeniu różnych typów nowotworów. Podobny efekt uzyskano podczas podawania cisplatyny i fragmentu aktywatora plazminogenu uPa, peptydu Å6 o właściwościach antyangiogennych [21]. Przypuszcza się, że czynniki antyangiogenne hamując rozwój niekompletnych naczyń, normalizują unaczynienie guza, co prowadzi do lepszego utlenowania komórek nowotworowych i zmniejszenia ciśnienia wewnątrzmiąższowego. W ten sposób czynniki antyangiogenne zwiększać mają efektywność chemio- i radioterapii [22]. Zwiększoną skuteczność terapii antyangiogennej obserwuje się również podczas stosowania dwóch czynników antyangiogennych razem, np. angiostatyna + endostatyna [17], wazostatyna + interleukina-12 [19] czy białko 10 indukowane interferonem z wazostatyną [18], a także w połączeniu z innymi strategiami terapeutycznymi, np. tzw. antysensami (np. endostatyna + oligonukleotyd hamujący ekspresję receptora naskórkowego czynnika wzrostu – EGF) [23]. W przypadku łączenia dwóch lub więcej czynników, efektu addycji lub synergii należy się spodziewać wyłącznie, gdy inhibitory działają na różne etapy tworzenia naczyń lub gdy mają różne mechanizmy działania [24].
Problemy i perspektywy terapii antyangiogennej
W różnych fazach badań klinicznych znajduje się ponad 75 czynników antyangiogennych [9]. Wyłoniły się podczas nich dwa problemy: trudności w ocenie aktywności inhibitorów angiogenezy jako leków przeciwnowotworowych oraz niska skuteczność czynników antyangiogennych w leczeniu zaawansowanych stadiów choroby nowotworowej.

Dlaczego trudno jest badać czynniki
antyangiogenne?
Ze względu na cytostatyczny charakter leków antyangiogennych badanie ich nie jest zadaniem łatwym. Białkowe czynniki antyangiogenne są bardzo dobrze tolerowane i podczas ich stosowania nie obserwuje się większych efektów ubocznych [25]. Trudno jest określić maksymalną dopuszczalną dawkę. Nie obserwuje się ponadto znaczącego wpływu dawek czynnika antyangiogennego na uzyskany efekt terapeutyczny [7]. Większość czynników antyangiogennych stabilizuje wzrost nowotworu dopiero po dłuższym czasie stosowania terapii, dlatego nie można określić skuteczności leku dokonując tylko pomiaru wielkości guza. Z tego względu jako efekty końcowe dla terapii antyangiogennej przyjmuje się unaczynienie guza [25], a także pomiar stężenia niektórych markerów angiogenezy we krwi, takich jak poziom VEGF, E-selektyny, czy VCAM-1 (molekuła adhezyjna-1 komórki naczyniowej) [1]. Wydaje się, że oznaczanie ilości komórek śródbłonkowych rozsiewanych do krwiobiegu z naczyń okołonowotworowych może być także wskaźnikiem skuteczności terapii [9].

Ze względu na konieczność ciągłego podawania leku istotne jest ustalenie schematu terapii, który uwzględniałby zarówno właściwości farmakokinetyczne czynnika (np. okres półtrwania we krwi), jak i typ nowotworu, stadium choroby oraz fenotyp angiogenny guza danego pacjenta, który zależy zarówno od jego typu, jak i stadium progresji [26, 31]. Aby ocenić skuteczność leków antyangiogennych pacjenci powinni być dobierani pod kątem typu nowotworu, stadium choroby oraz fenotypu angiogennego.
Problemem jest także niska skuteczność terapii antyangiogennej w leczeniu zaawansowanych nowotworów. Mimo iż endostatyna i angiostatyna w badaniach przedklinicznych na modelach zwierzęcych silnie hamowały wzrost różnych typów nowotworów (tab. 2., 3.), to jednak nie wykazywały podobnej skuteczności w I fazie badań klinicznych [7, 8].

laczego dotychczasowe wyniki badań
klinicznych nie pokrywają się z rezultatami
eksperymentów na zwierzętach?
Próbując wyjaśnić te rozbieżności, zwraca się uwagę na kilka aspektów. Pierwszy to trudności w interpretowaniu wyników badań aktywności leków antyangiogennych uzyskanych na zwierzęcych modelach ludzkich nowotworów. Przypuszcza się, że mysie naczynia krwionośne w guzie pochodzenia ludzkiego, w obcym środowisku, mogą być bardziej podatne na terapię antyangiogenną [1]. Cao [26] zwraca uwagę na różnice w budowie między nowotworami doświadczalnymi a ludzkimi. Nowotwory przeszczepiane zwierzętom są rosnącymi szybko guzami, zbudowanymi z jednakowych komórek. Natomiast ludzkie nowotwory spontaniczne rosną wolno i składają się z niejednorodnych pod względem genetycznym komórek nowotworowych, które mogą wytwarzać różne czynniki proangiogenne [26]. Zablokowanie jednego z czynników proangiogennych może nie wystarczać, aby zahamować proces angiogenezy. Yu i wsp. [27] wykazali natomiast zmniejszoną wrażliwość na terapię antyangiogenną nowotworów z nieaktywnym genem p53. Pokazali, że komórki te są prawie całkowicie oporne na apoptozę, czyli proces kontrolowanej śmierci, indukowaną stanem hipoksji [27]. Problem stanowi również badanie tych leków u chorych z zaawansowaną chorobą nowotworową. Na tym etapie choroby angiogeneza nie odgrywa już decydującej roli, ponieważ doszło do rozsiewu i rozwoju przerzutów. Wydaje się, że terapia antyangiogenna może być bardziej korzystna dla pacjentów z niezaawansowaną chorobą nowotworową lub uznawanych za wyleczonych, ale z potencjalnym ryzykiem nawrotu choroby i rozwoju przerzutów (np. stadium IIIa raka płuc lub czerniaka). Przypuszczenia te potwierdzają doświadczenia przedkliniczne, w których obserwowano najwyższą skuteczność inhibitorów angiogenezy, gdy były podawane w stadium początkowym choroby, czyli przejścia guza nieunaczynionego do etapu guza unaczynionego [14]. Niska skuteczności czynników antyangiogennych może się również wiązać z działaniem czynników antyangiogennych tylko na jeden z wielu wydzielanych przez guz czynników proangiogennych. Zahamowanie jednego z nich, np. poprzez przeciwciała, może być kompensowane nadekspresją innych podobnie działających czynników, co w konsekwencji prowadzi do wytworzenia oporności na dany czynnik. Oporność na leki antyangiogenne indukujące apoptozę w komórkach śródbłonkowych (głównie czynniki białkowe, inhibitory kinazy tyrozynowej i integryn) może być również spowodowana ekspresją w tych komórkach innych receptorów lub nadekspresją wewnątrzkomórkowych czynników antyapoptotycznych, np. białka surwiwiny [9].

Perspektywy terapii antyangiogennej
W świetle dotychczasowych badań wydaje się, że terapia antyangiogenna może być stosowana jako strategia zapobiegająca rozwojowi choroby oraz wspomagająca strategie cytotoksyczne (ryc. 1.).
Białkowe czynniki antyangiogenne mogą być skuteczne w zapobieganiu nawrotowi choroby lub rozwojowi przerzutów u pacjentów po zabiegu chirurgicznym, u których pomimo braku objawów istnieje ryzyko nawrotu i występowania niewykrywalnych, małych ognisk przerzutowych. Taka terapia miałaby charakter chroniczny, a leki musiałyby być podawane w odpowiednich kombinacjach i schemacie dostosowanym indywidualnie do danego typu nowotworu oraz pacjenta, aby zwiększyć skuteczność terapii oraz zapobiec indukowaniu oporności. Konieczność indywidualizacji terapii jest podyktowana zróżnicowaniem guzów nowotworowych pomiędzy poszczególnymi pacjentami. Wynika to ze wspomnianego wcześniej specyficznego fenotypu angiogennego guza oraz tzw. mikrośrodowiska guza, na które składają się komórki nowotworowe, prawidłowe (fibroblasty, komórki śródbłonkowe, komórki układu immunologicznego) oraz macierz pozakomórkowa [26, 28, 29, 31]. Przewagę nad terapią monolekową miałoby stosowanie kombinacji leków o odmiennych mechanizmach działania (większa skuteczność i mniejsze prawdopodobieństwo indukcji oporności). Ze względu na ciągłość terapii leki antyangiogenne musiałyby być bardzo bobrze tolerowane, nawet przy dłuższym podawaniu w wysokiej dawce.
Warto wspomnieć także o tzw. chemioterapii antyangiogennej. Strategia ta polega na częstszym niż w schemacie klasycznym podawaniu chemioterapeutyku (paklitaksel, cyklofosfamid, doksorubicyna, winkrystyna) w mniejszej dawce nietoksycznej dla komórek nowotworowych, natomiast działającej cytotoksycznie na komórki śródbłonkowe [30]. Taki schemat podawania pozwala zapobiec indukowaniu chemiooporności oraz zmniejszyć efekty uboczne obserwowane podczas stosowania maksymalnej dawki w chemioterapii konwencjonalnej.

W przypadku bardziej zaawansowanych stadiów choroby nowotworowej terapia antyangiogenna może stanowić element wspomagający, zwiększający skuteczność strategii tradycyjnych, takich jak radioterapia i chemoterapia oraz nowszych, jak immunoradioterapia (ryc. 2.). Pewnym rozwiązaniem dla kosztownej terapii białkowej może być antyangiogenna terapia genowa. Skuteczna terapia genowa nie tylko znacznie ograniczyłaby koszty leczenia, ale również zapewniałaby ciągłą obecność terapeutyku we krwi [6]. Terapia antyangiogenna może być także skojarzona z lekami lub genami przenoszonymi za pomocą nośników swoiście rozpoznających komórki nowotworowe lub śródbłonkowe naczyń okołonowotworowych (terapia przeciwnaczyniowa). Dotychczasowe wyniki badań przedklinicznych wskazują na dużą skuteczność tych strategii [32, 33].
Piśmiennictwo
1. Griffioen AW, Molema G. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the ireatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic Inflammation. Pharmacol Reviews 2000; 52: 237-68.
2. Cao Y. Endogenous angiogenesis inhibitors and their therapeutic implications. Int J Biochem Cell Biol 2001; 33: 357-69.
3. O’Reilly MS, Holmgren L, Chen C, Folkman J. Angiostatin induces and sustains dormancy oh human primary tumors in mice. Nature Medicine 1996; 12: 689-92.
4. O’Reilly MS, Boehm T, Shing Y, et al. Endostatin: An endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell 1997; 88: 277-85.
5. Marneros AG, Olsen BR. The role of collagen-derived proteolytic fragments in angiogenesis. Matrix Biol 2001; 20: 337-45.
6. Tandle A, Blazer DG 3rd, Libutti SK. Antiangiogenic gene therapy of cancer: recent developments. J Transl Med 2004; 2: 22.
7. Thomas JP, Arzoomanian RZ, Alberti D, et al. Phase I pharmacokinetic and pharmacodynamic study of recombinant human endostatin in patients with advanced solid tumors. J Clin Oncol 2003; 21: 223-31.
8. Beerepoot LV, Witteveen EO, Groenewegen G, et al. Recombinant human angiostatin by twice-daily subcutaneous injection in advanced cancer: a pharmacokinetic and long-term safety study. Clin Cancer Res 2003; 9: 4025-33.
9. Scappaticci FA. Mechanisms and future directions for angiogenesis-based cancer therapies. J Clin Oncol 2002; 20: 3906-27.
10. Luttun A, Auterio M, Tjewa M, Carmeliet P. Genetic dissection of tumor angiogenesis: are PIGF and VEGFR-1 novel anti-cancer targets? Biochim Biophys Acta 2004; 1654: 79-94.
11. Coppolino MG, Woodside MJ, Demaurex N, Grinstein S, et al. Calreticulin is essential for integrin-mediated calcium signalling and cell adhesion. Nature 1997; 386: 843-7.
12. Brooks PC, Stilletti S, Von Schalscha TL, et al. Disruption of angiogenesis by PEX, a noncatalytic metalloproteinase fragment with integrin binding activity. Cell 1998; 92: 391-400.
13. Pike SE, Yao L, Jones KD, et al. Vasostatin, a calreticulin fragment, inhibits angiogenesis and suppresses tumor growth. J Exp Med 1998; 188: 2349-26.
14. Bergers G, Javaherian K, Lo K-M, et al. Effects of angiogenesis inhibitors on multistage carcinogenesis in mice. Science 1999; 284: 808-11.
15. Greenberg JS. Antitumor Interactions of Short Course Endostatin and Ionizing Radiation. Cancer J 2000; 6: 279-81.
16. Kakeji Y, Teicher BA. Preclinical studies of the combination of angiogenesis inhibitors with cytotoxic agents. Invest New Drugs 1997; 15: 39-48.
17. Yokoyama Y, Dhanabal M, Griffioen AW, et al. Synergy between angiostatin and endostatin: inhibition of ovarian cancer growth. Cancer Res 2000; 60: 2190-6.
18. Yao L, Pike SE, Pittaluga S, et al. Anti-tumor activities of the angiogenesis inhibitors interferon-inducible protein-10 and the calreticulin fragment vasostatin. Cancer Immunol Immunother 2002; 51: 358-66.
19. Yao L, Pike SE, Setsuda J, et al. Effective targeting of tumor vasculature by the angiogenesis inhibitors vasostatin and interleukin-12. Blood 2000; 96: 1900-5.
20. Mauceri HJ, Hannan NN, Beckett MA, et al. Combined effects of angiostatin and ionizing radiation in antitumor therapy. Nature 1998; 394: 287-91.
21. Mishima K, Mazar AP, Gown A, et al. A peptide derived from the non-receptor-binding region of urokinase plasminogen activator inhibits glioblastoma growth and angiogenesis in vivo in combination with cisplatin. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 2000; 97: 8484-9.
22. Folkman J. Angiogenesis and apoptosis. Semin Cancer Biol 2003; 13: 159-67.
23. Li M, Ye C, Feng Ch, et al. Enhanced antiangiogenic therapy of squamous cell carcinoma by combined endostatin and epidermal growth factor receptor – antisense therapy. Clin Cancer Res 2002; 8: 3570-8.
24. Cline EI, Bicciato S, DiBello C, Lingen MW. Prediction of in vivo synergistic activity of antiangiogenic compounds by gene expression profiling. Cancer Res 2002; 62: 7143-8.
25. Herbst RS, Mullani NA, Davis DW, et al. Development of biologic markers of response and assessment of antiangiogenic activity in a clinical trial of human recombinant endostatin. J Clin Oncol 2002; 20: 3804-14.
26. Cao Y. Antiangiogenic cancer therapy. Semin Cancer Biol 2004; 14: 139-45.
27. Yu JL, Rak JW, Coomber BL, et al. Effect of p53 status on tumor response to antiangiogenic therapy. Science 2002; 295: 1526-8.
28. Radisky D, Hagios C, Bissell MJ. Tumors are unique organs defined by abnormal signaling and context. Semin Cancer Biol 2001; 11: 87-95.
29. Ahmad SA, Jung YD, Liu W, et al. The role of the microenvironment and intercellular cross-talk in tumor angiogenesis. Semin Cancer Biol 2002; 12: 105-12.
30. Browder T, Butterfield CE, Kraling BM, et al. Antiangiogenic scheduling of chemotherapy improves efficacy against experimental drug-resistant cancer. Cancer Res 2000; 60: 1878-86.
31. Bamias A, Dimopoulos MA. Angiogenesis in human cancer: implications in cancer therapy. Eur J Intern Med 2003; 14: 459-69.
32. Arap W, Pasqualini R, Ruoslahti E. Cancer treatment by targeted drug delivery to tumor vasculature in a mouse model. Science 1998; 279: 377-80.
33. Hood JD, Bednarski M, Frausto R, et al. Tumor regression by targeted gene delivery to the neovasculature. Science 2002; 296: 2404-7.
34. Kamphaus GD, Colorado PC, Panka DJ, et al. Canstatin, a novel matrix-derived inhibitor of angiogenesis and tumor growth. J Biol Chem 2000; 275: 1209-15.
35. Maeshima Y, Kolorado PC, Torre A, et al. Distinct antitumor properties of a type IV collagen domain derived from basement membrane. J Biol Chem 2000; 275: 21340-8.
36. Perletti G, Concari P, Giardini Ret al. Antitumor activity of endostatin against carcinogen-induced rat primary mammary tumors. Cancer Res 2000; 60: 1793-6.
37. Peroulis I, Jonas N, Saleh M. Antiangiogenic activity of endostatin inhibits C6 glioma growth. Int J Cancer 2002; 97: 839-45.
38. Kim Lee Sim B, O’Reilly MS, Liang H, et al. A recombinant human angiostatin protein inhibits experimental primary and metastatic cancer. Cancer Res 1997; 57: 1329-34.
39. Lannutti BJ, Gately ST, Quevedo ME, et al. Human angiostatin inhibits murine hemangioendothelioma tumor growth in vivo. Cancer Res 1997; 57: 5277-80.
40. Joe Y-A, Hong Y-K, Chung D-S, et al. Inhibition of human malignant glioma growth in vivo by human recombinant plasminogen kringles 1-3. Int J Cancer 1999; 82: 694-9.
41. Cao R, Wu H-L, Veitonmäki N, et al. Suppression of angiogenesis an tumor growth by the inhibitor K1-5 generated by plasmin-mediated proteolysis. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 1999; 96: 5728-33.
42. Bentzien F, Struman I, Martini J-F, et al. Expression of the antiangiogenic factor 16K hPRL in human HCT116 colon cancer cells inhibits tumor growth in Rag1–/– mice. Cancer Res 2001; 62: 7356-62.
43. Xiao F, Wei Y, Yang L, et al. A gene therapy for cancer based on the angiogenesis inhibitor, vasostatin. Gene Therapy 2002; 9: 1207-13.
44. Szary J, Szala S. Intra-tumoral administration of naked plasmid DNA encoding mouse endostatin inhibits renal carcinoma growth. Int J Cancer 2001; 91: 835-9.
45. Ding I, Sun JZ, Fenton B, et al. Intratumoral administration of endostatin plasmid inhibits vascular growth and perfusion in
MCa-4 murine mammary carcinomas. Cancer Res 2001; 61: 526-31.
46. Chen Q-R, Kumar D, Stass SA, Mixson J. Liposomes complexed to plasmids encoding angiostatin and endostatin inhibit breast cancer in nude mice. Cancer Res 1999; 59: 3308-12.
47. Sacco MG, Caniatti M, Catň EM, et al. Liposome-delivered angiostatin strongly inhibits tumor growth and metastatization in a transgenic model of spontaneous breast cancer. Cancer Res 2000; 60: 2660-5.
48. Griscelli F, Li H, Bennaceur-Griscelli A, et al. Angiostatin gene transfer: inhibition of tumor growth in vivo by blockage of endothelial cell proliferation associated with a mitosis arrest. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 1998; 95: 6367-72.
49. Tanaka T, Cao Y, Folkman J, Fine HA. Viral vector-targeted antiangiogenic gene therapy utilizing an angiostatin complementary DNA. Cancer Res 1998; 58: 3362-9.
Adres do korespondencji
Magdalena Olbryt
Zakład Biologii Molekularnej
Centrum Onkologii – Instytut
im. M. Skłodowskiej-Curie
Oddział w Gliwicach
ul. Wybrzeże Armii Krajowej 15
44-101 Gliwice
tel. +48 32 278 96 16
faks +48 32 231 35 12
e-mail: molbryt@io.gliwice.pl

Praca została sfinansowana z grantu Nr 6 P05A 062 21