The lack of genotoxic activity of antitumor drug paclitaxel in lymphocytes exposed in vitro to therapeutic drug concentrations

WSTĘP


W latach 70. przeprowadzono zakrojone na szeroką skalę badania różnych związków pochodzenia roślinnego, z nadzieją znalezienia substancji, które można będzie stosować w leczeniu nowotworów. Jedną z nich był paklitaksel (Taxol), wykryty w korze cisu krótkoigłowego (Taxus brevifolia). Do tej pory odkryto jeszcze kilka związków o podobnej do paklitakselu budowie, występują one pod nazwą taksanów.
Obecnie paklitaksel jest stosowany rutynowo w leczeniu niektórych nowotworów, takich jak rak sutka, jajnika, niedrobnokomórkowy rak płuc oraz mięsak Kaposiego występujący u chorych na AIDS. Taksany mogą być z powodzeniem łączone z innymi lekami, co znacznie zwiększa ich zastosowanie w chemioterapii, np. w leczeniu raka jajnika z cisplatyną, a w raku piersi z doksorubicyną. Taksany obok antracyklin należą do najbardziej skutecznych leków chemioterapii raka sutka, dając 30–60 proc. remisji w monoterapii oraz do 90 proc. w terapii wielolekowej.
Działaniem niepożądanym, stanowiącym czynnik ograniczający stosowanie paklitakselu jest neutropenia. Do innych skutków ubocznych należą: uszkodzenia szpiku kostnego (np. leukopenia), utrata włosów, uszkodzenia nerwów obwodowych, zatrzymanie płynów w organizmie, reakcje uczuleniowe, bóle kostno-stawowe [1]. Sporadycznie występują też reakcje nadwrażliwości: reakcje skórne, uderzenia gorąca, ucisk w klatce piersiowej, gorączka, dreszcze oraz wymagające leczenia spadki lub wzrost ciśnienia tętniczego krwi. Może też wystąpić spastyczny skurcz oskrzeli z dusznością i silnym uczuciem niepokoju. Notowane są nieliczne przypadki zejść śmiertelnych, wywołanych silną nadwrażliwością na paklitaksel [2, 3]. Jednakże nie stwierdzono jednoznacznie czy reakcje nadwrażliwości nie są wywoływane przez inny składnik leku: polioksylowany olej rycynowy (Cremophor EL). Opracowano skuteczny sposób łagodzenia reakcji nadwrażliwości i zespołu retencji płynów, są to objawy, które w początkowym okresie ograniczały stosowanie paklitakselu. Premedykacja polega na podawaniu glikokortykosteroidów i leków blokujących receptory histaminowe H1 i H2 [4].
Niestety, w przypadku nowotworów głowy i szyi nie ustalono ostatecznie czy stosowanie paklitakselu przynosi znaczną poprawę. Stosowanie paklitakselu i docetaxelu jako pojedynczych leków, bądź w kombinacji z innymi cytostatykami lub/i radioterapią daje wysoki współczynnik odpowiedzi w niektórych przypadkach, lecz wywołuje również silne skutki uboczne, szczególnie w przypadku leczenia kilkulekowego [5]. Prowadzone są badania nad zastosowaniem leku jako środka zwiększającego podatność na radioterapię. Testy prowadzone in vitro na liniach komórkowych wykazały, iż dla wielu linii nowotworowych paklitaksel w kombinacji z naświetlaniem daje efekt addytywny i osiąga poziom odpowiedzi nawet do 100 proc. [6, 7]. Jakkolwiek wyniki badań przedklinicznych i klinicznych fazy II i III wydają się być zachęcające; autorzy wskazują na konieczność dalszych badań przed wprowadzeniem paklitakselu do rutynowego leczenia w przypadku nowotworów głowy i szyi [8].
W odróżnieniu od innych leków przeciwnowotworowych, które działają genotoksycznie na DNA komórek neoplastycznych, paklitaksel wywołuje śmierć komórki (apoptozę) poprzez oddziaływanie na mikrotubule i powstawanie hiperstabilnego wrzeciona kariokinetycznego. Istnieją również inne hipotezy na temat oddziaływań paklitakselu z materiałem biologicznym, jednak żaden autor nie neguje istotności wspomnianego wyżej mechanizmu (tab. 1.).
W literaturze nie ma wielu informacji na temat genotoksyczności paklitakselu. W ulotce dostarczanej wraz z lekiem przez producenta wspomina się o potencjalnej genotoksyczności, jednak nie są podane konkretne dane. Wobec szerokiego stosowania Taxolu w leczeniu nowotworów, bardzo istotne staje się pytanie o bezpieczeństwo pacjentów i w tym zakresie podjęto badania nad genotoksycznością preparatu paklitaksel.



MATERIAŁY I METODY


Do badania genotoksyczności zastosowano test comet assay.



Comet assay (elektroforeza
pojedynczych komórek)


Przebadano działanie leku na próbach krwi od 35 zdrowych dawców. Dla każdego przeprowadzano eksperyment, w skład którego wchodziły następujące próby:
a) zerowa (nieeksponowana na działanie leku),
b) etanolowa (zawierająca 1 proc. etanolu),
c) olejowa (zawierająca 1 proc. oleju rycynowego),
d) taxolowa (zawierająca 10 µM paklitakselu [Bristol-Mayers
Squibb]),
e) taxolowo-olejowa (zawierająca 10 µM paklitakselu oraz 1 proc. oleju rycynowego).

Izolowane z krwi limfocyty poddawano 3-godzinnej ekspozycji na ww. czynniki, ekspozycję prowadzono w 37^oC. Następnie komórki zatapiano w żelu agarozowym i nakraplano na szkiełka mikroskopowe, poddawano lizie w silnie alkalicznym środowisku przez godz. Następnie przeprowadzano etapy rozwijania (40 min) oraz elektroforezy (30 min, 25 V, 300 mA, 0,5–1 V/cm) w 4^oC. Następnie preparaty zanurzano na 15 min w płynie neutralizującym. Kolejnym krokiem było suszenie preparatów przez zanurzanie na 10 min w etanolu. Preparaty barwiono DAPI i analizowano przy pomocy mikroskopu fluoroscencyjnego z filtrem dla DAPI, sprzężonego z kamerą i systemem komputerowym do analizy obrazu. W każdym żelu mierzono długość 50 komet. Do oceny wyników zastosowano test U Manna Whitney’a, przy poziomie istotności p=0,05.

Test apoptozy – barwienie anexyną zastosowano dla potwierdzenia aktywności leku w komórkach.



Test apoptozy – barwienie
anexin-V-fluos


Przebadano próby krwi od 5 zdrowych dawców. Izolowano limfocyty, a następnie inkubowano je przez 24 godz. z medium hodowlanym. Po tym czasie dodawano badanych substancji wg schematu podanego dla comet assay, ekspozycję prowadzono przez 24 godz. w 37^oC. Następnie próby wirowano, a do osadu limfocytów dodawano mieszaninę barwiącą, zawierająca jodek propidyny (Sigma Aldrich) i anein-V-fluos (Roche Applied Sciences), inkubowano w ciemności przez 15 min, po czym nakładano na zwilżone szkiełka mikroskopowe i poddawano analizie mikroskopowej. Stosowano system jak dla comet assay, ale z filtrami do FITC i PI. Z każdego preparatu zliczano po 1 000 komórek, dzieląc je na frakcje apoptotyczną, nekrotyczną oraz natywną. Do analizy statystycznej użyto testu C-kwadrat.



WYNIKI


W teście comet assay nie stwierdzono, aby paklitaksel powodował uszkodzenia DNA jądrowego komórek (ryc. 1.). Niewielkie różnice wysokości median dla poszczególnych prób w porównaniu z próbą zerową nie osiągnęły progu istotności statystycznej:
- próba olejowa: próba zerowa; poziom p=0,42,
- próba etanolowa: próba zerowa; poziom p=0,53,
- próba taxolowa: próba zerowa; poziom p=0,5,
- próba taxolowo-olejowa: próba zerowa; poziom p=0,3.

Również porównanie próby taxolowej z próbą taxolowo-etanolową nie wykazało różnicy istotnej statystycznie (p=0,7).
W przypadku trzech dawców uzyskano wyższe wyniki dla kontroli niż dla prób eksponowanych.
Test apoptozy pozwolił stwierdzić, iż te same stężenia paklitakselu powodują wzrost liczby komórek apoptotycznych o średnio 20 proc. w stosunku do prób kontrolnych (tab. 2. i ryc. 2.), co dowodzi aktywności biologicznej stosowanego preparatu paklitaksel.




DYSKUSJA


Otrzymane wyniki pozwalają stwierdzić, iż w przypadku stosowania leku zawierającego paklitaksel nie powinien występować paradoks Haddowa, polegający na tym, iż na skutek uszkodzeń DNA powstających w komórkach somatycznych występuje zwiększone ryzyko rozwoju wtórnego nowotworu. Wyniki otrzymane w comet assay tej serii doświadczeń są zbieżne z danymi literaturowymi [9], w których stwierdza się, że w stężeniach takich, jak stosowane w tym eksperymencie, nie następuje uszkodzenie DNA komórki; zaznaczyć należy, iż stosowane stężenia paklitakselu odpowiadały stężeniom terapeutycznym. Oznacza to jednocześnie, że bezpośredni kontakt z komórkami docelowymi wyklucza rozproszenie leku, co ma miejsce w organizmie, co z kolei oznacza osiągnięcie stężeń wyższych niż terapeutyczne. Jednocześnie pozytywny wynik testu apoptozy potwierdza biologiczną aktywność preparatu. Ponadto seria doświadczeń nad indukcją apoptozy sugeruje, iż paklitaksel jest aktywny w komórkach zarówno w obecności oleju, jak i bez niego, dane te również są potwierdzane przez literaturę [10].

Można zatem wyciągnąć wniosek, iż paklitaksel nie działa w komórkach spoczynkowych (niedzielących się) i jest związkiem bezpiecznym. Mimo iż otrzymane wyniki są tak jednoznaczne, wydaje się, że konieczne są poszerzone badania.


PIŚMIENNICTWO


1. Pawlicki M, Rolski J. Nowe farmakologiczne możliwości leczenia raka piersi. Wsp Onk 2002; 6; 9: 586-96.
2. Kloower JS, den Bakker MA, van Meerbeeck JP. Fatal outcome of hyprsensitivity reaction to paclitaxel; a case raport. Wsp Onk 2002; 8: 486-9.
3. Specht L, Larsen SK, Hansen HS. Phase II study of docetaxel and cisplatin in patients with recurrent or disseminated
squamous-cell carcinoma of head and neck. Ann Oncol 2000; 11 (7): 845-9.
4. Litwinuk M, Łojko A, Mądry R i wsp. Częstość występowania i profilaktyka reakcji nadwrażliwości na taksany. Wsp Onk 2002; 9: 602-6.
5. Schrijvers D, Vermorken JB. Role of taxoids in head and neck cancer. The Oncologist 2000; 5: 199-208.
6. Colveas AD, Posner MR. Docetaxel in head and neck cancer: a review. Am J Clin Oncol 1998: 21 (5): 482-6.
7. Pulkkinen JO, Pekkola-Heino K, Grenman R. Paclitaxel and irradiation induce apoptosis in squamous cell carcinoma cell lines in an additive way. Anticancer Res 1996; 16 (15A): 2923-9.
8. Humerickhouse R, Brockstein B, Vokes EE. The role of paclitaxel in the treatment of head and neck cancer. Akt Oncol 1999; 102: 103-10.
9. Digue L, Orsiere T, De Meo M, et al. Evaluation of the genotoxic activity of paclitaxel by the in vitro micronucleus test in combination with fluorescent in situ hybridizatin of a DNA centomeric probe and the alkaline single cell gel electrophoresis technique (comet assay) in human
T-lymphocytes. Environ Mol Mutagen 1999; 34 (4): 269-78.
10. Engblom P, Pulkkinen JO, Rantanen V, et al. Effects of paclitaxel with or without cremophor EL on cellular clonogenic survival and apoptosis. Eur J Cancer 1999; 35 (2): 284-8.


ADRES DO KORESPONDENCJI


Karolina Maria Górecka
Instytut Genetyki Człowieka PAN
ul. Strzeszyńska 32
60-479 Poznań
tel. 0 (prefiks) 61 823 30 11
e-mail:kmgorecka@o2.pl