Clinical significance of the apoptotic index in non-small cell lung cancer

Apoptoza jest fizjologiczną formą śmierci komórki, podczas której eliminowane są zużyte lub uszkodzone komórki. Proces ten, poprzez regulację liczby komórek, jest niezwykle istotny w utrzymaniu homeostazy tkankowej oraz poprzez usuwanie potencjalnie niebezpiecznych komórek (w tym komórek nowotworowych czy komórek zainfekowanych przez wirusy) w zwalczaniu wielu chorób [1]. Apoptoza nazywana jest również programowaną śmiercią komórki, ponieważ jej wystąpienie jest ściśle uwarunkowane genetycznie.

W regulację apoptozy zaangażowanych jest wiele genów, szczególnie zaś gen P53, BCL2 oraz BAX. Białko p53 wraz z zależnym od siebie białkiem bax aktywuje apoptozę, natomiast białko bcl-2 hamuje proces samobójczej śmierci komórki [1]. Zasadnicza funkcja P53 wiąże się z zapobieganiem przekazywania zaburzeń genetycznych komórkom potomnym przez wydłużenie fazy G₁ cyklu komórkowego, co umożliwia naprawę uszkodzonych fragmentów nici DNA. Jeśli uszkodzenie materiału genetycznego jest zbyt duże, gen ten uruchamia proces apoptozy [2]. Mutacje genu P53 mogą powodować z jednej strony możliwość przekazywania komórkom potomnym uszkodzonych fragmentów DNA oraz z drugiej – umożliwiają powstanie komórki nieśmiertelnej [3]. Istnieją dwie formy białka p53. Pierwszą z nich jest białko zdrowe, określane najczęściej jako dzikie (wild-type p53). Drugą formą jest białko powstające na drodze mutacji genu P53, które jest pozbawione swojej funkcji supresorowej i określane jako białko zmutowane (mutant-type p53). Poza mutacjami genu P53, przyczyną unieczynnienia białka p53 może być tworzenie nieaktywnych kompleksów z innymi białkami, np. z białkiem mdm2 [4–9]. Do utraty funkcji supresorowej może dojść także w wyniku przeniesienia białka p53 z jądra komórkowego do cytoplazmy oraz wskutek jego degradacji pod wpływem niektórych wirusów [7, 10, 11]. Mutacje genu P53 typu missense powodują stabilizację białka p53 i jego gromadzenie w jądrze komórkowym [12, 13]. Dzikie białko p53 charakteryzuje się bardzo krótkim okresem półtrwania. Z tego powodu w badaniach immunohistochemicznych nie stwierdza się jego obecności, podczas gdy białko zmutowane (mt-p53), w związku z wydłużonym okresem półtrwania jest wykrywane za pomocą tej metody [13].

Dzięki interakcji pomiędzy białkami mdm2-pRb istnieje ścisła zależność pomiędzy dwoma genami supresorowymi P53 i RB w regulacji apoptozy indukowanej przez białko p53 [14]. Sugeruje się, że gen RB pełni rolę genu antyapoptotycznego, ponieważ utrata jego funkcji w komórkach, które posiadają zdrowy gen P53, powoduje aktywację apoptozy [15]. p53-zależne pobudzenie białka p21^WAF1/CIP1 po uszkodzeniu DNA powoduje zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie G₁, natomiast nie pobudza apoptozy [16]. W badaniach in vitro wykazano, że białko p21^WAF1/CIP1 hamuje apoptozę [17]. Zaburzenia dotyczące każdego z powyższych białek wpływa niezależnie na proces apoptozy, upośledzając w ten sposób naturalne mechanizmy ochronne organizmu (ryc. 1.).

Aktywacja genów kontrolujących apoptozę może następować pod wpływem czynników wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych (ryc. 2.). Prawidłowa regulacja umożliwia utrzymanie równowagi pomiędzy namnażaniem się komórek oraz ich obumieraniem. Zaburzenia procesu apoptozy występują w szeregu schorzeń, m.in. w chorobie Alzheimera, chorobie Parkinsona, zakażeniu wirusem HIV, chorobach autoimmunologicznych czy chorobach rozrostowych [1, 18].

Proces apoptozy składa się z trzech kolejno następujących po sobie faz, obejmujących inicjację, fazę efektorową oraz degradację. Podczas inicjacji komórka otrzymuje sygnał zaczynający proces programowanej śmierci komórki, podczas fazy efektorowej dochodzi m.in. do depolaryzacji błony mitochondrialnej, w fazie tej proces jest jeszcze odwracalny. Po osiągnięciu tzw. punktu bez odwrotu, komórka ulega destrukcji [19, 20].
Poza apoptozą, śmierć komórki może przebiegać na drodze drugiego alternatywnego mechanizmu – nekrozy. Martwica jest procesem patologicznym i różni się zasadniczo od apoptozy. Podstawowe rozbieżności dotyczą etiologii martwicy, ponieważ jest ona zawsze związana z poważnym chemicznym lub fizycznym uszkodzeniem komórek poprzez działanie czynników zewnętrznych, takich jak urazy, niedotlenienie czy zatrucia. Martwica dotyczy większej liczby komórek oraz wywołuje odczyn zapalny w otaczających tkankach. Apoptoza dotyczy pojedynczych komórek, które nie tracą integralności błon komórkowych, a co za tym idzie, nie powodują odczynu zapalnego [21, 22].
Podczas procesu apoptozy dochodzi do obkurczania się jądra komórkowego, kondensacji chromatyny jądrowej oraz powstania ciałek apoptotycznych, zawierających zagęszczoną chromatynę oraz niezmienione organella komórkowe. Ciałka te są fagocytowane przez sąsiednie komórki tej samej tkanki lub przez komórki żerne. Charakterystyczne zmiany morfologiczne podczas procesu apoptozy są wynikiem fragmentacji chromatyny w wyniku aktywacji endonukleaz. Enzymy te tną nić DNA na fragmenty początkowo o wielkości od ok. 300 do 50 tysięcy par zasad (które prawdopodobnie odpowiadają domenom chromatyny), a następnie na mniejsze fragmenty od 180 do 200 par zasad [21].
Morfologiczne cechy apoptozy (zmniejszenie objętości komórki, kondensacja chromatyny jądrowej, fragmentację jądra, a nawet całej komórki na mniejsze ciałka apoptotyczne) można rozpoznać w mikroskopie elektronowym. Większe fragmenty DNA (od ok. 300 do 50 tys. par zasad) można uwidocznić stosując elektroforezę pulsacyjną, natomiast mniejsze (od 180 do 200 par zasad) można wykazać za pomocą elektroforezy DNA na żelu agarozowym. Dodatkowo mniejsze fragmenty DNA mają wolne końce 3’-OH, które można wykryć za pomocą technik immunocytochemicznych (in situ nic-end labeling). Najczęściej stosuje się metodę polegającą na przyłączeniu znakowanych nukleotydów do końców 3’-OH fragmentów DNA (reakcja TUNEL – TdT-mediated deoxyuridine triphosphate biotin/digoxygenin nick end-labeling) [21, 22].

Apoptoza komórek nowotworowych w niedrobnokomórkowym raku płuca (NDKRP) najczęściej oceniana była przy użyciu techniki TUNEL [4, 23–30]. Metoda ta pozwala na wykrycie komórek z typowymi cechami apoptozy, także tych we wczesnych stadiach samobójczej śmierci komórki, które nie wykazują jeszcze widocznych zmian morfologicznych [31]. Ze względu na możliwość fałszywie dodatnich reakcji, związanych z obecnością komórek martwiczych, oznaczenie apoptozy za pomocą techniki TUNEL nie jest pozbawione ograniczeń [32]. Aby wykluczyć martwicę, ocenę apoptozy należy przeprowadzić z równoczesną oceną tego samego skrawka guza barwionego hematoksyliną-eozyną [26, 28–31]. Z drugiej strony – przedłużony okres utrwalania tkanek w formalinie może spowodować fałszywie ujemny wynik reakcji TUNEL [33], dlatego część autorów wykluczyła z analizy przypadki, w których podczas barwienia nie stwierdzono ani jednej komórki apoptotycznej [27].

W większości opracowań dotyczących NDKRP, występowanie komórek apoptotycznych wyrażono za pomocą wskaźnika apoptotycznego (WA, Apoptotic Index – AI), określającego łączną liczbę komórek apoptotycznych występujących wśród 1 000 komórek nowotworowych [4, 23–31]. W pracach tych średnia wartość WA dla całej grupy wynosiła 11–23, natomiast mediana kształtowała się w zakresie od 8 do 15 [23, 25–27, 29–31, 34].
Pomimo tego samego sposobu oznaczania występowania komórek apoptotycznych w poszczególnych pracach dotyczących NDKRP, istnieją również pewne czynniki utrudniające wspólną analizę wyników przedstawionych przez różnych autorów. Trudności te dotyczą faktu różnego podziału chorych na podgrupy podczas analizy statystycznej. Część autorów posługuje się podziałem opartym na medianie oraz dolnym i górnym kwartylu [27, 29, 31], inni natomiast dzielą badaną grupę jedynie na dwie podgrupy, opierając podział na średniej wartości WA [26, 34, 35]. W niektórych pracach podział na dwie podgrupy wynika z małej liczebności badanej grupy [34]. Wydaje się jednak, że podział chorych na podstawie mediany oraz dolnego i górnego kwartyla, jest podziałem lepszym, umożliwiającym dokładniejszą analizę, jakkolwiek wymagającym również większej liczebnie grupy.

Równowaga pomiędzy proliferacją komórkową a apoptozą oceniana była w wielu nowotworach złośliwych [23, 27, 31]. Sugeruje się, że rozrost guza nowotworowego może wynikać ze zwiększonej proliferacji, zahamowania apoptozy lub z obu przyczyn łącznie [27]. W pracach dotyczących chłoniaków złośliwych, nowotworów złośliwych jelita grubego czy piersi, stwierdzono silny związek pomiędzy nasileniem apoptozy a zwiększeniem różnych wskaźników proliferacji komórkowej [36–38]. W NDKRP stwierdzono również zależność pomiędzy WA a wskaźnikiem mitotycznym [25, 35] oraz ekspresją białka PCNA [25, 31].
W jednej z najciekawszych prac, oceniających łącznie WA oraz W PCNA w komórkach NDKRP, chorych podzielono na podstawie mediany oraz dolnego i górnego kwartyla na cztery podgrupy, o bardzo niskim, niskim, wysokim i bardzo wysokim WA [29]. Autorzy tej pracy sugerowali ścisły związek pomiędzy apoptozą a proliferacją komórek NDKRP, ponieważ w badaniu tym wzrostowi WA towarzyszył wzrost średniego wskaźnika proliferacji [29]. W kolejnej pracy tych samych autorów sugerowano, że zwiększony odsetek komórek apoptotycznych może być skutkiem aktywacji proliferacji komórkowej, ale tylko przy zachowanych prawidłowo działających mechanizmach pobudzających apoptozę, tj. w przypadku obecności dzikiego białka p53 [31]. Tanaka i wsp. [29] nie potwierdzili wcześniejszych obserwacji Puglisiego i wsp. oraz Tormanena i wsp. [23, 27] o braku zależności pomiędzy markerami proliferacji i apoptozy w komórkach NDKRP.

W części prac analizowano zależność pomiędzy wysokością WA a obecnością innych parametrów, uczestniczących w regulacji cyklu komórkowego (m.in. białka p53, pRb, mdm2, czy p21^WAF1/CIP1). Brak zależności pomiędzy WA a akumulacją białka p53 [23, 27, 29, 35] oraz WA a nagromadzeniem białka p21^WAF1/CIP1 [39] stwierdzono w niektórych badaniach dotyczących NDKRP. W badaniach własnych naszego zespołu stwierdzono zależność pomiędzy niskim WA a obecnością białka mdm2 [34]. Obserwacja ta mogłaby mieć uzasadnienie teoretyczne, ponieważ białko mdm2 poprzez wpływ na białko p53 pozostaje inhibitorem apoptozy [7, 9]. Wielu autorów wysuwa hipotezę o współgrze fenotypów (the gain of function) pomiędzy białkiem mdm2 i białkiem p53. Białka te tworzą pętlę sprzężenia zwrotnego, w której p53 pobudza białko mdm2, natomiast białko mdm2 hamuje aktywność białka p53 [7]. Identyfikacja interakcji pomiędzy białkiem mdm2 a pRb ustaliła ścisły związek pomiędzy dwoma najlepiej poznanymi genami supresorowymi RB oraz P53 [40]. Ostatnie badania potrójnego kompleksu białkowego pRb-
-mdm2-p53 potwierdziły, że oba geny supresorowe uczestniczą w regulacji apoptozy, indukowanej przez gen P53 [14]. Białko pRb hamując białko mdm2, powoduje zwiększenie ilości białka p53 w komórce i przez to indukcję apoptozy [14, 41].

Podczas oceny zależności pomiędzy WA a cechami demograficznymi i klinicznymi chorych na NDKRP, niektórzy autorzy wykazali częstsze występowanie wyższego WA w raku płaskonabłonkowym [26, 27], inni natomiast w gruczolakorakach [23]. W jednej z prac stwierdzono, że komórki NDKRP o średnim lub niskim stopniu zróżnicowania charakteryzowały się wyższym WA [31]. W badaniach własnych naszego zespołu nie wykazano żadnego związku pomiędzy wysokością WA a cechami klinicznymi chorych na NDKRP [34].

We współczesnej literaturze rokownicze znaczenie WA u chorych na NDKRP pozostaje przedmiotem kontrowersji. W części prac zwiększony odsetek komórek apoptotycznych korelował z gorszym [23, 24, 34] lub lepszym rokowaniem [4, 25], podczas gdy w innych pracach nie wykazano jego wpływu na przeżycie [26, 27]. W jednym z badań gorsze rokowanie obserwowano u chorych z pośrednim wskaźnikiem apoptotycznym w porównaniu do chorych z najwyższym i najniższym WA [29] (tab. 1.). Rozbieżności w rokowniczym znaczeniu WA wydają się być zaskakujące, ponieważ większość powyższych badań została przeprowadzona w podobnej populacji chorych na NDKRP, którzy zostali poddani radykalnemu zabiegowi chirurgicznemu w stopniu zaawansowania klinicznego poniżej III A [26, 27, 42].
Na podstawie obserwacji wielu autorów wysunięto hipotezę sugerującą, że wyższy WA, korelujący z gorszym rokowaniem w grupie chorych na NDKRP może być konsekwencją nie tylko aktywacji mechanizmów obronnych komórki, ale także wyrazem zwiększonej proliferacji komórek nowotworowych [23, 24, 27, 29, 31, 34]. Podczas łącznej oceny wartości rokowniczej WA i W PCNA, wykazano, że najgorzej rokowali chorzy, u których stwierdzono fenotyp o najniższym WA oraz najwyższym W PCNA [27]. Obserwacja ta potwierdza hipotezę o znaczeniu proporcji pomiędzy namnażaniem się komórek a ich obumieraniem, oraz o konieczności łącznej analizy wartości rokowniczej WA oraz W PCNA [27, 31].

Interesujące wyniki uzyskano w pracy Tanaki i wsp., gdzie po podziale chorych na cztery podgrupy, grupa z najniższym oraz najwyższym WA rokowała lepiej, podczas gdy grupa z pośrednim WA rokowała gorzej [29]. W pracy tej stwierdzono, ze lepsze rokowanie w podgrupie chorych z najniższym wskaźnikiem apoptotycznym wynikało z faktu niskiej aktywności proliferacyjnej u tych chorych, natomiast w grupie z pośrednim WA gorsze rokowanie wiązało się ze zwiększoną proliferacją komórkową. W grupie chorych z najwyższym WA, którzy również mieli dłuższe przeżycie, dobre rokowanie wynikało z faktu, że apoptoza przewyższała namnażanie się komórek [29].

Podsumowując powyższe rozważania wydaje się, że kliniczne znaczenie odsetka komórek nowotworowych w guzie, które uległy apoptozie, pozostaje w niedrobnokomórkowym raku płuca zagadnieniem nierozstrzygniętym [4, 23–25, 27]. Apoptoza komórek nowotworowych może odgrywać istotne znaczenie w procesie terapeutycznym, ponieważ komórki nowotworowe poza apoptozą spontaniczną mogą ulegać apoptozie indukowanej przez leki przeciwnowotworowe. Z drugiej strony – zaburzenia procesu apoptozy mogą w niektórych przypadkach powodować oporność komórek nowotworowych na stosowane leczenie [1]. Ustalenie rokowniczego znaczenia wskaźnika apoptotycznego w raku płuca, który pozostaje najczęstszym nowotworem złośliwym, wydaje się być szczególnie istotne nie tylko z naukowego, ale również z klinicznego punktu widzenia.
Piśmiennictwo
1. Gerl R, Vaux DL. Apoptosis in the development and treatment of cancer. Carcinogenesis 2005; 26: 263-70.
2. Levine AJ. p53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell 1997; 88: 323-31.
3. Martin K, Trouche D, Hagemeier C, Sorensen TS, La Thangue NB, Kouzarides T. Stimulation of E2F1/DP1 transcriptional activity by MDM2 oncoprotein. Nature 1995; 375: 691-4.
4. Macluskey M, Baillie R, Chandrachud LM, Pendleton N, Schor AM. High levels of apoptosis are associated with improved survival in non-small cell lung cancer. Anticancer Res 2000; 20: 2123-8.
5. Momand J, Jung D, Wilczynski S, Niland J. The MDM2 gene amplification database. Nucleic Acids Res 1998; 26: 3453-9.
6. Momand J, Zambetti GP. Analysis of the proportion of p53 bound to mdm-2 in cells with defined growth characteristics. Oncogene 1996; 12: 2279-89.
7. Momand J, Zambetti GP. Mdm-2: ”big brother” of p53. J Cell Biochem 1997; 64: 343-52.
8. Momand J, Zambetti GP, Olson DC, George D, Levine AJ. The mdm-2 oncogene product forms a complex with the p53 protein and inhibits p53-mediated transactivation. Cell 1992; 69: 1237-45.
9. Piette J, Neel H, Marechal V. Mdm2: keeping p53 under control. Oncogene 1997; 15: 1001-10.
10. Graziano SL. Non-small cell lung cancer: clinical value of new biological predictors. Lung Cancer 1997; 17 Suppl 1: S37-58.
11. Prives C, Hall PA. The p53 pathway. J Pathol 1999; 187: 112-26.
12. Gorgoulis VG, Zoumpourlis V, Rassidakis GZ, Karameris A, Rassidakis AN, Spandidos DA, Kittas C. A molecular and immunohistochemical study of the MDM2 protein isoforms and p53 gene product in bronchogenic carcinoma. J Pathol 1996; 180: 129-37.
13. Greenblatt MS, Bennett WP, Hollstein M, Harris CC. Mutations in the p53 tumor suppressor gene: clues to cancer etiology and molecular pathogenesis. Cancer Res 1994; 54: 4855-78.
14. Yap DB, Hsieh JK, Chan FS, Lu X. mdm2: a bridge over the two tumour suppressors, p53 and Rb. Oncogene 1999; 18: 7681-9.
15. Sherr CJ. Cancer cell cycles. Science 1996; 274: 1672-7.
16. el-Deiry WS, Tokino T, Velculescu VE, et al. WAF1, a potential mediator of p53 tumor suppression. Cell 1993; 75: 817-25.
17. Roninson IB. Oncogenic functions of tumour suppressor p21 (Waf1/Cip1/Sdi1): association with cell senescence and tumour-promoting activities of stromal fibroblasts. Cancer Lett 2002; 179: 1-14.
18. Bell JE. The neuropathology of adult HIV infection. Rev Neurol (Paris) 1998; 154: 816-29.
19. Kroemer G. The proto-oncogene Bcl-2 and its role in regulating apoptosis. Nat Med 1997; 3: 614-20.
20. Kroemer G, Zamzami N, Susin SA. Mitochondrial control of apoptosis. Immunol Today 1997; 18: 44-51.
21. Zabel M. Immunocytochemia. PWN, Warszawa 1999.
22. Ito Y, Otsuki Y. Localization of apoptotic cells in the human epidermis by an in situ DNA nick end-labeling method using confocal reflectant laser microscopy. J Histochem Cytochem 1998; 46: 783-6.
23. Tormanen U, Eerola AK, Rainio P, et al. Enhanced apoptosis predicts shortened survival in non-small cell lung carcinoma. Cancer Res 1995; 55: 5595-602.
24. Langendijk H, Thunnissen E, Arends JW, et al. Cell proliferation and apoptosis in stage III inoperable non-small cell lung carcinoma treated by radiotherapy. Radiother Oncol 2000; 56: 197-207.
25. Matturri L, Colombo B, Lavezzi AM. Evidence for apoptosis in non-small cell lung carcinoma. Relationship with cell kinetics and prognosis. Anal Quant Cytol Histol 1999; 21: 240-4.
26. Hanaoka T, Nakayama J, Haniuda M, Sato TA. Immunohistochemical demonstration of apoptosis-regulated proteins, Bcl-2 and Bax, in resected non-small-cell lung cancers. Int J Clin Oncol 2002; 7: 152-8.
27. Puglisi F, Minisini AM, Aprile G, et al. Balance between cell division and cell death as predictor of survival in patients with non-small-cell lung cancer. Oncology 2002; 63: 76-83.
28. Takata T, Tanaka F, Yamada T, et al. Clinical significance of caspase-3 expression in pathologic-stage I, non-small-cell lung cancer. Int J Cancer 2001; 96 Suppl: 54-60.
29. Tanaka F, Kawano Y, Li M, et al. Prognostic significance of apoptotic index in completely resected non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol 1999; 17: 2728-36.
30. Tanaka F, Otake Y, Yanagihara K, et al. Apoptosis and p53 status predict the efficacy of postoperative administration of UFT in non-small cell lung cancer. Br J Cancer 2001; 84: 263-9.
31. Tanaka F, Takata T, Yamada T, et al. Apoptotic tumor-cell death in response to cell proliferation is influenced by p53 status in resected non-small cell lung cancer. Lung Cancer 2002; 36: 27-32.
32. Pulkkanen KJ, Laukkanen MO, Naarala J, Yla-Herttuala S. False-positive apoptosis signal in mouse kidney and liver detected with TUNEL assay. Apoptosis 2000; 5: 329-33.
33. Davison FD, Groves M, Scaravilli F. The effects of formalin fixation on the detection of apoptosis in human brain by in situ end-labelling of DNA. Histochem J 1995; 27: 983-8.
34. Dworakowska D, Jassem E, Jassem J, et al. Clinical significance of apoptotic index in non-small cell lung cancer: correlation with p53, mdm2, pRb and p21WAF1/CIP1 protein expression. J Cancer Res Clin Oncol 2005; in press.
35. O’Neill AJ, Staunton MJ, Gaffney EF. Apoptosis occurs independently of bcl-2 and p53 over-expression in non-small cell lung carcinoma. Histopathology 1996; 29: 45-50.
36. Kanavaros P, Bai M, Stefanaki K, Poussias G, Rontogianni D, Zioga E, Gorgoulis V, Agnantis NJ. Immunohistochemical expression of the p53, mdm2, p21/Waf-1, Rb, p16, Ki67, cyclin D1, cyclin A and cyclin B1 proteins and apoptotic index in T-cell lymphomas. Histol Histopathol 2001; 16: 377-86.
37. Tatebe S, Ishida M, Kasagi N, Tsujitani S, Kaibara N, Ito H. Apoptosis occurs more frequently in metastatic foci than in primary lesions of human colorectal carcinomas: analysis by terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling. Int J Cancer 1996; 65: 173-7.
38. Vakkala M, Lahteenmaki K, Raunio H, Paakko P, Soini Y. Apoptosis during breast carcinoma progression. Clin Cancer Res 1999; 5: 319-24.
39. Shoji T, Tanaka F, Takata T, et al. Clinical significance of p21 expression in non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol 2002; 20: 3865-71.
40. Xiao ZX, Chen J, Levine AJ, Modjtahedi N, Xing J, Sellers WR, Livingston DM. Interaction between the retinoblastoma protein and the oncoprotein MDM2. Nature 1995; 375: 694-8.
41. Hsieh JK, Chan FS, O’Connor DJ, Mittnacht S, Zhong S, Lu X. RB regulates the stability and the apoptotic function of p53 via MDM2. Mol Cell 1999; 3: 181-93.
42. Chen X, Bargonetti J, Prives C. p53, through p21 (WAF1/CIP1), induces cyclin D1 synthesis. Cancer Res 1995; 55: 4257-63.
Adres do korespondencji
dr med. Dorota Dworakowska
Klinika Chorób Wewnętrznych,
Endokrynologii i Zaburzeń Hemostazy
Akademia Medyczna
ul. Dębinki 7
80-211 Gdańsk
tel. +48 58 349 28 42
faks +48 58 349 29 41
e-mail: ddw@amg.gda.pl