Combined in vitro drug resistance profile in childhood acute lymphoblastic leukemia on diagnosis and at relapse – relation to cell cycle and gene rearrangements

Wstęp

W komórkach nowotworowych zachodzą procesy umożliwiające im przeżycie w obecności cytostatyku, czyli wytwarza się oporność na chemioterapię. Może ona być pierwotna lub nabyta. Z opornością pierwotną mamy do czynienia wtedy, gdy mechanizmy oporności działały zanim podano lek. Oporność nabyta rozwija się w trakcie chemioterapii [1]. Odpowiedź kliniczna na chemioterapię jest określona 3 czynnikami, tj. farmakokinetyką leku, odpowiedzią komórkową na lek oraz możliwościami odrostu pozostających komórek białaczkowych. Większość niepowodzeń terapeutycznych może być wyjaśniona opornością farmakokinetyczną, opornością komórkową i minimalną chorobą resztkową [2]. Oporność na cytostatyki jest zjawiskiem wieloczynnikowym nawet dla pojedynczego leku.
W chemioterapii skojarzonej ostrej białaczki limfoblastycznej stosuje się wiele leków. Efektem tego jest nakładanie się różnych mechanizmów. Badanie wrażliwości i oporności komórek nowotworowych na cytostatyki można przeprowadzić, badając mechanizmy oporności będące przyczyną oporności lub wykonując testy przeżycia komórek białaczkowych przez określenie ich wrażliwości na cytotoksyczne działanie leków przeciwbiałaczkowych.
Analogicznie, do określania antybiogramów oceniających wrażliwość bakterii na antybiotyki Pieters i wsp. wprowadzili w 1988 r. zmodyfikowany test MTT, opracowany przez Mosmanna w 1983 r. [3]. Niedługo potem wykazano, że profil oporności in vitro na cytostatyki ma bardzo silne znaczenie rokownicze w ALL [4], zwłaszcza na cytarabinę u niemowląt [5] oraz na prednizolon, winkrystynę i L-asparaginazę u dzieci starszych [6, 7]. W ostatnich latach wykazano, że skojarzony profil oporności na cytostatyki koreluje z profilem ekspresji genów [8, 9], jak również ma związek z polimorfizmem genowym w dziecięcej ALL [10, 11].
Celem pracy była ocena wrażliwości limfoblastów in vitro na cytostatyki u dzieci z ALL de novo i we wznowie w odniesieniu do wyników badań cyklu komórkowego i rearanżacji genów.

Materiał i metody

Badania przeprowadzono u 116 pacjentów w wieku 0,1–17,9 roku (mediana 5,4 roku) diagnozowanych i leczonych w jednym ośrodku, w tym u 106 pacjentów (60 chłopców, 46 dziewcząt) z ALL de novo i u 23 podczas wznowy ALL (11 chłopców, 12 dziewcząt); przy czym u 13 pacjentów badania przeprowadzono zarówno w momencie rozpoznania, jak i we wznowie.
Określono profil oporności in vitro na cytostatyki w teście MTT na 3–21 leków dla każdego pacjenta (tab. 1.) oraz skojarzony profil oporności na prednizolon, winkrystynę i L-asparaginazę (PVA).

Izolacja komórek jednojądrzastych

W momencie rozpoznania białaczki lub jej wznowy, szpik kostny pobierano na heparynę (15–20 U/ml szpiku kostnego). Limfoblasty izolowano na gradiencie stężeń (Gradisol L, Aqua Medica, Łódź), płukano 2-krotnie w RPMI-1640 (Sigma, St Louis, USA). Nadmiar erytrocytów usuwano w roztworze chlorku amonowego, powodując ich lizę. Wyizolowane komórki zawieszano w medium hodowlanym w stężeniu ok. 2,0 × 106 komórek/ml. Żywotność komórek oceniano barwieniem z 0,4% błękitem trypanu (Sigma); wszystkie próbki miały ponad 95-procentową żywotność. Jednocześnie wykonywano cytospiny, używając wirówki Sigma (typ 3-15, Sigma). Po barwieniu metodą May-Grunwald-Giemsa, morfologię komórek oceniano w mikroskopie świetlnym Nikon Eclipse E600.

Badania oporności in vitro na cytostatyki

Profil wrażliwości i oporności komórek białaczkowych określano testem cytotoksyczności z solami tetrazolowymi MTT. Zasada testu MTT opiera się na redukcji żółtego rozpuszczalnego bromku 3-(4,5-dimetyloltiazolo-2-ylo)-2,5-difenylo-tetrazolu (MTT) do nierozpuszczalnego błękitnego formazanu [12]. Reakcja ta przebiega jedynie w żywych komórkach, w ich mitochondriach. Ilość wytworzonego formazanu jest wprost proporcjonalna do liczby żywych (czyli opornych) komórek [13]. Po rozpuszczeniu formazanu przy użyciu izopropanolu mierzona absorbancja odpowiada liczbie żywych komórek.
Po izolacji i 2-krotnym płukaniu limfoblastów, ich stężenie dostosowywano do ok. 2 × 106/ml. Do mikropłytki titracyjnej 96-dołkowej (Profilab, Warszawa) dodawano po 80 ml zawiesiny komórkowej do każdego dołka. Do dołków tych dodano uprzednio po 20 ml roztworu badanych związków w znanych stężeniach. Wykonywano po 2 badania (tj. po 2 dołki) dla każdego stężenia. Dodatkowo, na każdej płytce przeprowadzano kontrolę pozytywną (komórki w medium, bez leków cytotoksycznych) oraz absorbancję stosowanych płynów (medium bez komórek i bez leków). Przygotowane panele inkubowano 92 godz. Odsetek komórek żywych oceniano jako reakcję kolorymetryczną po dodaniu 10 ml soli tetrazolowej bromku 3-(4,5-dimetylotiazolo-2-ylo)-2,5-difenylo tetrazolu (MTT, Sigma). Po dalszych 4 godz. inkubacji z MTT i po wytworzeniu kryształów formazanu przez żywe komórki (tj. komórki kontrolne oraz komórki oporne) rozpuszczano je w izopropanolu zakwaszonym przy użyciu 1N HCl. Ilość wytworzonego formazanu oznaczano, określając gęstość optyczną (ang. optical density – OD) przy zastosowaniu czytnika ELISA (Asys Hitech GmbH, Eugendorf, Austria) i oprogramowania DigiWin (Asys Hitech) dla 96-dołkowych płytek mikrotitracyjnych przy długości fali 550 nm i długości fali referencyjnej 720 nm, wykorzystując właściwości kolorymetryczne rozpuszczonego formazanu. Ponieważ wartość OD jest liniowo zależna od liczby żywych komórek [13, 14], % komórek żywych (ang. leukemic cell survival – LCS) dla danego stężenia cytostatyku wyliczano z równania:
LCS = [OD badanego stężenia cytostatyku – OD płynów]/ średnie OD dołków kontrolnych – OD płynów] × 100%.
Wyznaczano krzywą kalibracyjną dla badanych 6 stężeń cytostatyków. W końcowym etapie obliczano LC50 (lethal concentration for 50% of cells), tj. stężenie leku, w którym ginie 50% komórek białaczkowych wg następującego wzoru [15]:
LC50 = [(%LCS powyżej 50%) – 50]/[(% LCS powyżej 50%) – (% LCS poniżej 50%)] × [stężenie leku poniżej 50% LCS – stężenie leku powyżej 50% LCS] + [stężenie leku powyżej 50% LCS].
Wielkość ta jest miarą oporności badanych komórek na testowany lek, tj. im wyższa wartość LC50, tym stosunkowo bardziej oporne są komórki na dany lek (ryc. 1.).

Oporność względna

W celu porównania względnej oporności na testowany lek pomiędzy 2 badanymi grupami, zastosowano parametr względnej oporności (ang. relative resistance – RR), jako stosunek mediany wartości LC50 dla danego leku w jednej grupie do mediany wartości LC50 dla tego leku w drugiej grupie.

Kryteria skutecznego przeprowadzenia testu MTT

Zawiesina do badań w momencie rozpoczęcia testu zawierała co najmniej 90% limfoblastów. Po 4 dobach inkubacji kontrolne dołki zawierały co najmniej 70% komórek nowotworowych, a gęstość optyczna (OD) wynosiła co najmniej 0,050 [16, 17].

Skala PVA

Dla wszystkich pacjentów wyznaczono wartość skojarzonego profilu oporności na prednizolon, winkrystynę i L-asparaginazę, zgodnie z wartościami granicznymi przedstawionymi w tab. 2., odniesionymi do wartości percentylowych, uprzednio wyznaczonych dla dzieci populacji polskiej z ostrą białaczką limfoblastyczną [18]. Punktacja PVA jest sumą punktów odpowiadających oporności na te leki. Punktacja PVA przyjmuje wartości 3–9. Wartości 3–4 odpowiadają profilowi wrażliwemu, 5–7 profilowi pośredniemu i 8–9 profilowi opornemu. W przypadku sa moistnej apoptozy komórek białaczkowych w trakcie trwania testu, jako wartość PVA przyjęto 0.

Badania cytogenetyczne i molekularne

Indeks DNA (tj. stosunek zawartości DNA w badanych komórkach nowotworowych do zawartości DNA komórek prawidłowych) i fazy cyklu komórkowego G0/G1, S i G2/M wyznaczono metodą cytometrii przepływowej. Aktywność proliferacyjną wyznaczano jako odsetek komórek znajdujących się w fazie S i G2/M. Badania cytogenetyczne wykonano metodą prążkową. Badania molekularne w kierunku obecności transkryptów BCR-ABL, MLL-AF4 i TEL-AML1 wykonano metodami FISH i PCR.

Metody statystyczne

W celu porównania parametrów pomiędzy analizowanymi grupami stosowano testy nieparametryczne – test U Manna-Whitneya dla zmiennych niepowiązanych oraz test par Wilcoxona dla zmiennych powiązanych (ang. Wilcoxon matched-pair analysis).

Wyniki

Limfoblasty we wznowie wykazywały większą oporność na większość testowanych leków. Znamienność statystyczną wykazano dla prednizolonu (RR=10; p=0,0222), deksametazonu (RR>28,6; p=0,0272) i tioguaniny (RR=2,6; p=0,0049), natomiast trend do większej oporności stwierdzono w przypadku L-asparaginazy (RR=1,8; p=0,0958) i melfafanu (RR=1,7; p=0,0904) (tab. 3.). Skojarzony profil oporności in vitro na cytostatyki wykazywał większą oporność we wznowie ALL (mediana PVA 6 vs 5; p=0,0053) (ryc. 2.).
Wykonano również analizę sparowanych wyników MTT, tzn. badania, które wykonano w pierwszym rozpoznaniu i we wznowie dla danego pacjenta i dla danego leku. We wznowie stwierdzono nieznamiennie większą oporność na glikokortykoidy (prednizolon RR=3,1; deksametazon RR>2,5). Limfoblasty we wznowie wykazywały dobrą wrażliwość na cytarabinę (RR=0,5; p=0,0451) i kladrybinę (RR=0,1; p=0,0231).
W zależności od immunofenotypu w ALL de novo, limfoblasty T-ALL wykazywały większą oporność na wszystkie leki (prawdopodobnie z wyjątkiem tioguaniny), przy czym znamienność statystyczną stwierdzono dla winkrystyny, cytarabiny, fludarabiny i kladrybiny (tab. 4.).
Limfoblasty common-ALL we wznowie wykazywały większą oporność niż limfoblasty common-ALL de novo w stosunku do większości badanych leków. Znamienność statystyczną wykazano w stosunku do fludarabiny i tioguaniny. Trend do większej oporności we wznowie stwierdzono wobec prednizolonu, deksametazonu, melfalanu, cytarabiny i merkaptopuryny (tab. 4.). Ze względu na liczebność grupy T-ALL we wznowie (n=3) nie wykonano analizy wyników testu MTT we wznowie ALL w zależności od immunofenotypu.
Limfoblasty pacjentów z TEL-AML1 (n=9) miały większą wrażliwość, a limfoblasty pacjentów z BCR-ABL (n=3) lub z rearanżacją MLL (n=4) miały większą oporność na większość testowanych cytostatyków, jednak różnice nie osiągnęły znamienności statystycznej w większości przypadków. Nie stwierdzono związku pomiędzy parametrami cyklu komórkowego (hiperdiploidia, odsetek komórek w fazie S >6% i aktywność proliferacyjna >12%) i opornością in vitro na cytostatyki (tab. 5.).

Dyskusja

Odpowiedź na chemioterapię w ALL zależy od 3 czynników – ilości leku, która dotrze do komórek białaczkowych, efektu, jaki lek wywoła w komórce białaczkowej oraz po encjału wzrostowego komórek rezydualnych [4]. Dlatego niepowodzenia w terapii ALL są związane z opornością farmakologiczną, opornością komórkową i minimalną chorobą resztkową. W niniejszej pracy podjęto temat badań oporności komórkowej w ALL.
Zgodnie z przewidywaniami i wcześniejszymi wynikami [19, 20] oporność komórkowa limfoblastów in vitro na cytostatyki u pacjentów we wznowie ALL była większa niż u pacjentów w momencie pierwszego rozpoznania na większość testowanych leków. We wznowie ALL limfoblasty zachowywały jednak dobrą wrażliwość na cytarabinę i kladrybinę. Biorąc pod uwagę jedynie pacjentów z limfoblastami o fenotypie common-ALL, pacjenci we wznowie mieli limfoblasty bardziej oporne in vitro na większość testowanych cytostatyków niż pacjenci z ALL de novo. Analizując immunofenotyp limfoblastów wśród pacjentów z pierwszym rozpoznaniem, stwierdzono, że limfoblasty common-ALL pacjentów de novo były w większości przypadków bardziej wrażliwe niż limfoblasty T-ALL de novo (prawdopodobnie z wyjątkiem tioguaniny i ifosfamidu).
W drugiej części analizy oceniono wpływ najczęstszych ilościowych i strukturalnych aberracji cytogenetycznych występujących u dzieci z ALL oraz parametrów cyklu komórkowego na oporność in vitro na cytostatyki. W analizie uwzględniono korzystne aberracje występujące w limfoblastach, takie jak hiperdiploidia i rearanżacja TEL-AML1, oraz niekorzystne aberracje, jakimi są rearanżacje genów BCR-ABL i MLL.
Hiperdiploidia >50 chromosomów (ang. high hyperdiploidy) występuje w 25–30% przypadków ALL. Uważa się, że hiperdiploidia ma korzystną wartość rokowniczą w przypadku stwierdzenia potrójnej trisomii chromosomów 4, 10, 17 [21, 22]. Niewielka hiperdiploidia (45–50 chromosomów, ang. low hyperdiploidy), występuje w 6–15% przypadków ALL i nie ma znaczenia rokowniczego [23]. Z kolei hiperdiploidia bliska tetraploidii (82–92 chromosomów, ang. near tetraploidy) jest spotykana u ok. 1% dzieci, głównie w T-ALL i wiąże się z niekorzystnym rokowaniem [24]. Pseudodiploidia (46 chromosomów + aberracja strukturalna) stanowi heterogenną grupę o rokowaniu uzależnionym od typu aberracji i występuje u ok. 40% dzieci z ALL [25]. Hipodiploidia <45 chromosomów w komórce białaczkowej występuje u <1% dzieci, a rokowanie jest niekorzystne [26].
Indeks DNA (DI) to stosunek fluorescencji badanych komórek krwi obwodowej, szpiku lub płynu mózgowo-rdzeniowego do fluorescencji komórek standardowych, tj. o prawidłowej ilości DNA. Wartość indeksu DNA w prawidłowych komórkach wynosi 1 (komórki diploidalne). Wartość indeksu DNA jest czynnikiem rokowniczym w ALL u dzieci. Wartość DI ł1,16 jest zmianą korzystną, podczas gdy DI <0,95 jest niekorzystnym czynnikiem rokowniczym [27–30].
Wyróżnia się następujące fazy cyklu komórkowego:
• G0 – fazę spoczynkową, czyli fazę komórek nieuczestniczących w cyklu podziałowym,
• G1 – fazę poprzedzającą syntezę DNA,
• S – fazę syntezy DNA,
• G2 – fazę przedpodziałową,
• M – fazę podziału (mitozy).
Dzięki wyznaczeniu faz cyklu komórkowego określa się aktywność proliferacyjną jako sumę odsetka komórek w fazie syntezy (S) oraz fazie przedmitotycznej (G2) i mitozie (M). Istnieją dane sugerujące, że wielkość odsetka komórek w fazie S oraz aktywności proliferacyjnej koreluje z agresywnością choroby [29].
Pacjenci z hiperdiploidią limfoblastów wykazywali wrażliwość in vitro na większość badanych leków, a zwłaszcza na tiopuryny i cytarabinę. We wcześniejszych badaniach przeprowadzonych przez innych naukowców, obserwowano wrażliwość hiperdiploidalnych limfoblastów na antymetabolity [31].
TEL-AML1 jest najczęstszą aberracją chromosomową w dziecięcej ALL. Stwierdza się ją u 20–25% pacjentów, zazwyczaj w pre-B-ALL o fenotypie CD10+CD19+HLA-DR+ [32]. Charakteryzuje się dużą lekowrażliwością, a indeks DNA zwykle wynosi 1 [33, 34]. Fuzja onkogenu TEL/AML1 w ALL wiąże się z pomyślnym rokowaniem [33, 35]. Pacjenci z limfoblastami z rearanżacją genów TEL-AML1 wykazywali lepszą wrażliwość wobec L-asparaginazy, co potwierdza wyniki wcześniejszych badań [33].
Drugą analizowaną rearanżacją genową była fuzja BCR-ABL. Wykrywa się ją u 2–5% dzieci i 20–25% ludzi dorosłych chorych na ostrą białaczkę limfoblastyczną [35, 36]. Obecności tej rearanżacji najczęściej towarzyszy wysoka leukocytoza, fenotyp CD10+CD19+ i bardzo niekorzystne rokowanie [32, 37]. W prezentowanych badaniach nie wykazano większej oporności in vitro na cytostatyki w limfoblastach z tą rearanżacją. W jedynych opublikowanych dotychczas danych dotyczących wrażliwości in vitro limfoblastów BCR-ABL stwierdzono oporność na prednizolon u pacjentów dorosłych [38], co z kolei podkreśla zjawisko steroidooporności występujące w ALL u dorosłych [39, 40].
Kolejną niekorzystną translokacją w ALL, zwłaszcza u niemowląt, jest rearanżacja genu MLL. Zazwyczaj występuje w limfoblastach o fenotypie CD19+CD10-HLA-DR+, często towarzyszy jej koekspresja antygenów mieloidalnych CD13, CD15, CD33 [32]. W tej grupie chorych stwierdza się zazwyczaj wysoką leukocytozę, zajęcie ośrodkowego układu nerwowego i niekorzystne rokowanie [5, 37]. Chociaż niejednoznacznie, oporność in vitro na cytostatyki w tej grupie pacjentów była wyższa na większość testowanych leków, z wyjątkiem dobrej wrażliwości na cytarabinę i idarubicynę. W aktualnie stosowanych protokołach terapeutycznych u niemowląt z ALL, cytarabina jest jednym z podstawowych leków, co wynika z wcześniejszych badań [5].
Smets i wsp. [29] wykazali, że pacjenci z odsetkiem limfoblastów >6% w fazie S cyklu komórkowego mają gorsze rokowanie. W badaniach własnych autorów, w analizie wpływu parametrów cyklu komórkowego na oporność in vitro na cytostatyki stwierdzono, że pacjenci, których limfoblasty miały odsetek komórek w fazie S powyżej 6% lub wykazywały aktywność proliferacyjną powyżej 12%, charakteryzowali się nieznamienną opornością limfoblastów in vitro na większość testowanych cytostatyków, z wyjątkiem leków o działaniu alkilującym, takich jak cyklofosfamid, ifosfamid, melfalan czy tiotepa.
Podsumowując, oporność in vitro na cytostatyki w ALL u dzieci częściowo wyjaśnia znaczenie parametrów biologicznych limfoblastów.

Piśmiennictwo
1. Styczynski J, Wysocki M. Mechanisms of drug resistance in acute leukemias: therapeutic problem. Adv Clin Exp Med 2000; 9: 153-61.
2. Veerman AJ, Kaspers GJ, Pieters R. Cellular drug resistance in childhood leukemia. Ann Hematol 1994; 69 Suppl 1: S31-34.
3. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 1983; 65: 55-63.
4. Pieters R, Huismans DR, Loonen AH, Hahlen K, van der Does-van den Berg A, van Wering ER, Veerman AJ. Relation of cellular drug resistance to long-term clinical outcome in childhood acute lymphoblastic leukaemia. Lancet 1991; 338: 399-403.
5. Pieters R, den Boer ML, Durian M, Janka G, Schmiegelow K, Kaspers GJ, van Wering ER, Veerman AJ. Relation between age, immunophenotype and in vitro drug resistance in 395 children with acute lymphoblastic leukemia – implications for treatment of infants. Leukemia 1998; 12: 1344-8.
6. Den Boer ML, Harms DO, Pieters R, et al. Patient stratification based on prednisolone-vincristine-asparaginase resistance profiles in children with acute lymphoblastic leukemia. J Clin Oncol 2003; 21: 3262-8.
7. Styczynski J, Wysocki M. Is the in vitro drug resistance profile the strongest prognostic factor in childhood acute lymphoblastic leukemia? J Clin Oncol 2004; 22: 963-4.
8. Holleman A, Cheok MH, den Boer ML, et al. Gene-expression patterns in drug-resistant acute lymphoblastic leukemia cells and response to treatment. N Engl J Med 2004; 351: 533-42.
9. Lugthart S, Cheok MH, den Boer ML, et al. Identification of genes associated with chemotherapy crossresistance and treatment response in childhood acute lymphoblastic leukemia. Cancer Cell 2005; 7: 375-86.
10. Cheok MH, Evans WE. Acute lymphoblastic leukaemia: a model for the pharmacogenomics of cancer therapy. Nat Rev Cancer 2006; 6: 117-29.
11. Cheok MH, Lugthart S, Evans WE. Pharmacogenomics of acute leukemia. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2006; 46: 317-53.
12. Pieters R, Huismans DR, Leyva A, Veerman AJ. Adaptation of the rapid automated tetrazolium dye based (MTT) assay for chemosensitivity testing in childhood leukemia. Cancer Lett 1988; 41: 323-32.
13. Pieters R, Loonen AH, Huismans DR, Broekema GJ, Dirven MW, Heyenbrok MW, Hahlen K, Veerman AJ. In vitro drug sensitivity of cells from children with leukemia using the MTT assay with improved culture conditions. Blood 1990; 76: 2327-36.
14. Pieters R, Huismans DR, Leyva A, Veerman AJ. Comparison of the rapid automated MTT-assay with a dye exclusion assay for chemosensitivity testing in childhood leukaemia. Br J Cancer 1989; 59: 217-20.
15. Styczynski J, Wysocki M, Debski R, et al. Ex vivo drug resistance profile in childhood acute myelogenous leukemia: no drug is more effective in comparison to acute lymphoblastic leukemia. Leuk Lymphoma 2002; 43: 1843-8.
16. Styczyński J, Pieters R, Huismans D, Schuurhuis G, Veerman A, Wysocki M. Comparison of cellular drug resistance in acute lymphoblastic leukemia in children and in adults. Acta Haematol Pol 1999; 30: 283-90.
17. Styczyński J, Pieters R, Huismans D, Schuurhuis G, Veerman A, Wysocki M. Cellular drug resistance in fresh and cryopreserved lymphocytes and lymphoblasts. Acta Haematol Pol 1999; 30: 275-82.
18. Wysocki M, Styczynski J, Debski R, et al. Drug resistance profile in childhood acute lymphoblastic leukemia on diagnosis and at relapse with respect to percentile values. Report of Polish Pediatric Leukemia and Lymphoma Study Group. Acta Haematol Pol 2002; 33: 341-50.
19. Klumper E, Pieters R, Veerman AJ, et al. In vitro cellular drug resistance in children with relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia. Blood 1995; 86: 3861-8.
20. Kaspers GJ, Wijnands JJ, Hartmann R, et al. Immunophenotypic cell lineage and in vitro cellular drug resistance in childhood relapsed acute lymphoblastic leukaemia. Eur J Cancer 2005; 41: 1300-3.
21. Heerema NA, Sather HN, Sensel MG, et al. Prognostic impact of trisomies of chromosomes 10, 17, and 5 among children with acute lymphoblastic leukemia and high hyperdiploidy (> 50 chromosomes). J Clin Oncol 2000; 18: 1876-87.
22. Carroll WL, Bhojwani D, Min DJ, et al. Pediatric acute lymphoblastic leukemia. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2003; 102-31.
23. Forestier E, Johansson B, Borgstrom G, Kerndrup G, Johansson J, Heim S. Cytogenetic findings in a population-based series of 787 childhood acute lymphoblastic leukemias from the Nordic countries. The NOPHO Leukemia Cytogenetic Study Group. Eur J Haematol 2000; 64: 194-200.
24. Raimondi SC, Zhou Y, Shurtleff SA, Rubnitz JE, Pui CH, Behm FG. Near-triploidy and near-tetraploidy in childhood acute lymphoblastic leukemia: association with B-lineage blast cells carrying the ETV6-RUNX1 fusion, T-lineage immunophenotype, and favorable outcome. Cancer Genet Cytogenet 2006; 169: 50-7.
25. Uckun FM, Pallisgaard N, Hokland P, Navara C, Narla R, Gaynon PS, Sather H, Heerema N. Expression of TEL-AML1 fusion transcripts and response to induction therapy in standard risk acute lymphoblastic leukemia. Leuk Lymphoma 2001; 42: 41-56.
26. Kebriaei P, Anastasi J, Larson RA. Acute lymphoblastic leukaemia: diagnosis and classification. Best Pract Res Clin Haematol 2002; 15: 597-621.
27. Olah E, Balogh E, Kajtar P, Pajor L, Jakab Z, Kiss C. Diagnostic and prognostic significance of chromosome abnormalities in childhood acute lymphoblastic leukemia. Ann N Y Acad Sci 1997; 824: 8-27.
28. Forestier E, Holmgren G, Roos G. Flow cytometric DNA index and karyotype in childhood lymphoblastic leukemia. Anal Cell Pathol 1998; 17: 145-56.
29. Smets LA, Slater R, van Wering ER, van der Does-van den Berg A, Hart AA, Veerman AJ, Kamps WA. DNA index and % S-phase cells determined in acute lymphoblastic leukemia of children: a report from studies ALL V, ALL VI, and ALL VII (1979-1991) of the Dutch Childhood Leukemia Study Group and The Netherlands Workgroup on Cancer Genetics and Cytogenetics. Med Pediatr Oncol 1995; 25: 437-44.
30. Pui CH, Hancock ML, Head DR, Rivera GK, Look AT, Sandlund JT, Behm FG. Clinical significance of CD34 expression in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 1993; 82: 889-94.
31. Kaspers GJ, Smets LA, Pieters R, Van Zantwijk CH, Van Wering ER, Veerman AJ. Favorable prognosis of hyperdiploid common acute lymphoblastic leukemia may be explained by sensitivity to antimetabolites and other drugs: results of an in vitro study. Blood 1995; 85: 751-6.
32. Szczepanski T, van der Velden VH, van Dongen JJ. Classification systems for acute and chronic leukaemias. Best Pract Res Clin Haematol 2003; 16: 561-82
33. Ramakers-van Woerden NL, Pieters R, Loonen AH, et al. TEL/AML1 gene fusion is related to in vitro drug sensitivity for L-asparaginase in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 2000; 96: 1094-9.
34. Frost BM, Forestier E, Gustafsson G, et al. Translocation t (12; 21) is related to in vitro cellular drug sensitivity to doxorubicin and etoposide in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 2004; 104: 2452-7.
35. Pui CH, Relling MV, Downing JR. Acute lymphoblastic leukemia. N Engl J Med 2004; 350: 1535-48.
36. Styczyński J, Gil L. Ostra białaczka limfoblastyczna: różnice u dzieci i dorosłych. Acta Haematol Pol 2006; 37: 185-201.
37. ALL-IC-BFM: A Randomized Trial of the I-BFM-SG for the Management of Childhood non-B Acute Lymphoblastic Leukemia. Therapy Protocol Hannover 2002.
38. Ramakers-van Woerden NL, Pieters R, Hoelzer D, et al. In vitro drug resistance profile of Philadelphia positive acute lymphoblastic leukemia is heterogeneous and related to age: a report of the Dutch and German Leukemia Study Groups. Med Pediatr Oncol 2002; 38: 379-86.
39. Styczynski J, Pieters R, Huismans DR, Schuurhuis GJ, Wysocki M, Veerman AJ. In vitro drug resistance profiles of adult versus childhood acute lymphoblastic leukaemia. Br J Haematol 2000; 110: 813-8.
40. Styczynski J, Wysocki M. In vitro drug resistance profiles of adult acute lymphoblastic leukemia: possible explanation for difference in outcome to similar therapeutic regimens. Leuk Lymphoma 2002; 43: 301-7.

Adres do korespondencji
dr hab. med. Jan Styczyński
Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii
Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu
Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy
ul. M. Skłodowskiej-Curie 9
85-094 Bydgoszcz
tel. +48 52 585 48 60
faks +48 52 585 48 67
e-mail: jstyczynski@cm.umk.pl