Comparison of activity of three preparations of L-asparaginase in acute lymphoblastic and myeloblastic leukemia: the study of cytotoxicity and induction of apoptosis in cell lines

Wstęp
L-asparagina (amid kwasu 2-aminobursztynowego) jest aminokwasem endogennym, została wyodrębniona z soku asparagusa przez Vauquelina i Robigueta w 1806 r. jako pierwszy odkryty aminokwas występujący w przyrodzie [1]. Ponieważ obecność tego aminokwasu jest niezbędna do funkcjonowania niektórym komórkom nowotworowym, w szczególności limfoblastom, eliminacja L-asparaginy z otoczenia komórek nowotworowych prowadzi do zahamowania cyklu komórkowego w fazie G1, zahamowania syntezy DNA i białek, przerwania nici DNA i apoptozy, a w efekcie do śmierci komórki [2].
L-asparaginaza jest hydrolazą, enzymem katalizującym rozszczepienie
L-asparaginy na kwas asparaginowy i amoniak (ryc. 1.), występuje w wielu organizmach bakteryjnych, roślinnych i zwierzęcych, nie stwierdza się natomiast obecności tego enzymu u człowieka. Jako lek stanowi istotną część polichemioterapii stosowanej w przebiegu ostrej białaczki limfoblastycznej u dzieci i dorosłych oraz nieziarniczych chłoniaków złośliwych i mięsaka limfatycznego [2]. Ze względu na oporność komórkową, nie jest to lek stosowany w leczeniu białaczek mieloblastycznych. W terapii wykorzystuje się 2 naturalne formy enzymu, produkowane przez bakterie Escherichia coli i Erwinia chrysanthemi, a także pochodną L-asparaginazy E. coli związaną z glikolem polietylenowym (Peg-asparaginazę). Dostępnych jest kilka preparatów L-asparaginazy, które różnią się okresem półtrwania, enzymatyczną aktywnością i wynikającym z tego stopniem deplecji asparaginy.
Celem pracy była ocena cytotoksyczności trzech preparatów L-asparaginazy oraz ich wpływu na cykl komórkowy i wybrane mechanizmy, wpływające na indukcję apoptozy w liniach komórkowych ludzkich ostrych białaczek mieloblastycznych i limfoblastycznych.

Materiał i metody
Badany materiał stanowiły linie komórkowe: ostrej białaczki promielocytowej HL-60 (AML, typ M3 wg klasyfikacji FAB), kryzy erytroblastycznej przewlekłej białaczki mieloblastycznej K-562 (AML, typ M6) i ostrych białaczek limfoblastycznych T-komórkowych CCRF–CEM i Jurkat. Oceniano wpływ trzech preparatów L-asparaginazy: Asparaginase medac (E. coli-asparaginase, Medac, Hamburg), Erwinase (Erwinia L-asparaginase, Berkshire, England) i Kidrolase (E. coli-asparaginase, Bellon, Montrouge) na badane komórki. Cytotoksyczność oceniono testem MTT, natomiast badania cyklu komórkowego, zmiany w ekspresji kaspazy-3, indukcję wczesnej apoptozy oraz syntezę tlenku azotu wykonano metodą cytometrii przepływowej.
Na płytce 96-dołkowej przygotowano panel z roztworami poszczególnych cytostatyków o identycznych stężeniach i przechowywano je w temperaturze -20^oC. W trakcie badania do płytek z lekami dodawano badane komórki, po czym inkubowano je w środowisku 5-proc. CO₂ w temp. 37^oC przez 3 doby. Stężenia leków dla poszczególnych badań wynosiły: 0,0032–10 IU/ml w teście MTT; 0,4 IU/ml w analizie faz cyklu komórkowego; 10 IU/ml przy oznaczaniu aktywności kaspazy-3 oraz 2 IU/ml przy badaniu syntezy tlenku azotu. Początkowe stężenie badanych komórek w poszczególnych liniach komórkowych wynosiło 0,49–0,65 x 10⁶/ml.

Cytotoksyczność. Oporność in vitro badanych komórek na wybrane leki oceniano przy pomocy testu cytotoksyczności MTT wg metodyki wcześniej opisanej [3]. W skrócie, zasada testu opiera się na redukcji żółtego rozpuszczalnego bromku 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium (MTT, Serva, Heidelberg) do błękitnego formazanu. Reakcja ta przebiega jedynie w żywych komórkach. Test przeprowadzano na 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych, na które dodawano po 80 ml zawiesiny komórkowej do każdego dołka, do którego wcześniej podano 20 ml roztworu badanych preparatów L-asparaginazy. Dla każdego stężenia wykonywano po 2 badania (tj. przygotowano po 2 dołki). Niezależnie od badanych cytostatyków, na każdej płytce oznaczano kontrolę pozytywną (komórki w medium, bez leków) oraz absorbancję stosowanych płynów (medium bez komórek i bez leków). Przygotowane panele inkubowano 72 godz., a następnie do każdego dołka dodawano po 10 ml roztworu MTT. Żywe komórki powodowały powstanie błękitnego formazanu, który następnie rozpuszczano izopropanolem i mierzono gęstość optyczną (OD – optical density) przy użyciu czytnika mikropłytek ELISA (Asys Hitech GmbH, Eugendorf, Austria). Gęstość optyczna odpowiada ilości komórek, które przeżyły inkubację, czyli komórek kontrolnych oraz opornych. We wszystkich badaniach w teście MTT, skorygowana wartość OD wynosiła >0,050. Za miarę oporności przyjęto stężenie leku, w którym ginie 50 proc. badanych komórek (LC50 – lethal concentration to 50% cells).

Analiza faz cyklu komórkowego. Komórki barwiono jodkiem propidyny (Sigma-Aldrich, P4170, o stężeniu 20 µg/ml rozpuszczonym w buforze cytrynianowym i 2-proc. Tritonie X-100), a następnie analizowano w cytometrze przepływowym przy wykorzystaniu programu Multicycle (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA). W programie Multicycle, w cyklu komórkowym w pierwszej kolejności wyznaczany jest odsetek komórek znajdujących się w fazie apoptotycznej sub-G1, a następnie pozostałych faz, stąd odsetek komórek w fazach G1 + S + G2 = 100 proc. dla pojedynczego badania. Faza sub-G1 jest miernikiem późnej apoptozy komórek, faza G1 stanem spoczynkowym komórek, a fazy S i G2 wyrażają odsetek komórek znajdujących się w fazie proliferacji. Zwiększenie odsetka komórek w dowolnej fazie cyklu komórkowego pod wpływem stosowanego leku oznacza zahamowanie progresji cyklu w tej fazie. Następstwem zaburzenia prawidłowego przebiegu cyklu komórkowego jest apoptoza komórek.

Kaspaza-3. Końcową fazą apoptozy jest aktywacja kaskady proteaz zwanych kaspazami. Kaspaza-3 jest markerem komórek ulegających apoptozie. Badanie ekspresji tego białka przeprowadzano metodą cytometrii przepływowej przy użyciu zestawu Active Caspase–3 PE Mab Apoptosis Kit (Becton Dickinson Biosciences, Nr 550914). Aktywność kaspazy-3 jest proporcjonalna do fluorescencji ekspresji tego białka [4]. Zmiany aktywności kaspazy-3 korelują ze sobą w czasie, w związku z czym wystarczające są pomiary w jednym punkcie czasowym [4]. Kaspaza-3 jest markerem zarówno wewnątrz-, jak i zewnątrzpochodnego szlaku apoptotycznego, tj. drogi mitochondrialnej i receptorowej (cyt. wg Jia et al. [5]).
Ocena wczesnej apoptozy i syntezy tlenku azotu (NO). Wczesną apoptozę wyrażoną wiązaniem anneksyny V przez fosfatydyloserynę oraz produkcję tlenku azotu oznaczano metodą cytometrii przepływowej przy użyciu zestawu ApoAlert Nitric Oxide/Annexin V Dual Sensor Kit (Becton Dickinson Biosciences, Nr K2013-2). Tlenek azotu ma znaczenie w indukcji apoptozy i zahamowania wzrostu komórek nowotworowych, w wyniku produkcji endogennych reaktywnych związków azotu. Tlenek azotu powoduje apoptozę w komórkach Jurkat, mediowaną uwalnianiem cytochromu C z mitochondriów oraz aktywacją kaspazy-3 i kaspazy-9 [6].
Ekspresję kaspazy-3 oraz ocenę wiązania anneksyny-V i syntezy tlenku azotu wyznaczano używając parametru średniej intensywności fluorescencji (MFI – mean intensity of fluorescencje), zgodnie z zaleceniami brytyjskiego Imperial Cancer Research FundFACS Laboratory (http://lif.icnet.uk/axp/facs/davies/stats.html). Ocenę syntezy tlenku azotu i analizę faz cyklu komórkowego wykonywano przed rozpoczęciem inkubacji oraz po 2 dobach, natomiast test MTT i ekspresję kaspazy-3 analizowano po 3 dobach inkubacji badanych komórek z lekami.
Statystyka. Każde badanie wykonywano co najmniej
3-krotnie. Wyniki przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe. Różnice wartości średnich porównano testem t-Studenta. Zmianę wartości badanych parametrów indukcji apoptozy po zastosowaniu leku, oceniono testem par Wilcoxona. Korelację oceniono testem Pearsona. Znamienność statystyczną przyjęto dla wartości p<0,05.

Wyniki
Cytotoksyczność. Linie ostrej białaczki wykazywały relatywnie dobrą wrażliwość na wszystkie badane preparaty
L-asparaginazy. Linia K-562 była oporna na wszystkie testowane preparaty L-asparaginazy, aczkolwiek w najwyższych stężeniach L-asparaginaza powodowała cytotoksyczność ok. 34 proc. komórek tej linii. Natomiast linia HL-60 wykazywała wrażliwość na preparaty L-asparaginazy porównywalną z wrażliwością linii limfoblastycznych (tab. 1.).

Analiza faz cyklu komórkowego i zawartości DNA. Wszystkie 3 preparaty L-asparaginazy powodowały wzrost fazy apoptotycznej sub-G1 po 2 dobach inkubacji w liniach limfoblastycznych oraz w linii HL-60, natomiast nie wpływały na wielkość tej fazy w linii K-562. Preparaty L-asparaginazy nie wpływały istotnie na zahamowanie cyklu komórkowego we wszystkich badanych liniach. Zwraca jednak uwagę duża aktywność proapoptotyczna preparatu Erwinase w linii HL-60 (tab. 2.).

Ekspresja kaspazy-3. W komórkach obydwu linii limfoblastycznych oraz linii HL-60 ekspresja kaspazy-3 zwiększała się po inkubacji z każdym z badanych preparatów
L-asparaginaz we wszystkich przeprowadzonych eksperymentach (p<0,001 w teście par Wilcoxona), natomiast nie stwierdzono takiego wzrostu w linii K-562 (tab. 3.).

Analiza syntezy tlenku azotu. We wszystkich badanych liniach po inkubacji z preparatami L-asparaginaz obserwowano wzrost syntezy tlenku azotu, przy czym w liniach wrażliwych na asparaginazę wzrost syntezy był większy (tab. 4.). Średnia wartość MFI odnosząca się do syntezy tlenku azotu, korelowała z wielkością wczesnej apoptozy, wyrażoną jako średnia wartość MFI dla wiązania anneksyny V, wartość testu Pearsona 0,889, p<0,01 (ryc. 2.).

Zależności pomiędzy badanymi parametrami indukcji apoptozy. Wykładniki aktywacji procesów apoptozy wykazywały korelację pomiędzy sobą (ryc. 2. i 3.), jak również odwrotną korelację z cytotoksycznością L-asparaginazy (wyrażoną jako wartość LC50) w teście MTT.

Omówienie wyników
Profil leków cytostatycznych aktywnych w ostrej białaczce limfoblastycznej i mieloblastycznej różni się dość istotnie. Lekami o najwyższej cytotoksyczności wobec limfoblastów są glikokortykoidy, winkrystyna, L-asparaginaza, antracykliny, cytarabina, metotreksat, cyklofosfamid, merkaptopuryna i tioguanina [7]. Natomiast lekami najbardziej aktywnymi wobec mieloblastów są cytarabina, antracykliny, etopozyd i tioguanina [8]. Chociaż komórki ostrych białaczek mieloblastycznych zasadniczo wykazują brak wrażliwości wobec glikokortykoidów [8] i metotreksatu [9], to wykazano, że leki te mogą wywierać również efekt cytotoksyczny wobec mieloblastów. W badaniach in vivo [10], stosując wysokie dawki metylprednizolonu, uzyskano efekt przeciwbiałaczkowy (nie różnicowano podtypu AML). Natomiast w badaniach ex vivo [11] komórki AML M5 poddane 21-godzinnej terapii z metotreksatem podlegały efektowi cytotoksycznemu identycznemu jak komórki ALL de novo i we wznowie. L-asparaginaza jest lekiem, który znalazł zastosowanie głównie w terapii ostrych rozrostów limfoblastycznych, jednakże był również stosowany w terapii AML zarówno w pierwszej linii terapii, jak i we wznowach [12, 13].
W przeprowadzonych w tej pracy badaniach wykazano, że L-asparaginaza może wykazywać aktywność również wobec mieloblastów. W analizie użyto 2 linii ostrych białaczek mieloblastycznych, zaliczanych wg klasyfikacji FAB do podtypu M3 (linia HL-60, komórki ostrej białaczki promielocytowej) oraz do podtypu M6 (linia K-562, komórki przewlekłej białaczki szpikowej w fazie kryzy erytroblastycznej). Jako linii porównawczych użyto 2 linii ostrych białaczek limfoblastycznych linii T-komórkowej. Badania eksperymentalne przeprowadzono z użyciem trzech preparatów L-asparaginazy. Stwierdzono, że badane preparaty L-asparaginazy wywierały podobne efekty we wszystkich badaniach w obrębie poszczególnych linii.
W badaniach wykazano, że badane 2 linie mieloidalne wykazywały odmienny profil wrażliwości na preparaty L-asparaginazy. Komórki linii HL-60 wykazywały wrażliwość na L-asparaginazę oraz indukcję procesów apoptotycznych (indukcję fazy sub-G1 w cyklu komórkowym, aktywację kaspazy-3, wiązanie anneksyny-V oraz syntezę tlenku azotu) porównywalną z chemiowrażliwością oraz indukcją apoptozy w komórkach linii ostrych białaczek limfoblastycznych. Natomiast komórki linii K-562 wykazywały całkowitą oporność na wszystkie preparaty L-asparaginazy potwierdzoną przez brak indukcji apoptozy we wszystkich badaniach.
Indukcja apoptozy w komórkach białaczkowych przez
L-asparaginazę jest ważnym mechanizmem działania tego leku [14]. W badaniach przeprowadzonych w ostatnich latach stwierdzono, że L-asparaginaza powoduje aktywację kaspazy-3, hamowanie PARP, eksternalizację fosfatydyloseryny i zaburzenie potencjału przezmitochondrialnego [15] oraz zahamowanie cyklu komórkowego w fazie G1 [14], które w efekcie prowadzą do apoptozy. Procesowi temu sprzyja również produkcja tlenku azotu, który może wywierać działanie proapoptotyczne [16]. W przeprowadzonych badaniach na liniach komórkowych obserwowano aktywację procesów apoptozy we wszystkich liniach wrażliwych na
L-asparaginazę w teście MTT, tj. w liniach ostrych białaczek limfoblastycznych oraz w linii HL-60. Poszczególne parametry indukcji apoptozy korelowały pomiędzy sobą, chociaż w różnym stopniu. Stwierdzono silną korelację pomiędzy indukcją wczesnej apoptozy, wyrażoną wiązaniem anneksyny V i syntezą tlenku azotu. Indukcja apoptozy korelowała z wrażliwością na lek w teście MTT, chociaż w przypadku linii Jurkat zjawiska te były wyrażone słabiej niż w linii CCRF-CEM. Sugeruje to współistnienie innych mechanizmów związanych z działaniem L-asparaginazy, decydujących o efekcie cytotoksycznym w tej linii komórkowej.
Wydaje się, że wrażliwość mieloblastów wobec L-asparaginazy jest zróżnicowana, a zarazem niezależna od rodzaju stosowanego preparatu L-asparaginazy. Komórki linii
HL-60 o morfologii M3 są względnie wrażliwe na cytotoksyczne działanie L-asparaginazy. Natomiast komórki linii
K-562 o morfologii M6, posiadające 2 kopie chromosomu Philadelphia, wykazują znaczną oporność i brak indukcji apoptozy pod wpływem działania L-asparaginazy.
L-asparaginaza jest stosowana w programach chemioterapii wielolekowej ze względu na odmienny, swoisty mechanizm działania cytotoksycznego. Lek ten wywiera również działanie ochronne (rescue) wobec toksycznych efektów metotreksatu i cytarabiny. Sekwencyjne zastosowanie kombinacji metotreksatu i L-asparaginazy lub cytarabiny i L-asparaginazy wykazało dobry efekt w terapii dzieci ze wznową białaczki [17], chociaż nie wykazano wpływu tego efektu na wyniki leczenia ALL w programie BFM-90 [18]. Efekt ochronny L-asparaginazy jest związany z obniżeniem syntezy białek w normalnej tkance. Natomiast w przypadku podania tych leków w odwrotnej sekwencji (np. metotreksat podawany po L-asparaginazie), powoduje wystąpienie antagonizmu w działaniu cytotoksycznym [17].
W związku z niezadowalającymi wynikami w terapii AML, ciągle trwają poszukiwania leków skutecznych wobec tej choroby. W ostatnich latach pojawiły się próby zastosowania nowych leków w leczeniu AML. Największe zainteresowanie budzą leki zaliczane do tzw. terapii celowanej, a w szczególności inhibitory receptora kinazy tyrozynowej FLT-3/ITD, czyli CD135 (SU5416, SU11657) [19], inhibitory białka MDR1 [20], gemtuzumab ozogamicin (przeciwciała monoklonalne anty-CD33) [21, 22] i inhibitory transferazy farnezylowej (Zarnestra), które hamują drogę sygnałową białka RAS [23].

Podziękowania
Autorzy dziękują anonimowemu recenzentowi za uwagi i sugestie, które przyczyniły się do podniesienia jakości tej pracy.
Piśmiennictwo
1. Gałamon T. Chemia ogólna dla studentów medycyny i stomatologii. PZWL, Warszawa 1988; 126-7.
2. Orzechowska-Juzwenko K. Farmakologia kliniczna leków przeciwnowotworowych. W: Orzechowska-Juzwenko K (red.). Chemioterapia nowotworów. PZWL, Warszawa 1990; 22-64.
3. Styczyński J, Pieters R, Huismans DR, et al. in vitro drug resistance profiles in adult versus childhood acute lymphoblastic leukaemia. Br J Haematol 2000; 110: 813-8.
4. Liu T, Raetz E, Moos PJ, et al. Diversity of the apoptotic response to chemotherapy in childhood leukemia. Leukemia 2002; 16: 223-32.
5. Jia W, Yu C, Rahmani M, et al. Synergistic antileukemic interactions between 17-AAG and UCN-01 involve interruption of RAF/MEK- and AKT-related pathways. Blood 2003; 102: 1824-32.
6. Umansky V, Schirrmacher V. Nitric oxide-induced apoptosis in tumor cells. Adv Cancer Res 2001; 82: 107-31.
7. Pui CH, Evans WE. Acute lymphoblastic leukemia. N Engl J Med 1998; 339: 605-15.
8. Zwaan CM, Kaspers GJ, Pieters R, et al. Cellular drug resistance profiles in childhood acute myeloid leukemia: differences between FAB types and comparison with acute lymphoblastic leukemia. Blood 2000; 96: 2879-86.
9. Rots MG, Pieters R, Peters GJ, et al. Role of folylpolyglutamate synthetase and folylpolyglutamate hydrolase in methotrexate accumulation and polyglutamylation in childhood leukemia. Blood 1999; 93: 1677-83.
10. Ozbek N, Erdemli E, Hicsonmez G, et al. Effects of methylprednisolone on human myeloid leukemic cells in vitro. Am J Hematol 1999; 60: 255-9.
11. Rots MG, Pieters R, Jansen G, et al. A possible role for methotrexate in the treatment of childhood acute myeloid leukaemia, in particular for acute monocytic leukaemia. Eur J Cancer 2001; 37: 492-8.
12. Perel Y, Auvrignon A, Leblanc T, et al. Impact of addition of maintenance therapy to intensive induction and consolidation chemotherapy for childhood acute myeloblastic leukemia: results of a prospective randomized trial, LAME 89/91. J Clin Oncol 2002; 20: 2774-82.
13. Hiddemann W, Buchner T. Treatment strategies in acute myeloid leukaemia (AML). B. Second line treatment. Blut 1990; 60: 163-71.
14. Ueno T, Ohtawa K, Mitsui K, et al. Cell cycle arrest and apoptosis of leukemia cells induced by L-asparaginase. Leukemia 1997; 11: 1858-61.
15. Holleman A, den Boer ML, Kazemier KM, et al. Resistance to different classes of drugs is associated with impaired apoptosis in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 2003; 102: 4541-6.
16. Shami PJ, Saavedra JE, Wang LY, et al. JS-K, a glutathione/glutathione S-transferase-activated nitric oxide donor of the diazeniumdiolate class with potent antineoplastic activity. Mol Cancer Ther 2003; 2: 409-17.
17. Balis FM, Holcenberg JS, Poplack DG. General principles of chemotherapy. In: Principles and practice of pediatric oncology. Third Edition. Pizzo PA, Poplack DG (red.). Lippincott-Raven, Philadelphia 1997; 215-72.
18. Schrappe M, Reiter A, Ludwig WD, et al. Improved outcome in childhood acute lymphoblastic leukemia despite reduced use of anthracyclines and cranial radiotherapy: results of trial ALL-BFM 90. German-Austrian-Swiss ALL-BFM Study Group. Blood 2000; 95: 3310-22.
19. Zwaan CM, Kaspers GJL. Possibilities for tailored and targeted therapy in paediatric acute myeloid leukaemia. Brit J Haematol 2004; 127: 264-79.
20. Mahadevan D, List AF. Targeting the multidrug resistance-1 transporter in AML: molecular regulation and therapeutic strategies. Blood 2004; 104: 1940-51.
21. Reinhardt D, Diekamp S, Fleischhack G, et al. Gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg) in children with refractory or relapsed acute myeloid leukemia. Onkologie 2004; 27: 269-72.
22. Zwaan CM, Meshinchi S, Radich JP, et al. FLT3 internal tandem duplication in 234 children with acute myeloid leukemia: prognostic significance and relation to cellular drug resistance. Blood 2003; 102: 2387-94.
23. Stone RM, O’Donnell MR, Sekeres MA. Acute myeloid leukaemia. Hematology. ASH Educational Book 2004; 98-117.
Adres do korespondencji
dr n. med. Jan Styczyński
Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii
Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy
Uniwersytet im. Mikołaja Kopernika
ul. Curie-Skłodowskiej 9
85-094 Bydgoszcz
tel. +48 52 585 48 60
faks +48 52 585 40 87
e-mail: jstyczynski@cm.umk.pl