Confocal laser endomicroscopy – principles, clinical practice, future trends

Wprowadzenie

Początki rozwoju nowoczesnej endoskopii z zastosowa­niem włókien światłowodowych sięgają lat 50. ubiegłego wieku, kiedy badano przede wszystkim pacjentów z objawami chorób przewodu pokarmowego lub weryfikowano rozpoznania uzyskiwane na podstawie badań radiologicznych. Postęp technologiczny umożliwił rozwój aparatury endoskopowej: wprowadzenie wideoendoskopii, chromoendoskopii oraz endoskopii z powiększeniem, co pozwoliło precyzyjnie oceniać powierzchnię błony śluzowej, a więc lepiej i wcześniej rozpoznawać choroby przewodu pokarmowego. Wykrycie zmian wczes­nych, kluczowe w walce z chorobami nowotworowymi, pozwala na zastosowanie terapii endoskopowej lub mało­inwazyjnej chirurgii. Poprawa wizualizacji nie zmienia faktu, że dopiero badanie histopatologiczne wymagające odpowiedniego czasu pozwala na podjęcie decyzji tera­peutycznych. Laserowa endomikroskopia konfokalna (confocal laser endomicroscopy – CLE), umożliwiająca obra­zowanie struktur wielkości do 250 µm pod powierzchnią błony śluzowej z 1000-krotnym powiększeniem, jest próbą jednoczesnego badania endoskopowego z oceną zbliżoną do rozpoznań histopatologicznych. Przydatność en­do­mikroskopii w świetle aktualnie dostępnych danych autorzy starali się ocenić na podstawie własnego doś­wiadczenia z wykorzystaniem tej nowatorskiej metody.

Zasada działania

Podstawy działania mikroskopii konfokalnej zostały opracowane przez Marvina Minskiego w latach 50. XX wieku [1]. Obraz mikroskopowy charakteryzuje się dużym powiększeniem, odbywa się to jednak kosztem zmniejszenia głębi ostrości. Ocena żywej tkanki, nawet jeżeli przenika przez nią światło, jest praktycznie niemożliwa z powodu artefaktów świetlnych ze struktur leżących poza ogniskową aparatu. Ocena tkanki pod mikroskopem wymaga jej pocięcia na bardzo cienkie warstwy o grubości odpowiadającej głębi ostrości dla danego powiększenia. W mikroskopii konfokalnej za pomocą źródła światła laserowego, specjalnego układu optycznego oraz procesora komputerowego uzyskuje się odpowiednio ostre obrazy kolejnych płaszczyzn tak daleko w głąb, jak możliwe jest przenikanie światła lasera, a odpowiedni układ optyczny odcina zakłócenia świetlne z tkanki poza ogniskową. Początkowe ograniczenia techniczne, uniemożliwiające konstrukcję odpowiedniej aparatury, zostały przezwyciężone dzięki miniaturyzacji i zastosowaniu przez Dalaneya i wsp. [2] jednego włókna optycznego przewodzącego światło lasera docierające w głąb tkanki, a także obrazy emitowane z kolejnych płaszczyzn. Zastosowanie mikroskopii konfokalnej w endoskopii stało się możliwe. Pierwszy system endomikroskopii konfokalnej składający się z kolonoskopu Pentax EC 3830FK wyposażonego w skaner konfokalny, system kalibracji i konektor łączący endoskop z procesorem konfokalnym powstał w 2004 r. [3]. Procesor konfokalny składa się ze źródła światła laserowego i detektora stanowiącego złożony system optyczno-elektroniczny. Światło laserowe o długości fali 488 nm, emitowane przez źródło i przesyłane następnie przez włókno optyczne, przechodzi w obrębie skanera przez system elektromagnesów sterujących kierunkiem wiązki w trzech płaszczyznach. Wiązka światła przechodzi na kolejnym etapie przez układ soczewek, trafia w obręb tkanki, gdzie wzbudza środek fluorescencyjny do emisji światła dostarczanego tym samym systemem, ale w przeciwnym kierunku do fotodetektora przetwarzającego dane na obrazy mikroskopowe. Odpowiedni układ filtrujący na kilku poziomach ognis­kuje wiązkę światła (stąd określenie „konfokalna” – współogniskowa) i eliminuje artefakty, zachowując wyłącznie fale w dokładnie zdefiniowanej płaszczyźnie poziomej, co pozwala uzyskać obraz o wysokiej rozdzielczości. Poje­dyncze pole obrazowania błony śluzowej obejmuje obszar 475 µm × 475 µm, z którego w zależności od szybkości skanowania uzyskuje się obrazy o rozdzielczości 1024 × 1024 pikseli (0,8 kadru na sekundę) lub 1024 × 512 pikseli (1,6 kadru na sekundę). Skanowanie do 250 µm w głąb tkanki z osiową rozdzielczością 7 µm (grubość pojedynczego skanu optycznego odpowiadająca 1–2 warstwom komórek) odbywa się skokowo co 4 µm. Ograniczeniem zasięgu badania jest przenikanie światła laserowego niepowodujące uszkodzenia tkanek, co zapewnia użycie lasera o mocy do 1 mW – zwykle stosowany zakres mocy nie przekracza 300–700 µW [4].

Technika badania

Stosowane obecnie endomikroskopy umożliwiają zarówno wykonanie panendoskopii, jak i kolonoskopii. Końcówka aparatu o średnicy 12,8 mm zawiera wbudowany zminiaturyzowany skaner światła laserowego o średnicy 5 mm, soczewkę obiektywu kamery CCD, dysze powietrza i wody, światłowód, kanał operacyjny 2,8 mm i dodatkową dyszę systemu spłukiwania. Na głowicy endoskopu znajdują się dwa dodatkowe przyciski służące do obsługi mikroskopu konfokalnego, w tym do kontroli i sterowania kierunkiem i głębokością skanowania warstw błony śluzowej. Endoskop połączony jest standardowo z procesorem i monitorem obrazu światła białego oraz dodatkowo poprzez konektor z jednostką konfokalną wyposażoną w osobny monitor. Konstrukcja aparatu i przyłączy umożliwia ich dezynfekcję w konwencjonalnych myjniach.

Do badania zarówno górnego, jak i dolnego odcinka przewodu pokarmowego pacjent przygotowywany jest jak do standardowej endoskopii. Ważne jest szczególnie staranne przygotowanie jelita grubego, ponieważ resztki kału mogą być źródłem artefaktów. Zastosowanie chromoendoskopii z endomikroskopią może być zalecane [5] w odniesieniu do błękitu metylenowego i karminu indygo, natomiast kwas octowy zakłóca odbiór fluorescencji tkankowej i nie powinien być używany.

Technika badania endomikroskopem w zakresie oceny makroskopowej nie różni się zasadniczo od konwencjonalnej endoskopii. Pewne ograniczenie stanowi dość długie usztywnienie końcówki aparatu, w którą wbudowany jest skaner, co w naszych obserwacjach wiąże się z utrudnieniem oceny wpustu od strony żołądka i inwersji na wysokości kąta, w mniejszym stopniu natomiast stanowi przeszkodę w intubacji zastawki krętniczo-kątniczej. Soczewka okna obrazu konfokalnego wystaje nieco ponad płaszczyznę końcówki, co – w połączeniu z emisją niebieskiego światła laserowego – pozwala na łatwe umiejscowienie okna na badanej zmianie. Końcówkę aparatu należy ustawić prostopadle do badanej powierzchni, aby osiągnąć pełny i stabilny kontakt z błoną śluzową. Dobre przyleganie okna obrazu konfokalnego wymaga z reguły dociś­nięcia i zagięcia końcówki, jak również przyssania do błony śluzowej, co jednak jest przyczyną wynaczynienia fluoresceiny i związanych z tym artefaktów. Z drugiej strony ułatwia to celowane biopsje, które należy pobierać ok. 5 mm w lewo od widocznego obszaru wybroczyn. Czas badania zależy od zaawansowania operatora i zwykle w przypadku doświadczonego endoskopisty jest wydłużony o ok. 30% w stosunku do badania konwencjonalnego.

Środki kontrastujące i podstawy interpretacji obrazów

Warunkiem uzyskania obrazów endomikroskopowych jest użycie czynników fluorescencyjnych, z których najczęściej stosuje się fluoresceinę (dożylna iniekcja 5–10 ml 10% roztworu) i akryflawinę (aplikacja 10–50 ml 0,02% roztworu na powierzchnię błony śluzowej przy użyciu specjalnego cewnika). Fluoresceina ulega dystrybucji poprzez kapilary w obręb błony śluzowej, gdzie stymulowana laserem o długości fali 465–490 nm emituje światło o długości fali 520–530 nm, przetwarzane następnie na obrazy endomikroskopowe. Zakontrastowane naczynia włosowate z cieniami erytrocytów usytuowane w blaszce właściwej śluzówki, a także macierz pozakomórkowa (connective tissue matrix) i cytoplazma komórek nabłonka widoczne są jako struktury jasne, „świecące” oraz o różnym odcieniu szarości w odróżnieniu od jąder komórkowych oraz cew i ujść gruczołów (struktury ciemne) [6]. Niewybarwione fluoresceiną jądra komórkowe można zakontrastować przy użyciu akryflawiny, jednak barwnik ten powinien być używany ostrożnie z uwagi na potencjalną mutagenność [7]. Istotną cechą fluoresceiny jest wrażliwość na zmiany pH – im bardziej kwaśny odczyn, tym mniej wybarwione (ciemniejsze) komórki. Zjawisko to jest istotne przy identyfikacji neoplazji charakteryzującej się obecnością komórek o niskim pH [8]. Uzyskane obrazy endomikroskopowe ukazujące charakterystyczną morfologię prawidłowej błony śluzowej przełyku, dołeczków żołądkowych, kosmków jelitowych i krypt błony śluzowej jelita grubego dobrze korelują z konwencjonalnymi histopatologicznymi bioptatami barwionymi hematoksyliną i eozyną [6, 9]. Oceniając obrazy kofokalne, endoskopista powinien dysponować co najmniej podstawową wiedzą na temat budowy histologicznej błony śluzowej posz­czególnych odcinków przewodu pokarmowego.

Przełyk i połączenie przełykowo-żołądkowe

Charakterystyczny obraz skanów endomikroskopowych odzwierciedla mikroarchitekturę poszczególnych warstw błony śluzowej przełyku, poczynając od powierzchownie usytuowanych wielokątnych komórek nabłonka płaskiego, oddzielonych siatką przestrzeni międzykomórkowych. Skanowanie głębszych warstw uwidacznia horyzontalne przekroje brodawkowatych uwypukleń blaszki właściwej śluzówki z włośniczkowymi pętlami śródbrodawkowymi (ryc. 1.). Obrazowanie połączenia przełykowo-żołądkowego pozwala uwidocznić mozaikowate obszary bezpośredniej styczności komórek nabłonka płaskiego i walcowatego, typowego dla gruczołów wpustu [6] (ryc. 2.).

Przełyk Barretta

Przełykiem Barretta nazywa się obecność powyżej górnego brzegu fałdów żołądkowych segmentu błony śluzowej pokrytej nabłonkiem walcowatokomórkowym z histopatologicznie potwierdzoną metaplazją jelitową lub metaplazją typu żołądkowego [10]. Złotym standardem w diagnostyce przełyku Barretta oraz związanej z nim dysplazji i wczesnego raka pozostaje histopatologiczna ocena materiału uzyskanego za pomocą biopsji kleszczykowej wg protokołu z Seattle, co związane jest z koniecznością pobrania licznych wycinków, często z przypadkowych miejsc. Zastosowanie CLE w przypadku makroskopowego podejrzenia przełyku Barretta stwarza możliwość identyfikacji komórek kubkowych, patognomonicznych dla wyspecjalizowanej metaplazji jelitowej.

W 2006 r. Kisslich i wsp. [11] w pierwszym przepro­wadzonym badaniu z użyciem endomikroskopii, w którym analizowano 63 pacjentów z przełykiem Barretta, wyróżnili poszczególne rodzaje nabłonków i oceniali zmia­ny w obrębie komórek, gruczołów i naczyń włosowatych. Opierając się na analizie porównawczej obrazów konfokalnych z histopatologicznymi, zaproponowali endomikroskopową klasyfikację wyróżniającą trzy rodzaje nabłonka: typu żołądkowego, nabłonek Barretta oraz neoplazję towarzyszącą nabłonkowi Barretta. Pierwszy z nabłonków charakteryzuje się regularnym układem komórek walcowatych tworzących okrągłe lub owalne ujścia gruczołów, regularne kapilary widoczne są jedynie podczas skanowania głębszych warstw błony śluzowej (ryc. 3.). Obecność w miejscu typowym dla śluzówki przełyku ujść i światła gruczołów utworzonych przez komórki nabłonka walcowatego z patognomonicznymi komórkami kubkowymi (ciemne plamki odpowiadające niewysyconej fluoresceiną mucynie) jest charakterystyczne dla nabłonka Barretta (ryc. 4.). Kosmkowata struktura i podnabłonkowe naczynia włosowate widoczne są już w powierzchownych skanach (ryc. 5.).

Ponadto własne obserwacje autorów wskazują, że w przypadku braku komórek kubkowych w obrębie segmentu śluzówki gruczołowej istnieje możliwość wstępnej identyfikacji metaplazji typu żołądkowego błony śluzowej przełyku, co w świetle aktualnych wytycznych upoważnia do rozpoznania przełyku Barretta (ryc. 6.).

Charakterystyczny obraz neoplazji towarzyszącej przełykowi Barretta to nieregularne światło i przerwanie ciągłości gruczołów, bardzo ciemne komórki nabłonka walcowatego (niewybarwione, hiperchromatyczne jądra) o zróżnicowanej wysokości i kształcie, bez wyraźnych granic oraz z wielopoziomowym rozmieszczeniem jąder komórkowych i przerwaniem ciągłości błony podstawnej. Nieregularny przebieg włośniczek oraz pozakapilarne wylewy barwnika (intensywne jasne plamy) przekraczające błonę podstawną świadczą o neoangiogenzie.

Kisslich i wsp. [11], wykorzystując powyższą klasyfikację, ponownie porównali 3012 obrazów endomikroskopowych ze 411 histopatologicznymi uzyskanymi z celowanych biopsji. Stwierdzili, że charakterystyczny obraz konfokalny wskazuje na obecność przełyku Barretta z 98,1-procentową czułością oraz 94,1-procentową specyficznością. W przypadku neoplazji wartości te wynosiły odpowiednio 92,9% oraz 98,4%.

Z kolei Dunbar i wsp. [12], opierając się na klasyfikacji endomikroskopowej, przeprowadzili pierwsze prospektywne badanie z randomizacją, z podwójnie ślepą próbą, w grupie 39 pacjentów z przełykiem Barretta, w tym 23 poddawanych rutynowemu nadzorowi endoskopowemu oraz 16 z podejrzeniem neoplazji towarzyszącej przełykowi Barretta (grupa wysokiego ryzyka). Wykazali, że endomikroskopia z celowaną biopsją zmniejsza o 60% liczbę wycinków niezbędnych do wykrycia neoplazji w porównaniu z klasyczną endoskopią z biopsją z czterech kwadrantów, przy czym w grupie bez wysokiego ryzyka odsetek biopsji możliwych do uniknięcia wynosił aż 86%. W związku z powyższym prawie 2/3 pacjentów poddanych rutynowemu nadzorowi nie wymagałoby biopsji w związku z niestwierdzeniem podejrzanych zmian w badaniu endomikroskopowym. Ponadto zaobserwowali, że w grupie wysokiego ryzyka endomikroskopia z celowaną biopsją prawie dwukrotnie poprawia wykrywalność makroskopowo niewidocznej dysplazji dużego stopnia w porównaniu z klasycznym protokołem (33,7% vs 17,2%).

Nienadżerkowa choroba refluksowa

Osobnym zagadnieniem pozostaje nienadżerkowe zapalenie błony śluzowej przełyku, gdzie pomimo niewidocznych makroskopowo zmian zapalnych stwierdza się charakterystyczne odchylenia w badaniu histopa­tologicznym w postaci wydłużenia brodawek, proliferacji komórek warstwy podstawnej oraz poszerzenia przestrzeni międzykomórkowych. Obecność zmian mikroskopowych wydaje się zatem stwarzać możliwości zastosowania obrazowania konfokalnego w nienadżerkowej chorobie refluksowej (non-erosive reflux disease – NERD).

W pilotażowym badaniu [13] obejmującym pacjentów z objawami refluksu i makroskopowo prawidłowym obrazem błony śluzowej dystalnej części przełyku oceniano obrazy endomikroskopowe z czterech kwadrantów linii Z oraz obszarów położonych 2 cm proksymalnie. U prawie połowy pacjentów stwierdzono zmiany w postaci wydłużenia i zwiększenia liczby brodawek, wzmożenia ich unaczynienia oraz poszerzenia przestrzeni międzykomórkowych. Wykazano, że obecność powyżej pięciu śródbrodawkowych splotów włośniczkowych w pojedynczym endomikroskopowym polu widzenia oraz odległości międzykomórkowe przekraczające 3 µm pozwalają przewidywać typowe zapalne zmiany w obrazie histopatologicznym z 94,9-procentową czułością i 85,4-procentową specyficznością (ryc. 7.).

Wczesny rak płaskonabłonkowy przełyku

Dotychczasowe wyniki przemawiają za tym, że CLE może być pomocna w identyfikacji wczesnego raka płaskonabłonkowego przełyku. Istotne podejrzenie nowotworzenia w obrębie błony śluzowej przełyku nasuwa zanik typowego obrazu i proporcjonalnych odstępów między brodawkami, skrajnie nieregularny układ i kształt komórek nabłonka oraz pozakapilarna obecność fluoresceiny, będąca rezultatem nowotworzenia naczyń, jak również wynaczynienia poza uszkodzone włośniczki [7]. Autorzy jednej z prac [14] oceniali przydatność metody poprzez analizę skanów konfokalnych z podejrzanych zmian przez dwóch zaślepionych (w zakresie histopatologii i obrazów makroskopowych) endoskopistów. Ogólna trafność rozpoznań w stosunku do potwierdzonych histologicznie raków wyniosła 95% przy czułości i specyficzności odpowiednio 100% i 87%.

Z kolei chińscy badacze [15] porównywali wygląd komórek i śródbrodawkowych splotów kapilarnych prawidłowej błony śluzowej przełyku z obrazami endomikroskopowymi potwierdzonych histopatologicznie raków płaskonabłonkowych. Stwierdzono istotne statystycznie różnice w zakresie proporcji obszarów o nieregularnym układzie komórek – powiększenie splotów kapilarnych (26,0 µm vs 19,2 µm) oraz nieregularnym kształcie splotów w raku płaskonabłonkowym.

Żołądek

Powierzchnia błony śluzowej i ujścia cew gruczołowych (dołeczki żołądkowe) wyściełane są nabłonkiem jednowarstwowym walcowatym utworzonym przez komórki śluzowe, natomiast cieśń, część główną i podstawę gruczołów tworzą w przeważającej części komórki główne i okładzinowe. Cewy gruczołowe usytuowane w obrębie unaczynionej kapilarami blaszki właściwej sięgają do blaszki mięśniowej śluzówki.

Dołeczki żołądkowe możliwe do uwidocznienia w endoskopii z powiększeniem są podstawową jednostką mikroarchitektury powierzchni błony śluzowej żołądka [16]. W sklepieniu i trzonie cewy gruczołowe uchodzą pojedynczo na powierzchnię, stąd ich ujścia mają postać dołeczków okrągłych. W części przedodźwiernikowej kilka cew gruczołowych dzieli jedno wspólne ujście, które ma kształt pręcika.

Podczas CLE w warunkach prawidłowych uwidacznia się powierzchownie usytuowane komórki nabłonka oraz dołeczki żołądkowe, w głębszych warstwach silnie wysyconą środkiem kontrastowym blaszkę właściwą, oddzieloną pojedynczą warstwą komórek od światła cew gruczołowych. Dołeczki żołądkowe w antrum charakteryzują się linijnym, szczelinowatym układem, podczas gdy w trzonie żołądka ujścia gruczołów przyjmują okrągły lub owalny, regularny kształt. Naczynia włosowate otaczające krypty gruczołowe w trzonie żołądka przyjmują układ „plastra miodu” (ryc. 3.), w antrum siatka naczyń utworzona jest przez spiralnie poskręcane kapilary (ryc. 8.) [6, 7].

Infekcja Helicobacter pylori

W 2005 r. po raz pierwszy wykazano możliwość wykrycia infekcji Helicobacter pylori podczas endomikroskopii z użyciem akryflawiny, wykorzystując zjawisko akumulacji tego powierzchniowego barwnika przez bakterię [17]. Komórki patogenu widoczne są jako silnie wybarwione, jasne punkty w obrębie komórek nabłonka i charakteryzują się typowym kształtem oraz możliwą do uwidocznienia wicią. Precyzyjne określenie miejsca największego zagęszczenia komórek bakteryjnych umożliwia celowaną biopsję i może zmniejszać odsetek fałszywie ujemnych wyników.

Zapalenie zanikowe błony śluzowej, metaplazja jelitowa i wczesny rak żołądka

Wymienione zmiany w obrębie śluzówki żołądka występują z odmienną częstością, mogą natomiast zarówno współistnieć ze sobą, jak i następować kolejno po sobie. Wykrycie wczesnych postaci raka żołądka jest wyzwaniem dla endoskopisty, szczególnie w przypadku zmian płaskich i zapadniętych, dyskretnie różniących się od otaczającej śluzówki. Szczególnego znaczenia nabiera możliwość zastosowania CLE w wykrywaniu i ocenie ognisk podejrzanych o wystąpienie wczesnego raka żołądka (early gastric cancer – EGC), kwalifikowanych do leczenia endoskopowego w sytuacji, gdy pojawiają się opinie o niepobieraniu biopsji kleszczykowej ze zmian z uwagi na włóknienie utrudniające endoskopową śluzówkową resekcję (EMR) lub endoskopową podśluzówkową dysekcję (ESD).

Grupa chińskich badaczy [9], opierając się na analizie porównawczej obrazów konfokalnych z histopatologicznymi oraz dostępnych publikacjach, w 2008 r. po raz pierwszy podjęła próbę stworzenia klasyfikacji endomikroskopowej wzoru dołeczków żołądkowych, a następnie oceniła jej przydatność w prospektywnym badaniu obejmującym grupę 132 osób. Dwóch doświadczonych endoskopistów przeanalizowało 10 123 obrazy konfokalne, porównując następnie uzyskane wyniki z równoległymi rozpoznaniami zaślepionego patologa, oceniającego bioptaty z 521 odpowiednich lokalizacji. Stworzona klasyfikacja w odniesieniu do prawidłowej błony śluzowej wyróżnia dołeczki okrągłe (typ A), odpowiadające gruczołom dna żołądka (ryc. 9.), oraz podłużne, szczelinowate, ciągłe (typ C), korespondujące z gruczołami odźwiernikowymi (ryc. 8.). Dołeczki pręcikowate, nieciągłe, krótkie (typ B) odpowiadały łagodnym zmianom zapalnym błony śluzowej trzonu żołądka, dodatkowo przy współistnieniu poszerzenia światła dołeczków i odmiennym wyglądzie tworzących je komórek wyróżniono podtyp B’, wskazujący na nasilone leukoctarne zmiany zapalne. Ujścia gruczołów znacznie wydłużone, rozgałęzione, o krętym przebiegu (typ D) korelowały ze zmianami zapalnymi śluzówki antrum o łagodnym nasileniu; współistnienie poszerzenia przestrzeni między dołeczkami (pogrubienie blaszki właściwej) i powiększenie komórek (podtyp D’) wskazywały na zapalenie średnio ciężkiego lub ciężkiego stopnia. Stopień nasilenia zmian zapalnych określony histopatologicznie był istotnie wyższy (p < 0,01) dla typu D niż C. Znaczne poszerzenie światła dołeczków na rzecz blaszki właściwej, skutkujące zmniejszeniem ich liczby w polu widzenia, oraz kapilary widoczne już w powierzchownych skanach (typ E) wskazywały na obecność zanikowego zapalenia błony śluzowej z dokładnością 97,5% (ryc. 10.). Kosmkowaty wygląd, ze strukturami blaszki właściwej położonymi centralnie, ciemne, homogenne, okrągłe plamki odpowiadające depozytom mucyny oraz wysmukłe komórki nabłonka (typ F) były wysoce specyficzne dla metaplazji jelitowej z patognomonicznymi komórkami kubkowymi (ryc. 11.). Wysoką czułość i specyficzność (odpowiednio 90,0% i 99,4%) przy dokładności 97,1% stwierdzono dla korelacji typu G z rakiem żołądka. Brak układu dołeczków zastąpiony rozlanym, zdezorganizowanym obszarem bardzo ciemnych komórek (podtyp G1) sugeruje niskozróżnicowanego raka. Znacznie nieregularny kształt oraz destrukcja gruczołów, z ciemnymi, wielokątnymi komórkami o nieregularnym, chaotycznym, sznurowym układzie (podtyp G2) przemawia za obecnością raka gruczołowego, co potwierdza analizowany przez autorów niniejszej publikacji materiał (ryc. 12.–17.).

Naczynia krwionośne zwykle zlokalizowane są w głębszych partiach EGC, stąd brak typowego unaczynienia w obrazach konfokalnych powierzchownych warstw sugeruje obecność neoplazji [7].

Wcześniejsze obserwacje dotyczące możliwości zastosowania obrazowania konfokalnego w diagnostyce wczesnego raka żołądka również były obiecujące [18]. W jednym z badań [19] obecność bardzo ciemnych komórek (chiperchromatyczne, niewybarwione jądra komórkowe) o nieregularnym układzie i kształcie oraz znaczna przewaga wielkości jądra w stosunku do cytoplazmy wskazywały na obecność raka w badaniu histologicznym z 80-procentową dokładnością (czułość 84%, specyficzność 95%).

Wydaje się zatem, że CLE może być pomocna w diagnostyce zanikowego zapalenia i metaplazji jelitowej błony śluzowej żołądka, zwiększać prawdopodobieństwo wykrycia infekcji H. pylori oraz różnicować zmiany łagodne od złośliwych.

Jelito cienkie

Błona śluzowa jelita cienkiego przyjmuje postać palczastych lub liściastych kosmków długości 0,5–1 mm, pomiędzy którymi znajdują się ujścia gruczołów Lieberkühna. Powierzchnia kosmków wyściełana jest nabłonkiem jednowarstwowym walcowatym, w obrębie którego pomiędzy enterocytami znajdują się komórki kubkowe. Szkielet każdego z kosmków stanowi blaszka właściwa z siatką naczyń włosowatych i naczyniem mleczowym.

Obrazowanie konfokalne dwunastnicy i ileum terminale umożliwia wizualizację poszczególnych kosmków jelitowych, komórek nabłonka z rąbkiem szczoteczkowym włącznie oraz komórek kubkowych zawierających mucynę (ciemne punkty) [8]. Skanowanie głębszych warstw uwidacznia dobrze zakontrastowane kapilary z cieniami erytrocytów [6, 7] (ryc. 18.).

Choroba trzewna

Pomimo często typowego obrazu endoskopowego choroby trzewnej (mozaikowana powierzchnia błony śluzowej, karbowanie na szczytach i wygładzenie fałdów, zaznaczony rysunek naczyniowy), złotym standardem rozpoznania jest ocena histologiczna bioptatów jelita cienkiego (zwiększona limfocytoza śródnabłonkowa, hiperplazja krypt, zanik kosmków). Problemem pozostaje odsetek wyników fałszywie ujemnych, który jest efektem pobrania z niereprezentatywnych miejsc, niskiej jakości materiału oraz zbyt powierzchownych biopsji.

Wydaje się, że zastosowanie obrazowania konfokalnego może poprawić wykrywalność celiakii [20]. W zależności od stopnia zaawansowania choroby i głębokości skanowania endomikroskopia ukazuje redukcję długości lub zupełny brak kosmków, z uwidocznieniem ujścia krypt gruczołowych (okrągłe struktury z radiacyjnym układem enterocytów otaczającech ujście), a w niektórych przypadkach jest możliwa identyfikacja zwiększonej limfocytozy śródnabłonkowej [21].

W prospektywnym badaniu [22] obejmującym 31 osób (11 z rozpoznaną chorobą trzewną leczonych dietą bezglutenową, 6 nieleczonych, 14 w grupie kontrol­nej) oceniano przydatność metody w rozpoznawaniu celiakii, ocenie stopnia zaawansowania choroby i odpowiedzi na leczenie w porównaniu z klasyczną histopatologią bipotatów kleszczykowych. Na potrzeby analizy stworzono konfokalny wskaźnik celiakii (confocal celiac score – CCS), oceniający stopień zaniku kosmków w powierzchownych skanach (villous atrophy – VA) oraz stopień hipertrofii krypt w głębszych warstwach (crypt hypertrophy – CH). Zdefiniowano VA jako obecność 5 lub mniejszej liczby skróconych kosmków, natomiast CH jako obecność co najmniej 1 krypty w pojedynczym polu endomikroskopowym. Wartość CCS kalkulowano oddzielnie dla każdego parametru oraz łącznie (oceniając tym samym wszystkie warstwy) w dwustopniowej skali, zależnie od stopnia nasilenia zmian. Stopień nasilenia zmian histologicznych określano wg klasyfikacji Marsha. Porównano rozpoznania dwóch zaślepionych endoskopistów (analiza 7019 skanów konfokalnych) z ocenami dwóch zaślepionych patologów (326 bioptatów z odpowiadających miejsc). Wykazano wysoką czułość (94%) i specyficzność (92%) endomikroskopii w rozpoznawaniu celiakii oraz dobrą korelację CCS z klasyfikacją Marsha. Obrazowanie konfokalne pozwalało jednoznacznie odróżnić pacjentów z celiakią od grupy kontrolnej (p < 0,0001) oraz wykazywało się wysoką czułością w rozpoznawaniu zmian w grupie pacjentów leczonych dietą bezglutenową (p < 0,012). Znamienne jest, że u 94% chorych z celiakią postawiono prawidłowe rozpoznanie endomikroskopowe, podczas gdy odsetek ten dla histopatologii wyniósł jedynie 76%. Brak możliwości jednoznacznego stwierdzenia limfocytozy śródnabłonkowej (gdzie pomocne mogłoby się okazać zastosowanie znakowanych limfocytów CD4) nie stanowił ograniczenia metody. Autorzy pracy wykazali wysoką korelację rozpoznań endomikroskopowych z histopatologicznymi celiakii i sugerują przydatność metody w rozpoznawaniu mało nasilonych zmian u leczonych chorych. Wysoka trafność rozpoznań może mieć potencjalne kliniczne znaczenie w diagnostyce choroby trzewnej in vivo i zmniejszać liczbę, a nawet pozwalać uniknąć zbędnych biopsji.

Jelito grube

Błona śluzowa jelita grubego składa się z układu krypt będących tubularnymi strukturami w obrębie blaszki właściwej, które uchodzą na powierzchnię, a w głębszych warstwach otoczone są siatką naczyń włosowatych. Jednowarstwowy nabłonek, złożony z komórek cylindrycznych i kubkowych, wyścieła krypty, ujścia i powierzchnię śluzówki.

Przy zastosowaniu CLE można z powodzeniem zobrazować ujścia (czarne punkty) krypt otoczone pojedynczą warstwą komórek walcowatych i kubkowych (ryc. 19.). Skanowanie głębszych warstw uwidacznia horyzontalne, okrągłe przekroje krypt (ryc. 20.), otoczone i przedzielone siatką naczyń włosowatych w blaszce właściwej śluzówki, które przyjmują charakterystyczny układ „plastra miodu” [6, 8] (ryc. 21.).

Rak jelita grubego

Rak jelita grubego, pomimo szerokiej akceptacji skriningowych programów kolonoskopowych, nadal stanowi jedną z głównych przyczyn umieralności z powodu nowotworów w krajach rozwiniętych. Szansa na wyleczenie jest ściśle związana z głębokością infiltracji nowotworu w chwili rozpoznania i istotnie wzrasta w przypadku wykrycia zmiany we wczesnym stopniu zaawansowania (przedinwazyjnym).

W 2004 r. przeprowadzono pierwsze prospektywne badanie z użyciem endomikroskopu, którego celem była ocena przydatności obrazowania konfokalnego w diagnostyce śródnabłonkowej neoplazji i raka jelita grubego [3]. Analizą objęto grupę 42 pacjentów zakwalifikowanych do badania przesiewowego lub objętych nadzorem kolonoskopowym. Na potrzeby badania stworzono klasyfikację na podstawie konfokalnego wzoru zmian jelita grubego, oceny architektury krypt i naczyń kapi­larnych, bazując na wcześniejszych doświadczeniach endomikroskopii. Za prawidłowy wzór uznano regularnie rozmieszczone, okrągłe ujścia i przewody wyprowadzające krypt, otoczone pojedynczą warstwą homogennych komórek walcowatych i kubkowych; otaczająca krypty siatka naczyń włosowatych przyjmuje sześciokątny układ „plastra miodu”. Zmiany regeneracyjne zgodnie z ww. klasyfikacją charakteryzują się gwiazdkowatymi ujściami krypt lub ogniskowym zagęszczeniem prawidłowych gruczołów, czasami o zmniejszonej liczbie komórek kubkowych; architektura naczyń jest prawidłowa, ewentualnie ze zwiększeniem liczby kapilar. Neoplazja jest wysoce prawdopodobna, gdy obserwuje się grzebieniaste, nieregularne warstwy nabłonka bez widocznych krypt i komórek kubkowych, z bardzo zaburzonym, nieregularnym układem komórek i redukcją ilości śluzu; brak typowego heksagonalnego układu, który zastąpiony jest poszerzonymi naczyniami o krętym przebiegu, oraz pozakapilarne wylewy barwnika sugerują neoangiogenezę.

W cytowanym badaniu [3] 13 020 obrazów konfokalnych z 390 podejrzanych zmian (256 trudno zauważalnych i 134 dobrze odgraniczonych) porównano odpowiednio z wynikami histopatologicznymi 1038 biopsji. Wykazano, że przy zastosowaniu ww. klasyfikacji możliwe jest przewidywanie obecności neoplazji z dokładnością 99,2% przy czułości 97,4% i specyficzności 99,4%. Makroskopowa identyfikacja zmian podejrzanych z jednoczesną weryfikacją obrazowaniem konfokalnym pozwala trafnie przewidywać obecność neoplazji. Autorzy sugerują stosowanie endomikroskopii rutynowo w badaniach przesiewowych i nadzorze kolonoskopowym w specjalistycznych ośrodkach endoskopowych.

Wrzodziejące zapalenie jelita grubego

Endomikroskopowy obraz zmian we wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego (WZJG) zależy od stopnia ciężkości choroby. Zmiana kształtu krypt na bardziej wydłużony przy zachowanym prawidłowym układzie komórek w ich obrębie oraz pogrubienie blaszki właściwej i zwiększenie odległości między kryptami (wynik nacieków komórkowych) sugeruje łagodne zmiany zapalne (ryc. 22. i 23.). Destrukcja krypt i wyraźne wzmożenie unaczynienia są związane z ciężkim przebiegiem choroby [7] (ryc. 24.).

Chińscy autorzy [23] porównali obrazy histologiczne z konfokalnymi w grupie 73 pacjentów z WZJG objętych nadzorem endoskopowym. Ocena stopnia nasilenia zmian zapalnych na podstawie architektury krypt jelitowych i wylewów fluoresceiny łącznie dobrze korelowała z obrazem histologicznym (p < 0,001), podobnie jak ocena zmian morfologii unaczynienia kapilarnego (p < 0,001).

Chorzy z wieloletnim wywiadem WZJG obarczeni są istotnie większym ryzykiem rozwoju raka jelita grubego w porównaniu z populacją ogólną. Rozwija się on często na podłożu wieloogniskowych zmian płaskich lub zapadniętych, trudnych do zauważenia w standardowej endoskopii z użyciem źródła światła białego. Ważnym narzędziem poprawiającym możliwości diagnostyki śródnabłonkowej neoplazji stała się chromoendoskopia z użyciem błękitu metylenowego lub karminu indygo [24], a próby jej połączenia z endomikroskopią dają obiecujące rezultaty.

W pierwszym badaniu z randomizacją [5], obejmującym 153 pacjentów z wieloletnim wywiadem WZJG, chorych przydzielono losowo do grupy poddanej konwencjonalnej kolonoskopii w ramach nadzoru lub do grupy, w której wykonywano chromoendoskopię z laserowym obrazowaniem konfokalnym. Pierwszorzędowy punkt końcowy stanowiło histologiczne potwierdzenie naoplazji. W pierwszej grupie pobierano biopsje błony śluzowej co 10 cm oraz ze zmian makroskopowo podejrzanych. W drugiej grupie zmiany wyodrębnione w chromoendoskopii z barwieniem błękitem metylenowym oceniano endomikroskopem pod kątem neoplazji (stosując konfokalną klasyfikację zmian opisaną powyżej) oraz pobierano z nich biopsje konwencjonalne. Zastosowanie naprowadzanej chromoendoskopowo CLE w porównaniu ze standardową kolonoskopią umożliwiło wykrycie istotnie większej liczby ognisk neoplazji (p = 0,007) przy wysokiej czułości i specyficzności (odpowiednio 94,7% i 98,3%). Podsumowując – zastosowanie endomikroskopii połączonej z chromoendoskopią pozwala z dużą dokładnością przewidywać obecność neoplazji, umożliwiając tym samym redukcję liczby biopsji do zmian podejrzanych.

Kolagenowe zapalenie jelita grubego

W ostatnich latach wzrasta liczba rozpoznań mikroskopowych zapaleń jelita grubego w grupie chorych z przewlekłą wodnistą biegunką o nieznanej etiologii. Przy prawidłowym makroskopowo wyglądzie śluzówki jelita grubego rozpoznanie zapalenia kolagenowego opiera się na obrazie histopatologicznym bioptatów, gdzie widoczne jest rozlane pogrubienie podnabłonkowej warstwy kolagenu dochodzące do 15–60 µm (przy normie < 10 µm).

Kiesslich i wsp. [25] wykazali, że endomikroskopia umożliwia lokalizację i pomiar grubości warstw kolagenu u podstawy komórek nabłonka i pobranie celowanych biopsji z miejsc podejrzanych o zapalenie, co wydaje się szczególnie istotne w związku z ogniskowym występowaniem zmian w jelicie. W powierzchownych skanach widoczna jest deformacja krypt jelitowych, natomiast w głębszych warstwach (ok. 150 µm od powierzchni) wyraźnie zauważalne, ciemne pasma kolagenu w blaszce właściwej, o grubości znacznie przekraczającej 10 µm (31 µm w cytowanym opracowaniu). Pomimo dobrej korelacji z obrazem histopatologicznym określenie czułości i specyficzności metody wymaga dalszych prospektywnych badań.

Podsumowanie

Laserowa endomikroskopia konfokalna jest nowo powstałym, rozwijającym się narzędziem diagnostycznym, umożliwiającym natychmiastową ocenę błony śluzowej zbliżoną do histologicznej w czasie badania endoskopowego. Przy obecnym stanie wiedzy oczywiste jest, iż nie może być stawiana na równi z histopatologiczną oceną bioptatów barwionych hematoksyliną i eozyną, jednakże opublikowane dotychczas badania, w tym prospektywne z randomizacją, potwierdzają wysoką trafność rozpoznań endomikroskopowych. Spektrum przydatności diagnostycznej w zakresie celowanych biopsji i prognozowania rozpoznań histologicznych rozszerza się począwszy od skriningu i nadzoru po leczeniu raka jelita grubego, poprzez przełyk Barretta i towarzyszącą neoplazję, infekcję H. pylori, do wczesnego raka żołądka i przełyku włącznie. Ponadto zastosowanie obrazowania konfokalnego jako narzędzia pomocniczego w ocenie stopnia ciężkości i wykrywaniu neoplazji u chorych z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego, diagnostyce choroby trzewnej i kolagenowego zapalenia jelita grubego przynosi obiecujące rezultaty. Wydaje się, że endomikroskopia jest na najlepszej drodze do odegrania ważnej roli diagnostycznej w zakresie wielu patologii przewodu pokarmowego, jednakże konieczne są dalsze dobrze kontrolowane badania. Drzwi do wirtualnej histologii zostały otwarte.

Piśmiennictwo

 1. Minsky M. Microscopy Apparatus. US Patent 3013467, 1957.  

2. Delaney PM, Harris MR, King RG. Fiber-optic laser scaning confocal microscope suitable for fluorescence imaging. Appl Optics 1994; 33: 573-7.  

3. Kiesslich R, Burg J, Vieth M, et al. Confocal laser endoscopy for diagnosis intraepithelial neoplasias and colorectal cancer in vivo. Gastroenterology 2004; 127: 706-13.  

4. Venkatesh K, Cohen M, Evans C, et al. Feasibility of confocal endomicroscopy in the diagnosis of pediatric gastrointestinal disorders. World J Gastroenterol 2009; 15: 2214-9.  

5. Kiesslich R, Goetz M, Lammersdorf K, et al. Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield if intraepithelial neoplasia in ulcerative colits. Gastroenterology 2007; 132: 874-82.  

6. Polglase AL, McLaren WJ, Skinner SA, et al. A fluorescence confocal endomicroscope for in vivo microscopy of the upper- and the lower-GI tract. Gastrointest Endosc 2005; 62: 686-95.  

7. Kiesslich R, Galle PR, Naurath MF. Atlas of Endomicroscopy 2008.  

8. Kiesslich R, Goetz M, Neurath MF. Virtual histology. Best Pract Res Clin Gastroenterol 2008; 22: 883-97.  

9. Jian-Na Z, Yan-Qing L, You-An Z, et al. Classification of gastric pit patterns by confocal endomicroscopy. Gastrointest Endosc 2008; 67: 843-53.

10. Vakil N, van Zanten SV, Kahrilas P, et al. The Montreal definition and classification of gastroesophageal reflux disease: a global evidence-based consensus. Am J Gastroenterol 2006; 101: 1900-20.

11. Kiesslich R, Gossner L, Dahlmann A i wsp. In vivo histology of Barrett’s oesophagus and associated neoplasias by confocal laser endomicroscopy. Clin Gastroenterol Hepatol 2006; 8: 979-87.

12. Dunbar KB, Okolo P 3rd, Montgomery E, Canto MI. Confocal laser endomicroscopy in Barrett’s esophagus and endoscopically inapparent Barrett’s neoplasia: a prospective, randomized, doubled-blind, controlled, crossover trial. Gastrointest Endosc 2009; 70: 645-54.

13. Gossner L. Potential contribution of novel imaging modalities in non-erosive reflux disease. Best Pract Res Clin Gastroenterol 2008; 22: 617-24.

14. Pech O, Rabenstein T, Manner H, et al. Confocal laser endomicroscopy for in vivo diagnosis of early squamous cell carcinoma in the esophagus. Clin Gastroenterol Hepatol 2008; 6: 89-94.

15. Liu H, Li YQ, Yu T, et al. Confocal laser endomicroscopy for superficial esophageal squamous cell carcinoma. Endoscopy 2009; 41: 99-106.

16. Yang JM, Chen L, Fan YL, et al. Endoscopic patterns of gastric mucosa and its clinicopathological significance. World J Gastroenterol 2003; 9: 2552-6.

17. Kiesslich R, Goetz M, Burg J, et al. Diagnosing Helicobacter pylori in vivo by confocal laser endoscopy. Gastroenterology 2005; 128: 2119-23.

18. Kitabatake S, Niwa Y, Miyahara R, et al. Confocal endomicroscopy for the diagnosis of gastric cancer in vivo. Endoscopy 2006; 38: 1110-4.

19. Yeoh KG, Salto-Tellez M, Khor CJL, et al. Confocal laser endoscopy is useful for in vivo rapid diagnosis of gastric neoplazja and pre-neoplazja. Paper presented at DDW, Chicago, 14-19 May 2005.

20. Trovato C, Sonzogni A, Ravizza D, et al. Coeliac disease: in vivo diagnosis by confocal endomicroscopy. Gastrointest Endosc 2007; 65: 1096-9.

21. Leong RWL, Koo JHK, Meredith CG, et al. Confocal Laser endomicroscopy in the diagnosis of coeliac disease. J Gastroenterol Hepatol 2006; 21: A1267.

22. Leong RWL, Nquyen NQ, Meredith CG, et al. In vivo confocal endomicroscopy in the diagnosis and evaluation of celiac disease. Gastroenterology 2008; 135: 1870-6.

23. Li CQ, Xie XJ, Yu T, et al. Classification of inflammation activity in ulcerative colitis by confocal laser endomicroscopy. Am J Gastroenterol 2010; 105: 1391-6.

24. Kiesslich R, Neurath MF. Surveillance colonoscopy in ulcerative colitis: magnifying chromoendoscopy in the spotlight. Gut 2004; 53: 165-7.

25. Kiesslich R, Hoffman A, Goetz M, et al. In vivo diagnosis of collagenous colitis by confocal endomicroscopy. Gut 2006; 55: 591-2.