DNA cytometry of malignant and benign tumors of oral cavity

WSTĘP


Podstawowa wiedza o chorobie, czyli rozpoznanie histopatologiczne, stopień zróżnicowania komórek i ich klasyfikacja, nie wystarcza już do oceny dynamiki, a zwłaszcza rokowania w chorobie nowotworowej. Problemy związane z leczeniem i prognozowaniem przebiegu choroby kierują uwagę klinicystów i patologów na budowę oraz aktywność proliferacyjną badanej tkanki. Obecnie zwraca się również uwagę na ultrastrukturalne różnice budowy na poziomie cytoplazmy i jąder komórkowych. Z doniesień wielu autorów wynika, iż centralne części guza są często lepiej zróżnicowane niż jego obrzeże, które naciekając okoliczne tkanki świadczy o agresywnym charakterze choroby [3, 4, 12].

Dla raków płaskonabłonkowych dojrzałość cytoplazmy oznacza tworzenie pereł rogowych, występowanie komórek kolczystych, licznych desmosomów i mostków cytoplazmatycznych oraz występowanie błon podstawnych pomiędzy tkanką nowotworową a jej podścieliskiem [5, 12].

Dowiedziono, iż liczba komórek nowotworowych w trakcie podziału mitotycznego jest wprost proporcjonalna do masy guza. Możliwości badania DNA w fazach cyklu życiowego pojedynczych komórek i ich populacji, znacznie rozszerzyła wiedzę o biologii komórek nowotworowych. Badając ilość jądrowego DNA w różnych nowotworach stwierdzono, iż w nowotworach o typie G-1 przeważa diploidalna ilość DNA. Natomiast w guzach o wyższej złośliwości G-2, G-3 zaczynają częściej występować cechy aneuploidalno-poliploidalne. Stanowi to podstawę stwierdzenia, że guzy aneuploidalne znacznie gorzej rokują [1, 10, 13, 15, 16]. Jednak inni autorzy uważają, iż nie ma prostej zależności między ploidią DNA a agresywnością nowotworu [2, 3, 7]. Postanowiono przebadać więc grupę nowotworów niezłośliwych dla wykazania w nich ilości jądrowego DNA i porównania z zawartością DNA w nowotworach złośliwych.



MATERIAŁ I METODA


Badania wykonano u 30 chorych, rutynowo leczonych w Klinice Chirurgii Szczękowo-Twarzowej Akademii Medycznej w Poznaniu, obojga płci, w wieku od 35 do 74 lat, u których stwierdzono:

– w 14 przypadkach raka płaskonabłonkowego języka i dna jamy ustnej w II i III^o zaawansowania klinicznego,

– 1 przypadek raka podstawnokomórkowego skóry nosa,

– 13 chorych z brodawczakami błon śluzowych jamy ustnej i skóry twarzy,

– 1 przypadek tłuszczaka,

– 1 przypadek włókniaka policzka.



Materiał tkankowy badano w Katedrze Immunologii Klinicznej Akademii Medycznej przy użyciu zestawu Cycle Test^TM Plus firmy Becton Dickinson. Tkankę pobieraną podczas zabiegu operacyjnego zamrażano i przechowywano w temperaturze -70^oC. Przed wykonaniem badań materiał rozmrażano i rozdrabniano na małe fragmenty w buforowanej soli fizjologicznej. Zawiesinę komórek uzyskiwano przez wielokrotną aspirację do strzykawki. Do testu używano 5 x 10⁵ komórek. Wzorcem normoploidii była zawartość DNA w ludzkich limfocytach dodawanych do ocenianych komórek w stosunku 2:1. Tak przygotowaną zawiesinę komórek wirowano przez 5 min, 1 000 obr. /min. Po odrzuceniu supernatantu do osadu wprowadzono 250 ul buforu trypsynowego w celu uzyskania permeabilizacji błon komórkowych. Po 10-minutowej inkubacji trypsynę blokowano przez dodanie inhibitora tego enzymu, równocześnie z enzymem powodującym degradację RNA (RNaza). Po 10 min podawano roztwór jodku propidyny (PI). W tym środowisku próbki inkubowano przez 10 min w temp. 4^oC, bez dostępu światła. Po przefiltrowaniu próbki przez filtr nylonowy (50 um) przeprowadzono akwizycję i analizę danych przy pomocy aparatu FACScan (BD) i programu LYSIS II. Oceniano 10 tys. komórek przy 1 024 kanałach fluorescencji. Obecność populacji aneuploidalnej stwierdzono na podstawie zidentyfikowanego dodatkowego piku, obok pików G_o/G₁ i G₂/M populacji normoploidalnej.



Analiza statystyczna


Uzyskane wyniki analizowano z zastosowaniem testów T-studenta i Mann-Whitney’a, przyjmując graniczny poziom istotności p=0,05.



WYNIKI


Otrzymane dane zaskoczyły autorów głównie w odniesieniu do nowotworów niezłośliwych, ponieważ w tej grupie spodziewali się otrzymać tylko histogramy diploidalne.



· Ocena ploidii DNA złośliwych i niezłośliwych nowotworów twarzoczaszki.

Obecność komórek o aneuploidalnej zawartości DNA stwierdzono zarówno w materiale pochodzącym od chorych z rakiem płaskonabłonkowym, jak i w materiale obejmującym chorych z nowotworami niezłośliwymi (włókniak, tłuszczak i brodawczak). Odsetek guzów aneuploidalnych w obu badanych grupach był taki sam i wynosił 26 proc.



· Ocena odsetka komórek występujących w fazie S i G₂M cyklu komórkowego.

Histogramy (ryc. 1. i 2.) obrazujące intensywność fluorescencji jodku propidyny, stechiometrycznie reagującego z komórkowym DNA, pozwalają nie tylko na ocenę ploidii, ale także na ocenę odsetka komórek występujących w poszczególnych fazach cyklu komórkowego. W obu grupach badanego materiału oceniano odsetek komórek występujących w fazie S, G₂M< oraz S+G₂M. Odsetek komórek występujących w fazie S cyklu życiowego komórki w grupie chorych z rakiem średnio wynosił 8 proc., a w grupie chorych z nowotworem niezłośliwym 7 proc. (ryc. 3.). Średni odsetek komórek w fazie G₂M wynosił odpowiednio 6 i 10 proc. (ryc. 4.). Łączny odsetek komórek faz S+G₂M dla grupy chorych z rakiem wynosił średnio 14 proc., a dla chorych z nowotworem łagodnym 18 proc. (ryc. 5.).

W ocenie statystycznej uzyskanych wyników nie stwierdzono znamiennych różnic między poszczególnymi grupami badanego materiału.


OMÓWIENIE


Uzyskane wyniki, co prawda na małej grupie chorych oraz ich ocena statystyczna potwierdzają, na podstawie rozkładu histogramów w obu grupach, że ploidia DNA nie może być podstawą do postawienia diagnozy o stopniu złośliwości nowotworu [18]. W wielu publikacjach podkreśla się jednakże dużą wartość prognostyczną ploidii DNA, szczególnie w odniesieniu do guzów złośliwych w bardziej zaawansowanych stanach klinicznych [5, 6, 8, 9, 11, 14]. Na uwagę zasługują również opinie innych autorów, którzy nie znajdują prostego związku pomiędzy stopniem złośliwości guza a DNA-histogramem [2, 3, 7]. Praktyka kliniczna dowodzi, że guzy złośliwe diploidalne dają wznowy i przerzuty do regionalnych węzłów chłonnych [4, 6, 17, 19]. Również ocena samego DNA-histogramu nie może być podstawą do różnicowania między złośliwymi a niezłośliwymi guzami [18]. Na podstawie przeprowadzonych badań i dostępnego piśmiennictwa należy stwierdzić, że badanie zawartości DNA w jądrach komórek nowotworowych pozwoliło poszerzyć znacznie naszą wiedzę o guzach nowotworowych i przebiegu choroby nowotworowej, jednakże nie jest badaniem jednoznacznie rozstrzygającym.


PIŚMIENNICTWO

1. Balsara BR, Borges AM, Pradhan SA, Rajpal RM, Bhisey AN. Flow cytometric DNA analysis of squamous cell carcinomas of the oral cavity: correlation with clinical and histopathological features. Eur J Cancer B Oral Oncol 1994; 2: 98-101.

2. Barlogie B, Raber M, Shumann J. Flow cytometry in clinical cancer research. Cancer Rec 1983; 43: 3982-97.

3. Farrar W, Sickle-Santanello B, Keyhani-Rafagha S. Follow up on flow cytometric DNA analysis of squamous cell carcinoma of the tongue. Am J Surg 1989; 157: 377-80.

4. Golusiński W, Szmeja Z, Stojałowska A, Biczysko W, Majewski P, Kopeć T. Badania DNA-ploidii u chorych na raka krtani. Otolaryng Pol 1994; 4: 322-6.

5. Golusiński W, Szmeja Z, Olafson J, Biczysko W, Krygier-Stojałowska A, Majewski P. Wartość diagnostyczna i prognostyczna onkogenu p53 wybranych markerów nowotworowych (Ki67, PCNA, DNA ploidii) ultrastruktury u chorych na raka krtani. Otolaryng Pol 1996; 6: 607-17.

6. Golusiński W, Szmeja Z, Krygier-Stojałowska A, Biczysko W. Wartość cytometrii przepływowej DNA w ocenie zdolności proliferacyjnej komórek nowotworowych u chorych na raka krtani. Otolaryng Pol 1998; 4: 411-17.

7. Guo Y, Desanto L, Osctinsky G. Prognostic implications of nuclear DNA content in head and neck cancer. Otolaryng Head Neck Surg 1989; 100: 95-8.

8. Kolotas C, Tonus C, Ballas D, Cernea M, Vogt HG, Martin T, Strassmann G, Zamboglou N. Clinica rellevance of tumor ploidy and micronucleus formation for oral cavity cancer. Tumori 1999; 85, 4: 253-8.

9. Kusuzaki K, Murata H, Takeshita H, Hirata M, Hashiguchi S, Tsuji Y, Nakamura S, Ashihara T, Hirasawa Y. Usefulness of cytofluorometric DNA ploidy analysis in distinguishing benign cartilaginous tumors from chondrosarcomas. Mod Pathol 1999; 12: 863-72.

10. Lewandowski L, Adamska K, Osmola K, Filipiak K, Warchoł W. Badania nad ploidią DNA raków płaskonabłonkowych jamy ustnej. Now Lek 1998; 67, 4: 457-66.

11. Murata H, Kusuzuki K, Takeshita H, Hirata M, Hashiguchi S, Ashihara T, Hirasawa Y. Cytofluorometric DNA ploidy analysis in giant cell tumor of bone: histologic and prognostic value. Cancer Lett 1999; 136, 2: 223-9.

12. Nowaczyk MT, Dworacki G, Majewski P, Biczysko W, Żeromski J. Wielokierunkowa ocena morfologiczna obwodowych części nowotworów jamy ustnej. Czas Stomat 1998; 5: 344-8.

13. Osmola K, Lewandowski L, Adamska K, Filipiak K. Zastosowanie cytometrycznego oznaczania DNA w ocenie nowotworów jamy ustnej. Czas Stomat 1998; 51, 1: 37-40.

14. Obrębowska A, Spaczyński M. Cytometria DNA w diagnostyce onkologicznej. Współcz Onkol 1997; 2: 13-15.

15. Perotti D, Corletto V, Giardini R, Parafioriti A, Fossati-Bellani F, Luksch R. Retrospective analysis of ploidy primary osseeous and extrosseous Ewing family tumors in children. Tumori 1998; 84: 493-8.

16. Pinto AE, Fonesca I, Soares J. The clinical relevance of ploidy and S-phase Fraction determination in salivary gland tumors; a flow cytometric study of 97 cases. Cancer 1999; 85: 273-81.

17. Skowronek J. Analiza zawartości DNA metodą video-imaging w komórkach czerniaków złośliwych. Nowotwory 1997; 1: 89-99.

18. Skowronek J. Ploidia DNA jako czynnik rokowniczy w nowotworach. Nowotwory 1997; 2: 343-53.

19. Wennerberg J, Baldetorp B. There is no difference in the distribution of flow cytometric (FCM) DNA-indicesbeteween node-positive and node-negative squamous cell carcinomas of the head and neck. Int Symp on Metast in Head and Neck Cancer Germany, Kiel, Brith J Cancer 1998; 14.


ADRES DO KORESPONDENCJI

dr n. med. Marian Tomasz Nowaczyk

Klinika Chirurgii Szczękowo-Twarzowej

Instytutu Stomatologii

Akademii Medycznej

ul. Przybyszewskiego 49

60-355 Poznań

tel. (061) 869 14 01