Detection and clinical significance of micrometastases in bone marrow of patients with breast cancer

Rak piersi jest najczęściej występującym w Polsce nowotworem złośliwym u kobiet. Rocznie notuje się ok. 11 tys. nowych zachorowań [1]. Fakt, iż rak piersi stanowi ogromny problem społeczny powoduje, że od dziesięcioleci wysiłki naukowców i klinicystów onkologów skupione są na coraz dokładniejszym poznawaniu epidemiologii, etiologii, czynników ryzyka występowania tego nowotworu. Pozwoliło to na wyodrębnienie grupy kobiet o zwiększonym ryzyku zachorowania na raka piersi. Upowszechnienie mammografii jako narzędzia badań przesiewowych spowodowało, że w krajach, gdzie programami skryningowymi objęte są wszystkie kobiety, większość przypadków raka piersi wykrywana jest w stadium przedklinicznym. Poznanie biologii nowotworu dało podstawy do standardowego stosowania systemowego leczenia adjuwantowego lub neoadjuwantowego, wychodząc z założenia, że nawet miejscowo zaawansowany nowotwór może, mimo radykalnego leczenia operacyjnego, ulec po miesiącach lub latach uogólnieniu.



Wprowadzenie badań przesiewowych oraz chemioterapii i/lub hormonoterapii z skojarzeniu z leczeniem operacyjnym pozwoliło na znaczne zmniejszenie ryzyka zgonu z powodu raka piersi. W latach dziewięćdziesiątych XX w. po raz pierwszy zaobserwowano m.in. w Stanach Zjednoczonych i Wielkiej Brytanii spadek umieralności na raka piersi, mimo ciągłej tendencji wzrostowej zapadalności na ten nowotwór. Jednym z istotnych czynników decydujących o sukcesie leczenia jest precyzyjne ustalenie stopnia zaawansowania choroby. Dotyczy to zarówno przypadków kwalifikujących się do operacji jako leczenia pierwszego rzutu, jak i tych, gdzie nowotwór jest zaawansowany miejscowo. W tej sytuacji zastosowanie systemowej terapii indukcyjnej umożliwia radykalny zabieg operacyjny i łącznie z uzupełniającą radioterapią poprawia odległe wyniki leczenia.



Standardy onkologiczne zakładają, że u chorych, które pierwotnie kwalifikują się do leczenia operacyjnego należy poza oceną guza pierwotnego (badanie kliniczne, potwierdzenie histopatologiczne, obustronna mammografia i USG piersi) wykonać badanie radiologiczne klatki piersiowej i badanie ginekologiczne. W przypadkach stwierdzenia guza o średnicy powyżej 5 cm lub zajęcia węzłów chłonnych ocenionego jako N2 należy rozszerzyć zakres badań dla oceny ewentualnego rozprzestrzenienia procesu nowotworowego. Zaleca się m. in. badanie scyntygraficzne kośćca [2]. Wybór optymalnego leczenia na podstawie stopnia zaawansowania oraz innych klasycznych czynników rokowniczych (stan receptorów estrogenowych i progesteronu, stopień złośliwości histologicznej, typ histologiczny) jest postępowaniem standardowym. Jednak mimo zastosowania klasycznych metod oceny stopnia zaawansowania oraz klasycznych czynników rokowniczych, wśród kobiet zaliczanych do grupy o dobrym rokowaniu (brak zajęcia regionalnych węzłów chłonnych) notuje się do 30 proc. nawrotów choroby w ciągu 10 lat obserwacji. Wynika to z biologii nowotworu, który w wielu przypadkach we wczesnych fazach swojego rozwoju może rozprzestrzeniać się pod postacią mikroprzerzutów niemożliwych do wykrycia klasycznymi metodami diagnostycznymi.



Rak piersi, jak każdy nowotwór, powstaje wskutek ciągu wydarzeń mutacyjnych, doprowadzających do powstania komórek o różnym stopniu odróżnicowania morfologicznego, biologicznego i genetycznego od komórki macierzystej. Guz pierwotny jest strukturą heterogenną, zawiera komórki będące na różnych etapach ciągu mutacyjnego. Część komórek wcześnie nabywa zdolności penetracji do światła naczyń krwionośnych, migracji z krwią krążącą, ponownego przenikania przez śródbłonki naczyń włosowatych narządów, zasiedlania się w przestrzeniach okołonaczyniowych i tworzenia tam stosownego dla siebie środowiska, umożliwiającego powstanie ogniska przerzutowego.

Już od wielu lat wykrywano pojedyncze komórki bądź skupiska komórek raka piersi w węzłach chłonnych, krwi obwodowej, szpiku kostnym [3]. Jednak do chwili obecnej nie udało się jednoznacznie określić znaczenia klinicznego obecności tych komórek. Do tej pory wielu badaczy twierdzi, że obecność mikroprzerzutów w regionalnych węzłach chłonnych nie pogarsza rokowania. Podobnie mimo stwierdzania u ponad 30 proc. kobiet komórek nabłonkowych w szpiku kostnym w momencie rozpoznania raka piersi po przeprowadzonym skutecznym leczeniu skojarzonym (terapia lokoregionalna+systemowa) po roku jedynie u 2 proc. pacjentek w dalszym ciągu obserwuje się obecność tych komórek [4].

O braku jednoznacznego stanowiska w kwestii znaczenia rokowniczego tych komórek świadczą też różnice terminologiczne w pracach analizujących ten temat [5]. Wielu autorów preferuje określenia komórki guza lub rozsiane komórki nabłonkowe, co wydaje się trafniej określać charakter zjawiska. Są to pojedyncze komórki lub niewielkie ich skupiska, które oddzieliły się od pierwotnego złośliwego guza nabłonkowego i z biegiem krwi lub chłonki zawędrowały do obcych im ontogenetycznie tkanek lub narządów, np. do wywodzącego się z mezenchymy szpiku kostnego. Ich obecność w innych niż pierś narządach niewątpliwie świadczy o ich złośliwym charakterze, jednak nie dysponuje się obecnie metodami mogącymi jednoznacznie potwierdzić ich zdolności klonogenne i możliwość rozwoju w makroprzerzuty. Obecnie jedynie ich detekcja, a następnie wieloletnia obserwacja grup kobiet wykazujących oraz nie wykazujących obecności tych komórek oraz ocena wyników obserwacji za pomocą metod statystycznych może dać odpowiedź na to pytanie. Dlatego oprócz doskonalenia metod detekcji rozsianych komórek nabłonkowych należy dążyć do ich fenotypowego i genotypowego scharakteryzowania w odniesieniu do komórek guza pierwotnego [6]. Może to stanowić w przyszłości kolejny element służący indywidualizacji leczenia (tzw. tailored therapy). Jest to jednak kwestia przyszłości, gdyż rozsiane komórki epitelialne trudno poddać takiej analizie ze względu na ich niewielką liczbę. Co więcej, mimo ponaddwudziestoletnich doświadczeń do tej pory nie wypracowano standaryzowanej metody wykrywania komórek nabłonkowych wśród komórek mezenchymalnych. Obecnie najpowszechniej używa się technik immunohistochemnicznych oraz molekularnej analizy badanego materiału [5].

Większość badaczy uzyskuje szpik kostny drogą aspiracji z talerza kości biodrowej w znieczuleniu ogólnym jednoczasowo z przeprowadzanym radykalnym zabiegiem operacyjnym. Z uzyskanego aspiratu szpiku wyizolowuje się populację komórek jednojądrzastych, np. przy użyciu techniki wirowania w gradiencie stężeń. Następnie materiał jest zagęszczany w cytowirówce, a uzyskany osad utrwalany na szkiełkach mikroskopowych. Tak wyodrębnione komórki poddaje się działaniu przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko specyficznym tylko dla komórek nabłonkowych epitopom. Początkowo za cel przyjęto antygeny występujące w błonie komórkowej: nabłonkowy antygen błonowy (EMA), grupę polimorficznych mucyn nabłonkowych (PEM) - wśród nich antygen MUC-1 - oraz rzadziej antygenów HMFG i TAG [7]. Jednak w ostatnich latach donoszono o obecności tych antygenów również na powierzchni komórek pochodzenia mezenchymalnego - prekursorach linii erytroidalnej, komórkach plazmatycznych, komórkach limfoidalnych [7-9]. Dlatego ocenia się, że uzyskiwano wiele wyników fałszywie pozytywnych. Bardziej specyficzne wydają się być elementy cytoszkieletu, głównie białka z grupy cytokeratyn (CK). Najwyższą czułość i swoistość wykazują testy z użyciem poliwalentnych przeciwciał przeciwko cytokeratynom 8, 18 i 19 [10]. Stosowanie przeciwciał przeciwko pojedynczym cytokeratynom, np. 18, może prowadzić do fałszywie ujemnych wyników, gdyż obserwowano zmniejszoną ekspresję tych cząsteczek w komórkach o jednoznacznie nabłonkowym charakterze, co świadczyło o dużym stopniu odróżnicowania od komórek macierzystych i korelowało z innymi negatywnymi czynnikami prognostycznymi [11].



Metodami przewyższającymi czułością techniki immunohistochemiczne są badania molekularne. Najczęściej wykrywa się przekaźnikowy RNA z sekwencjami kodującymi elementy cytoszkieletu, np. cytokeratyn. Metoda rtPCR (odwrotna transkryptazowa polimerazowa reakcja łańcuchowa) polega na odwrotnej transkrypcji mRNA na komplementarny do niego odcinek DNA, a następnie jego amplifikację techniką polimerazowej reakcji łańcuchowej [12].



Inną metodą molekularną jest fluorescencyjna hybrydyzacja in situ, skierowana bezpośrednio przeciwko kodującemu daną cytokeratynę mRNA. Zaletą tej techniki jest niski odsetek fałszywie dodatnich wyników.



Do detekcji rozsianych komórek nabłonkowych zastosowano również cytometrię przepływową, jednak wyniki uzyskane w ten sposób są niejednoznaczne [13].



Wykorzystano również metody stosowane do oczyszczania materiału przeszczepowego - szpiku bądź komórek krwiotwórczych krwi obwodowej. Dokonuje się zarówno selekcji pozytywnej, jak i negatywnej. Bardziej czuła wydaje się być negatywna separacja immunomagnetyczna [14]. Za pomocą przeciwciał antyCD45 sprzężonych z elementem magnetycznym wyodrębnia się z całej populacji komórek jednojądrzastych komórki hematopoetyczne, tworzące typowe struktury rozetkowe, podczas gdy komórki nabłonkowe pozostają niesprzężone. Pozytywne techniki immunomagnetyczne działają odwrotnie - za pomocą przeciwciał przeciwko epitopom nabłonkowym tworzą się struktury rozetkowe, zawierające rozsiane komórki nabłonkowe. Użycie tych metod pozwoliło na ocenę 10 razy większej liczby komórek jednojądrzastych, co zaowocowało 4-krotnym wzrostem częstości i ilości wykrywanych komórek CK-pozytywnych.



W prowadzonych do tej pory badaniach chodzi nie tylko o zwiększenie czułości stosowanych metod - jest to niewątpliwie istotne ze względu na bardzo rzadkie występowanie komórek nabłonkowych wśród mezenchymalnych komórek szpiku. Równie istotne jest jednak zachowanie integralności tych komórek dla oceny ich fenotypu czy też dla oceny nieprawidłowości genetycznych. Krokiem w tym kierunku jest praca Brauna i wsp., w której przedstawiono koekspresję cytokeratyn z innymi antygenami, np. białkiem cerbB-2. Pozytywny wynik podwójnego barwienia immunohistochemicznego może stanowić podstawę do celowanej immunoterapii skierowanej przeciwko białku cerbB-2 [15].



Przedstawione powyżej metody wykrywania rozsianych komórek nabłonkowych różnią się zarówno czułością, jak i swoistością. Między innymi dlatego wiele przeprowadzonych w ostatnich latach badań dostarczyło sprzecznych danych, co uniemożliwia wyciągnięcie jednoznacznych wniosków dotyczących znaczenia klinicznego obecności mikroprzerzutów raka piersi w szpiku.

Pierwsze badania z użyciem metod immunohistochemicznych przeprowadził w 1981 r. Dearnaley z Royal Marsden Hospital. Wieloletnia obserwacja zidentyfikowanej przez niego grupy kobiet z obecnością komórek nabłonkowych w szpiku pozwoliła na stwierdzenie, że czas wolny od choroby i całkowite przeżycia tych chorych były znamiennie statystycznie krótsze niż pacjentek bez mikroprzerzutów w szpiku [16].



Znaczących danych dostarczyła praca Mansi z 1999 r. analizująca 12-letnią obserwację 350 pacjentek [17]. Spośród nich 25,4 proc. wykazywało w momencie rozpoznania choroby obecność w szpiku komórek nabłonkowych, prezentujących nabłonkowy antygen błonowy (EMA) - wiązało się to z krótszym czasem wolnym od choroby i krótszym całkowitym przeżyciem, jednak nie miało charakteru niezależnego czynnika rokowniczego. Wyciągnięto z tego badania wniosek, iż obecność komórek nabłonkowych w szpiku może mieć znaczenie prognostyczne w przypadku, gdy inne niezależne czynniki, jak wielkość guza, naciekanie naczyń, czy zajęcie węzłów chłonnych jest niemożliwe do oceny z powodu, np. przedoperacyjnej chemioterapii.



Pierwszym badaniem oceniającym komórki nowotworowe w szpiku na podstawie pozytywnego wyniku barwień na obecność cytokeratyn była praca Cote z 1991 r. Wykazał on, że stwierdzenie komórek nabłonkowych w szpiku stanowi niezależny czynnik rokowniczy w odniesieniu do prognozowania czasu wolnego od choroby. Wykazał w analizie wieloczynnikowej, że obecność więcej niż 10 komórek CK-pozytywnych wiąże się z wysokim ryzykiem wczesnego nawrotu choroby [18]. Przeciwne wyniki uzyskał Singletary w badaniu, którego wyniki ogłosił też w 1991 r. Oceniał szpik 71 pacjentek, 38 proc. z nich wykazywało obecność komórek z ekspresją cytokeratyn, jednak obserwacja ich losów nie dowiodła żadnego znaczenia prognostycznego tego faktu.



Podobnie Molino, w badaniu opublikowanym w 1997 r. wykazał, że losy 31,1 proc. pacjentek spośród 109-osobowej grupy, u których zidentyfikowano w szpiku komórki CK-pozytywne, nie różniły się ani w zakresie czasu wolnego od choroby, ani całkowitego przeżycia od pacjentek wolnych od mikroprzerzutów w szpiku [19].



Do tej pory największą grupę chorych ocenił w badaniu Diel [20]. U 315 chorych (43 proc.) spośród 727 stwierdził obecność komórek nabłonkowych w szpiku, a 36-miesięczna obserwacja wykazała, że obecność mikroprzerzutów jest niezależnym czynnikiem prognostycznym zarówno w odniesieniu do czasu wolnego od choroby, jak i do całkowitych przeżyć. Co więcej, Diel uznając obecność mikroprzerzutów w szpiku za niekorzystny czynnik rokowniczy przeprowadził badanie kliniczne z zastosowaniem klodronianu w uzupełniającym leczeniu raka piersi, z założeniem zmniejszenia częstości występowania przerzutów do kości [21]. W badaniu wzięły udział 302 pacjentki po operacyjnym leczeniu raka i ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia przerzutów odległych, określanym poprzez pozytywny wynik badania immunocytochemicznego na obecność komórek CK-dodatnich w szpiku kostnym. Obecność przynajmniej jednej komórki raka w pobranym materiale uznawano za zwiększone ryzyko. Chore randomizowane były do dwóch grup: przyjmujących klodronian 1 600 mg dziennie przez 2 lata i otrzymujących placebo. Po 36 mies. obserwacji w grupie stosującej klodronian stwierdzono niższy odsetek przerzutów do kości. W grupie tej zaobserwowano również mniej przerzutów do narządów miąższowych, dłuższy czas wolny od choroby i dłuższe przeżycie. Różnice te były istotne statystycznie. Zmniejszenie liczby przerzutów w kościach to efekt oczekiwany, zgodny z wcześniejszymi doniesieniami [22]. Zaskoczenie wywołało natomiast zmniejszenie liczby przerzutów w narządach miąższowych i wydłużenie przeżycia. Podobne badanie, obejmujące liczniejszą grupę pacjentek potwierdziło ochronny wpływ klodronianu na kości. U pacjentek otrzymujących klodronian stwierdzono mniej przerzutów w kościach, nie powtórzyło się jednak korzystne działanie w stosunku do narządów miąższowych [23]. Inne badanie zakończyło się odmiennymi spostrzeżeniami [24]. Ponieważ badania te mogą nieść bardzo istotne przesłanki praktyczne, a przyniosły różne wyniki, pojawiło się wiele komentarzy i porównań. Celem tych badań było wyjaśnienie roli klodronianu w leczeniu uzupełniającym pacjentek z rakiem piersi. Tylko w badaniu Diela wybrano do pomiarów grupę chorych, u których przed leczeniem uzupełniającym stwierdzano mikroprzerzuty w szpiku kostnym. Być może jest to właśnie grupa pacjentek odnosząca największe korzyści z uzupełniającego leczenia klodronianem. Do tej pory badanie Diela było jedynym, które przenosiło uzyskane wyniki oceny obecności mikroprzerzutów w szpiku na konkretne działania terapeutyczne.



Inny bardzo istotny aspekt wykrywania komórek nabłonkowych w szpiku kostnym przedstawiony został w pracy Janni i wsp., opublikowanej w 2000 r. Oceniano w niej znaczenie prognostyczne mikroprzerzutów w szpiku u pacjentek z pierwszym nawrotem raka piersi. Szereg sprawdzonych czynników rokowniczych, takich jak wielkość guza, zajęcie węzłów chłonnych, wynik badania histopatologicznego czy obecność receptorów estrogenowych i HER-2 stanowi podstawę wyboru metody leczenia i prognozowania w chwili rozpoznania raka piersi. Czynniki te nie mają zastosowania w prognozowaniu przeżycia w przypadku nawrotu choroby. Wiadomo, że w takiej sytuacji rokowanie zależy od miejsca wystąpienia przerzutów, liczby zajętych narządów i czasu, jaki upłynął od zakończenia podstawowego leczenia. Biorąc pod uwagę te czynniki stwierdza się znaczne różnice w przeżyciach poszczególnych grup i stąd poszukiwanie innych czynników, mogących ułatwić prognozowanie przebiegu choroby. Wychodząc z założenia, że jednym z takich czynników może być obecność mikroprzerzutów w szpiku kostnym, Janni i wsp. oceniali szpik 65 pacjentek z nawrotem raka piersi.

Mikroprzerzuty w szpiku stwierdzono u 5 z 32 (16 proc.) pacjentek z nawrotem miejscowym i u 24 z 33 (73 proc.) z przerzutami odległymi. Po badaniu szpiku pacjentki leczono zgodnie z powszechnie obowiązującymi zasadami. Mediana obserwacji wynosiła 37 mies. U pacjentek z nawrotem miejscowym obecność mikroprzerzutów w szpiku kostnym nie miała prognostycznego znaczenia. Inna była sytuacja w grupie chorych z przerzutami odległymi. Przyjmując jako poziom graniczny obecność 2,5 komórek raka na milion komórek szpiku (2,5 x 10^-6) stwierdzono znaczne różnice w przeżyciach. Pacjentki z odległymi przerzutami i mikroprzerzutami >2,5 x 10^-6 komórek guza żyły średnio 6 mies. w porównaniu z 17 mies. w grupie ≤2,5 x 10^-6 komórek guza. Chociaż doniesienie dotyczy małej liczby pacjentek, taką samą tendencję stwierdzono w grupie chorych z przerzutami tylko do kości. Tam przeżycia wynosiły 7,7 i 30 mies. przy poziomach mikroprzerzutów odpowiednio >2,5 x 10-6 i ≤2,5 x 10^-6 komórek guza. Analiza statystyczna wykazała, że różnice te były istotne statystycznie i że obecność mikroprzerzutów w szpiku kostnym stanowiła niezależny czynnik prognostyczny [25].



Wszystkie przedstawione powyżej badania wykorzystywały dla detekcji komórek nabłonkowych w szpiku metody immunohistochemiczne. Inne metody, jak rtPCR, cytometria przepływowa, negatywna separacja immunomagnetyczna stosowano tylko w badaniach mających wykazać ich wyższą czułość i swoistość w porównaniu do klasycznych metod immunohistochemicznych. Nie ma natomiast doniesień na temat losów pacjentek z potwierdzonymi za pomocą tych metod mikroprzerzutami w szpiku.



Wyniki badań przeprowadzonych w ciągu ostatnich 20 lat nie pozwalają na wyciągnięcie jednoznacznych wniosków na temat znaczenia obecności komórek nabłonkowych w szpiku kostnym u pacjentek ze stwierdzonym rakiem piersi. Analiza biologii tego nowotworu potwierdza fakt, że w większości przypadków dochodzi do wczesnego rozsiewu drogą krwiopochodną. Jednak jest jeszcze zbyt wcześnie by zgodzić się z tezą Diela, iż wykrywanie mikroprzerzutów w szpiku kostnym może mieć większe znaczenie prognostyczne niż ocena zajęcia węzłów chłonnych przez proces nowotworowy [6]. Konieczne są dalsze badania odpowiednio licznych grup pacjentek przy użyciu szerokiego panelu przeciwciał monoklonalnych. Pacjentkom z obecnością komórek nabłonkowych w szpiku kostnym, po przeprowadzeniu dodatkowych badań oceniających właściwości fenotypowe i genotypowe tych komórek, będzie można zaproponować zindywidualizowane leczenie przy użyciu wszystkich dostępnych metod w tym immunoterapii, czy też terapii genowej.



PIŚMIENNICTWO

1. Pieńkowski T. Rak piersi. W: Onkologia kliniczna. M. Krzakowski (red). Borgis Wyd. Medyczne, Warszawa 2001; 87-140.
2. Jassem J. Ocena stopnia zaawansowania. W: Rak sutka. J. Jassem. Springer PWN, Warszawa 1998; 168-81.
3. Sloane JP, Ormerod MG, Neville AM. Potential pathological application of immunocytochemical methods to the detection of micrometastases. Cancer Res 1980; 40: 3079-82.
4. Domagała W. Klasyczne i nowe czynniki prognostyczne i predykcyjne w raku sutka u kobiet. Nowotwory 1996; 46: 669.
5. Muller P, Schlimok G. Bone marrow "micrometastases" of epithelial tumors: detection and clinical revelens. J Cancer Res Clin Oncol 2000; 126: 607-18.
6. Diel IJ. Bone marrow staging for breast cancer: is it better than axillary nodal dissectione? Semin Oncol 2001; 28 (3): 236-44.
7. Gendler SJ, Lancaster CA, Taylor-Papadimitriou J, et al. Molecular cloning and expression of human tumor-associated polymorphic epithelial mucin. J Biol Chem 1996; 265: 15286-93.
8. Delsol G, Gatter KC, Stein H, et al. Human lymphoid cells express epithelial membrane antigen. Implication for diagnosis of human neoplasms. Lancet 1984; 11: 1123-29.
9. Brugger W, Buhring HJ, Grunebach F, et al. Expression of MUC-1 epitopes on normal bone marrow: implication of micrometastatic tumor cells. J Clin Oncol 1999; 17: 1535-44.
10. Stosiek P, Kasper M, Karsten U, et al. Detection of cancer metastases in regional lyph nodes: comparitive histological and immunohistological investigations with broad-range anticytokeratin monoclonal antibody A45-B/B3. Neoplasma 1991; 38: 43-7.
11. Schaller G, Fuchs I, Pritze W, et al. Elevated keratin 18 protein indicates a favorable prognosis in patients with breast cancer. Clin Cancer Res 1996; 2: 1879-85.
12. Schoenfeld A, Kruger KH, Gomm I, et al. The detection of micrometastases in the peripheral blood and bone marrow of patients with breast cancer using immunohistochemistry nad reverse transcriptase polymerase chain reaction for keratin 19. Eur J Cancer 1997; 33: 854-61.
13. Nap M, Brockhoff G, Brandt B, et al. Flow cytometric DNA and phenotype analysis in pathology. Virchows Arch 2001; 438: 425-32.
14. Naume B, Borgen E, Nesland JM, et al. Increased sensivity for detection of micrometastases in bone-marrow/peripheral-blood stem-cell products from breast cancer patients by negative immunomagnetic separation. Int J Cancer 1998; 78: 556-60.
15. Braun S, Hepp F, Sommer HL, et al. Tumor-antigen heterogenity of disseminated breast cancer cells: implications for immunotherapy of minimal residual disease. Int J Cancer 1999; 84: 1-5.
16. Dearnaley DP, Ormerod MG, Sloane JP. Micrometastases in breast cancer: long-term follow up of the first patient cohort. Eur J Cancer 1991; 27: 236-9.
17. Mansi JL, Easton D, Berger U, et al. Bone marrow micrometastases in primary breast cancer: prognostic significance after 6 years' follow-up. Eur J Cancer 1991; 27: 1552-5.
18. Cote RJ, Rosen PP, Lesser LM, et al. Prediction of early relapse in patients with operable breast cancer by detection of occult bone marrow micrometastases. J Clin Oncol 1991; 9: 1749-56.
19. Molino A, Pelosi G, Turazza M, et al. Bone marrow micrometastases in 109 breast cancer patients: correlation with clinical and pathological features and prognosis. Breast Cancer Res Treat 1997; 42: 23-30.
20. Diel IJ, KaufmannM, Costa SD, et al. Micrometastatic breast cancer cells in bone marrow at primary surgery: prognostic value in comaprison with nodal status. J Natl Cancer Ins 1996; 88: 1652-64.
21. Diel IJ, Solomayer EF, Costa SD, et al. Reduction in new metastases in breast cancer with adjuvant clodronate treatment. N Engl J Med 1998; 339: 357-63.
22. Kanis JA, Powles T, Paterson AHG, et al. Clodronate decreases the frequency of skeletal metastases in women with breast cancer. Bone 1996; 6: 663-7.
23. Powles TJ, Paterson AHG, Nevantaus A, et al. Adjuvant clodronate reduces the incidence of bone metastases in patients with primary operable breast cancer. Prog Proc Am Soc Clin Oncol 1998; 17: 123a. Abstract.
24. Saarto T, Blomquist C, Virkkunen P, et al. No reduction of bone metastases with adjuvant clodronate treatment in node-positive breast cancer patients (abstract no. 489). Proceedings of American Society of Clinical Oncologists; vol. 18. 35th Annual General Meeting; 1999 May 15-18; Atlanta.
25. Janni W, Gastroph S, Hepp F, et al. Prognostic significance of an increased number of micrometastatic tumor cells in the bone marrow of patients with first reccurence of breast cancer. Cancer 2000; 88: 2252-9.



ADRES DO KORESPONDENCJI

lek. med. Krzysztof Rożnowski

Oddział Chemioterapii

Klinika Onkologii

Akademia Medyczna

ul. Łąkowa 1/2

61-878 Poznań

tel. (061) 854 90 19

e-mail:
krzysztof.roznowski@oncology.am.poznan.pl