Diagnostic value of β-N-acetyl-D-glucosaminidase and endoglin as molecular markers in postmenopausal women with urinary bladder neoplasms

Wstęp

Nienaciekający błony mięśniowej rak pęcherza moczowego (non-muscle invasive bladder cancer) jest jednym z najczęściej występujących nowotworów układu moczowego i stanowi ok. 70% wszystkich nowotworów pęcherza moczowego [1]. W Polsce jest ósmym pod względem częstości zachorowań nowotworem u kobiet. Zgodnie z danymi opublikowanymi przez Zakład Epidemiologii i Prewencji Nowotworów Centrum Onkologii w Warszawie, złośliwe nowotwory pęcherza moczowego u kobiet diagnozowane są w ok. 98% przypadków po 45. r.ż. W 2008 r. odnotowano w Polsce 1281 przypadków tego nowotworu u kobiet, z czego 1261 u osób w przedziale wieku 45–85 lat. W tym samym czasie zmarły z tego powodu 653 kobiety [2].

Nienaciekający rak pęcherza moczowego może długo nie wywoływać żadnych objawów, dlatego niezwykle istotnym zagadnieniem jest odpowiednio wczesna i właściwa diagnostyka choroby. Obecnie w wielu ośrodkach naukowych trwają badania nad wytypowaniem możliwie najczulszych i najbardziej specyficznych markerów molekularnych, których zmiany na poziomie molekularnym można by oznaczać w materiale pozyskiwanym od pacjentów w sposób nieinwazyjny. Coraz częściej podkreśla się w piśmiennictwie naukowym konieczność wytypowania grupy markerów molekularnych tak dobranych, aby w jak najpełniejszy sposób charakteryzowały one proces nowotworowy toczący się w obrębie dróg moczowych [3].

Modyfikacją białek komórkowych, polegającą na przyłączeniu pojedynczych reszt -N-acetylo-D-

-glukozaminy do reszt seryny lub treoniny wiązaniem O-glikozydowym (O-GlcNAc), jest glikozylacja. Do chwili obecnej zidentyfikowano ok. 200 białek komórkowych, w przypadku których potwierdzono występowanie reszt O-GlcNAc. Wyróżnia się wśród nich białka cytoszkieletu, jądrowych kompleksów porowych, chromatyny, polimerazę RNA klasy II i jej czynniki transkrypcyjne, protoonkogeny, supresory nowotworów, jądrowe receptory hormonów, fosfatazy, kinazy, enzymy zaangażowane w procesy metaboliczne i wiele innych. Przyłączenie reszt O-GlcNAc jest modyfikacją wykazującą cechy predestynujące ją do odgrywania istotnej roli w przekazywaniu sygnału, zarówno w komórkach prawidłowych, jak i nowotworowych [4–6].

Enzymem usuwającym reszty O-GlcNAc z białek jądrowych i cytoplazmatycznych jest -N-acetylo-D-glukozaminidaza (MGEA5). Wykazuje ona słabą aktywność hialuronidazy oraz aktywność heksozaminidazy, które związane są z N-końcową częścią enzymu. Sekwencja sklonowanej MGEA5 została zidentyfikowana jako sekwencja odpowiadająca antygenowi 5, ulegającemu ekspresji w komórkach oponiaka (meningioma expressed antigen 5 – MGEA5) i powodującemu odpowiedź immunologiczną u pacjentów. Największą ekspresją tego enzymu charakteryzują się mózg, łożysko i trzustka [6–8].

W sygnalizacji indukowanej przez czynniki z rodziny transformującego czynnika wzrostu betatransforming growth factor beta – TGF) oprócz receptorów TGF typu I i II uczestniczą białka określane jako receptory pomocnicze TGF (accesory receptor/auxiliary receptor). Termin receptor pomocniczy nie jest pojęciem systematycznym, gdyż białka te nie pełnią wszystkich funkcji przypisanych receptorom, natomiast mogą wpływać na aktywność szlaku sygnalizacyjnego TGF. Jednym z takich receptorów jest glikoproteina transbłonowa endoglina (cluster of differentiation 105 – CD105). Jest ona receptorem TGF1 i TGF3. Ulega nadekspresji w śródbłonku naczyń krwionośnych tkanek, w których zachodzi waskularyzacja, a szczególnie w powstających de novo naczyniach krwionośnych nowotworów. Sugeruje się, że endoglina może być rozważana jako użyteczny marker neoangiogenezy w nowotworach [9, 10].

Cel pracy

Celem badań była ocena ekspresji MGEA5 i CD105 na poziomie mRNA metodą real-time reakcji łańcuchowej polimerazy (polymerase chain reaction – PCR) oraz ocena przydatności diagnostycznej i prognostycznej badanych genów jako markerów transformacji nowotworowej pęcherza moczowego u kobiet w wieku pomenopauzalnym.

Materiał i metody

Materiał do badań stanowiły preparaty moczu pobranego od 30 kobiet ze zdiagnozowanymi nowotworami pęcherza moczowego. Średnia wieku w tej grupie wynosiła 64,77 ±9,12 roku. Charakterystyka kliniczno-

-patologiczna preparatów zamieszczona została w tabeli I.

Materiał kontrolny stanowiły preparaty moczu pobranego od 20 kobiet, u których w badaniu ogólnym moczu ani w wywiadzie nie występował krwinkomocz lub krwiomocz, a w badaniu ultrasonograficznym (USG) nie stwierdzono zmian podejrzanych o rozrost nowotworowy. Złuszczone komórki nabłonkowe izolowano z 50 ml moczu. Bezpośrednio po pobraniu próby mocz przechowywano w temperaturze 4^oC do chwili wykonywania oznaczeń, a następnie wirowano przy 2,000 rpm przez 15 min. Otrzymany osad przemywano dwukrotnie zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej (pH 7,6) i przechowywano w temperaturze –80^oC do dalszych oznaczeń.

Izolowanie RNA i synteza cDNA

Całkowite RNA izolowano przy użyciu odczynnika TRI Reagent (Sigma-Aldrich Corp, St. Louis, MO, USA) zgodnie z zaleceniami producenta. Czystość otrzymanych preparatów RNA określano metodą spektrofotometryczną poprzez pomiar absorbancji przy długości fali 260 nm i 280 nm. Przyjętym kryterium czystości DNA była wartość A260/A280 mieszcząca się w granicach 1,8–2,0.

Reakcję odwrotnej transkrypcji przeprowadzano przy użyciu zestawu PCR Kit ver. 3.0 (Takara Bio Inc. Japonia) zgodnie z zaleceniami producenta. cDNA przechowywano w temperaturze –20C.

Analiza ilościowa produktu amplifikacji w czasie rzeczywistym – reakcja real-time PCR

Otrzymany RNA stanowił matrycę w reakcji real-time PCR do oznaczenia liczby kopii mRNA dla genu MGEA5 i endogliny. Użyta mieszanina reakcyjna zawierała: 0,5 µl cDNA, 5 µl TaqMan® Universal PCR MasterMix, 0,5 µl 20 × TaqMan® Gene Expression Assays

i 4 l H₂O. Real-time PCR prowadzono w urządzeniu Mastercycler®ep realplex (Eppendorf). Początkowa ilość matrycy wyznaczana była na podstawie parametru Ct (teoretyczny numer cyklu, przy którym wartość fluorescencji jest wyższa niż przyjęta arbitralnie wartość graniczna). Pomiar wartości Ct wykonano w dwóch powtórzeniach, jako gen referencyjny wykorzystano GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase). Do badań zastosowano następujące sondy TaqMan® Gene Expression Assays (Applied Biosystems, USA): MGEA5 – Hs00201970_m1; CD105 – Hs00923996m1; GAPDH – Hs00266705g1.

Analizy statystycznej wyników dokonano przy użyciu programu komputerowego STATISTICA wersja 9.0 (StatSoft, Poland) i MedCalc wersja 6.14 (MedCalc Software, Belgia). Do oceny rozkładów wykorzystano test Kołmogorowa-Smirnowa i po stwierdzeniu rozkładów odmiennych od normalnych do dalszych obliczeń stosowano testy nieparametryczne – U Manna-Whitneya i Kruskala-Wallisa. Wyliczano także współczynnik skoś-

ności, a ponieważ przybierał on wartości niższe niż 1,5, stosowano do obliczeń średnią arytmetyczną oraz odchylenie standardowe (standard deviation – SD). Za istotną statystycznie przyjęto wartość p < 0,05.

Diagnostyczną wartość progową dla MGEA5 i CD105 wyznaczono na podstawie krzywej ROC (receiver operating characteristic). Dla każdej wartości progowej obliczano czułość i swoistość. W oparciu o obliczone parametry utworzono wykres zależności czułości od wartości (100-swoistość). Wykres ten – krzywa ROC – posłużył do oceny zdolności rozdzielczej testów diagnostycznych. Pole pod krzywą (area under curve) –

ROC-AUC – było sprawdzianem zdolności rozdzielczej testu. Za optymalną wartość graniczną dla MGEA5 uznano wartość 98,3, natomiast dla CD105 – 2,0.

Wyniki

Ekspresję mRNA dla genu MGEA5 stwierdzono w 27/30 (90%) preparatach nowotworowych, natomiast uwzględniając wyznaczoną normę – w 23/30 (76,7%). W grupie kontrolnej ekspresja ta wynosiła odpowiednio 20/20 (100%) i zgodnie z wyznaczoną normą – 6/20 (30%).

Częstość wykrywania ekspresji mRNA dla MGEA5 w zależności od typu nowotworu przedstawiała się następująco: w PUNLMP – u 5/6 (83,3%) pacjentek, w carcinoma urotheliale – u 18/24 (75%). Czułość MGEA5 wynosiła 85,2%, a swoistość – 95,0%. Pole pod krzywą ROC wynosiło 0,92 (ryc. 1.).

Rozkład wartości relatywnych charakteryzujących ekspresję mRNA dla genu MGEA5 w odniesieniu do wartości progowej przedstawia rycina 2.

W przypadku genu dla CD105 ekspresję stwierdzono w 14/30 (46,7%) preparatach nowotworowych i wartość ta była identyczna po uwzględnieniu wartości progowej. W grupie kontrolnej ekspresja ta wynosiła odpowiednio 5/20 (25%), natomiast zgodnie z wyznaczoną normą 0/20 (0%). Częstość wykrywania ekspresji mRNA dla endogliny w zależności od typu nowotworu przedstawiała się następująco: w PUNLMP – u 0/6 (0%) pacjentek, w carcinoma urotheliale – u 14/24 (58,3%). Czułość CD105 wynosiła 100%, a swoistość 80,0%. Pole pod krzywą ROC wynosiło 0,98 (ryc. 3.).

Rozkład wartości relatywnych charakteryzujących ekspresję mRNA dla genu CD105 w odniesieniu do wartości progowej przedstawia rycina 4.

Dyskusja

Choroba nowotworowa cechuje się zwiększeniem tempa proliferacji komórek, a tym samym zwiększeniem stopnia anaplazji. Procesom tym towarzyszy dysfunkcja mechanizmów regulacyjnych oraz naprawczych, odpowiedzialnych za prawidłowy przebieg cyklu komórkowego, metabolizm, różnicowanie, wzrost i odnowę tkanek, jak również tworzenie naczyń krwionośnych [1]. W walce z chorobą nowotworową podstawowe znaczenie ma jej wykrycie w jak najwcześniejszym stadium. W przypadku diagnozowania nowotworów pęcherza moczowego za metody pomocne uważane są zarówno badania podmiotowe, jak i przedmiotowe, natomiast ostateczne rozpoznanie można postawić na podstawie badania cystoskopowego i histopatologicznego [11]. Nieliczne są natomiast informacje o przydatności badania wybranych markerów molekularnych w płynach biologicznych w diagnostyce onkologicznej zmian nowotworowych, w tym nowotworów pęcherza moczowego [3].

Monitorowanie ekspresji genu MGEA5 przy zastosowaniu metody real-time PCR w nowotworach pęcherza moczowego wydaje się obiecujące z uwagi na wysoką czułość (85,2%) i swoistość (95,0%) tego markera molekularnego. Ponadto wyznaczona wartość progowa 98,3 pozwala na precyzyjne oddzielenie od siebie populacji kobiet chorych na nowotwory pęcherza moczowego od grupy kobiet zdrowych.

Gen MGEA5 i kodowane przez niego białko są stosunkowo słabo scharakteryzowane w aspekcie udziału w procesie transformacji nowotworowej. Wiadomo jednak, że nadekspresja MGEA5 powoduje zaburzenia cyklu komórkowego. Mechanizm tych zaburzeń może być różny, ale w przypadku nadekspresji omawianego enzymu dochodzi do zmian w fosforylacji białek, szczególnie pRb, opóźnienia przejścia przez fazę M oraz zakłócenia normalnej ekspresji cyklin. Modyfikacja czynników transkrypcyjnych przez reszty O-GlcNAc może wpływać na ich stabilność, wewnątrzkomórkową lokalizację, aktywność oraz interakcje z innymi białkami kompleksów transkrypcyjnych lub DNA. Uważa się, że zachowanie równowagi pomiędzy O-glikozylacją a fosforylacją ma kluczowe znaczenie dla aktywności czynników transkrypcyjnych i ich zdolności do regulowania ekspresji genów, w tym także tych zaangażowanych w procesy nowotworzenia [6, 12].

Proces angiogenezy jest nierozerwalnie związany z progresją nowotworu, a także z jego przerzutowaniem. Liczba czynników stymulujących ten proces jest dość znaczna, niemniej jednym z częściej rozważanych w aspekcie typowania molekularnych markerów nowotworzenia jest endoglina. Wydaje się, że ma ona istotne znaczenie w takich nowotworach, jak: rak piersi, jajnika, endometrium, prostaty czy pęcherza moczowego [13, 14]. Uzyskane przez nas wyniki wskazują, że oznaczanie ekspresji endogliny na poziomie mRNA może stać się użytecznym wskaźnikiem do diagnozowania złośliwych procesów nowotworowych toczących się w obrębie pęcherza moczowego u kobiet w wieku pomenopauzalnym, gdyż ekspresji tego genu nie obserwuje się u osób zdrowych i tych, u których zdiagnozowano PUNLMP. Na podkreślenie zasługuje także wysoka czułość (100%) i swoistość (80,0%) tego potencjalnego markera.

Wyniki przeprowadzonych przez nas badań wskazują, że określanie ekspresji MGEA5 i CD105 na poziomie mRNA metodą real-time może stać się użytecznym markerem w diagnozowaniu i prognozowaniu nowotworów pęcherza moczowego u kobiet w wieku pomenopauzalnym, dzięki któremu możliwe będzie ograniczenie liczby wykonywanych cystoskopii. Badania te jednak wymagają kontynuowania i przebadania większej liczby chorych kobiet.



Praca wykonana z funduszy pracy własnej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi nr 502–19–842.

Piśmiennictwo

 1. Kompier LC, van Tilborg AA, Zwarthoff EC. Bladder cancer: novel molecular characteristics, diagnostic, and therapeutic implications. Urol Oncol 2010; 28: 91-6.

 2. Krajowy Rejestr Nowotworów.

 3. Yutkin V, Nisman B, Pode D. Can urinary biomarkers replace cystoscopic examination in bladder cancer surveillance? Expert Rev Anticancer Ther 2010; 10: 787-90.

 4. Slawson C, Housley MP, Hart GW. O-GlcNAc cycling: how a single sugar post-translational modification is changing the way we think about signaling networks. J Cell Biochem 2006; 97: 71-83.

 5. Kudlow JE. Post-translational modification by O-GlcNAc: another way to change protein function. J Cell Biochem 2006; 98: 1062-75.

 6. Krześlak A. Wpływ modyfikacji białek komórkowych przez O-GlcNAc na proces przekazywania sygnału. Postępy Biochemii 2007; 53: 389-99.

 7. Whelan SA, Hart GW. Proteomic approaches to analyze the dynamic relationships between nucleocytoplasmic protein glycosylation and phosphorylation. Circ Res 2003; 93: 1047-58.

 8. Iyer SP, Hart GW. Dynamic nuclear and cytoplasmic glycosylation: enzymes of O-GlcNAc cycling. Biochemistry 2003; 42: 2493-9.

 9. ten Dijke P, Goumans MJ, Pardali E. Endoglin in angiogenesis and vascular diseases. Angiogenesis 2008; 11: 79-89.

10. El-Gohary YM, Silverman JF, Olson PR, et al. Endoglin (CD105) and vascular endothelial growth factor as prognostic markers in prostatic adenocarcinoma. Am J Clin Pathol 2007; 127: 572-9.

11. Lipiński M. Metody diagnostyczne stosowane w rozpoznawaniu raka pęcherza moczowego. Przegląd Urologiczny 2008; 9: 64-71.

12. Slawson C, Zachara NE, Vosseller K, et al. Perturbations in O-linked beta-N-acetylglucosamine protein modification cause severe defects in mitotic progression and cytokinesis. J Biol Chem 2005; 280: 32944-56.

13. Sadłecki P, Walentowicz-Sadłecka M, Grabiec M. Rola angiogenezy w rozwoju nowotworów. Przegl Menopauz 2010; 1: 28-31.

14. Dallas NA, Samuel S, Xia L, et al. Endoglin (CD105): a marker of tumor vasculature and potential target for therapy. Clin Cancer Res 2008; 14: 1931-7.