Diagnostic value of glucose transporter 1 and 3 (GLUT1 and GLUT3) mRNA level in postmenopausal women with urinary bladder cancer

Wstęp

Rak pęcherza moczowego w Polsce jest 8. pod względem częstości zachorowań nowotworem u kobiet i stanowi jedno z poważniejszych wyzwań dla urologów oraz onkologów. Nowotwór ten występuje w postaci nienaciekającej mięśniówkę właściwą w ok. 70% przypadków i inwazyjnej w ok. 30%. Raki nieinwazyjne cechuje tendencja do dawania wznowy w ok. 60% przypadków. Od 10% do 30% wśród guzów nawrotowych wykazuje istotną progresję w zakresie utraty różnicowania komórkowego i stopnia zaawansowania klinicznego [1]. Zgodnie z danymi eksperymentalnymi, w molekularne podłoże transformacji nowotworowej tego narządu zaangażowane mogą być także czynniki białkowe uczestniczące w transmisji sygnału komórkowego, stymulowane przez estrogeny [2, 3]. U kobiet w wieku przedmenopauzalnym estrogeny syntetyzowane są głównie przez jajniki, natomiast u kobiet w wieku pomenopauzalnym miejsce syntezy tych hormonów przejmuje tkanka tłuszczowa, mózg, śródbłonek naczyń krwionośnych i mięśnie gładkie [4]. Z uwagi na to, że nowotwory pęcherza moczowego występują głównie u kobiet w podeszłym wieku, celowa wydaje się analiza molekularnych podstaw transformacji nowotworowej tego narządu w tej właśnie grupie kobiet.

Cechą charakterystyczną metabolizmu komórek nowotworowych jest nasilenie procesu glikolizy, które możliwe jest m.in. dzięki zwiększonemu transportowi glukozy do komórki [5]. Różnice w szybkości i ilości wychwytywania glukozy pomiędzy komórkami normalnymi i nowotworowymi stały się podstawą opracowania metody diagnozowania nowotworów przez zastosowanie pozytonowej tomografii emisyjnej wykorzystującej fluorodeoksyglukozę zawierającą promieniotwórczy izotop 18F jako znacznik [6]. Przechodzenie glukozy przez błonę komórkową odbywa się z udziałem białek należących do rodziny transporterów glukozy określanych jako GLUT. Do chwili obecnej zidentyfikowano 14 białek (GLUT1–GLUT14) należących do tej rodziny i zaangażowanych w transport glukozy oraz innych heksoz [7]. Poszczególne transportery wykazują różne powinowactwo do transportowanych monosacharydów oraz różnią się ekspresją tkankową [5]. GLUT1 i GLUT3 należą do transporterów o dużym powinowactwie do glukozy, umożliwiających bardzo szybki transport glukozy do komórek. GLUT1 ulega ekspresji na zróżnicowanym poziomie w wielu typach komórek i uważa się, że odpowiada on za podstawowy transport glukozy [5]. Występowanie GLUT3 jest bardziej ograniczone. Stanowi on główny transporter glukozy w neuronach, ale był również identyfikowany w spermie i krwinkach białych [8].

Stwierdzono, że w komórkach nowotworowych, w następstwie zwiększonego zapotrzebowania na glukozę, dochodzi do nasilenia ekspresji niektórych transporterów glukozy. GLUT1 jest transporterem glukozy, którego nad-

ekspresję obserwuje się w przypadku prawie wszystkich nowotworów złośliwych. Zwiększoną ekspresję GLUT1 w stosunku do tkanek prawidłowych stwierdzono w przypadku raka wątroby [9], trzustki [9], nerek [10], płuc [11], piersi [12], żołądka [13], nowotworów głowy i szyi [14] oraz tarczycy [15]. GLUT3 ulega nadekspresji w rakach płuc,

jajnika i żołądka [16].

Cel pracy

Celem badań była ocena ekspresji transporterów glukozy GLUT1 i GLUT3, na poziomie mRNA, metodą łańcuchowej reakcji polimeryzacji w czasie rzeczywistym (real-time polymerase chain reaction – real-time PCR) oraz ocena przydatności diagnostycznej badanych genów jako markerów transformacji nowotworowej pęcherza moczowego kobiet w wieku pomenopauzalnym.

Materiał i metody

Materiał do badań stanowiły preparaty moczu pobranego od 46 kobiet ze zdiagnozowanym rakiem pęcherza moczowego. Średnia wieku w tej grupie wynosiła 56,7 ±12,4 roku. Charakterystyka kliniczno-patologiczna preparatów zamieszczona została w tabeli I. Materiał kontrolny stanowiły preparaty moczu pobranego od 37 kobiet, u których w badaniu ultrasonograficznym nie zdiagnozowano zmian nowotworowych. U żadnej z kobiet, zarówno w grupie chorych, jak i kontrolnej, nie stwierdzono cukrzycy. Złuszczone komórki nabłonkowe izolowano z 30–50 ml moczu. Bezpośrednio po pobraniu próby moczu przechowywano w temperaturze 4oC do chwili wykonywania oznaczeń, a następnie wirowano przy 2000 rpm przez 15 min. Otrzymany osad przemywano dwukrotnie zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej (pH 7,6) i przechowywano w temperaturze –80oC do dalszych oznaczeń.



Izolowanie RNA i synteza cDNA



Całkowite RNA izolowano przy użyciu odczynnika TRI Reagent (Sigma-Aldrich Corp, St. Louis, MO, USA) zgodnie z zaleceniami producenta. Przyjętym kryterium czystości DNA była wartość A260/A280 mieszcząca się w granicach 1,8–2,0. Reakcję odwrotnej transkrypcji przeprowadzano przy użyciu zestawu PCR Kit ver. 3.0 (Takara Bio Inc., Japonia) zgodnie z zaleceniami producenta. cDNA przechowywano w temperaturze –20°C.



Analiza ilościowa produktu amplifikacji w czasie rzeczywistym – reakcja real-time PCR



Otrzymany RNA stanowił matrycę w reakcji real-time PCR dla oznaczenia liczby kopii mRNA dla genu GLUT1 i GLUT3. Użyta mieszanina reakcyjna zawierała: 0,5 µl cDNA, 5 µl TaqMan® Universal PCR MasterMix, 0,5 µl 20× TaqMan® Gene Expression Assays i 4 μl H2O. Reakcję real-

time PCR prowadzono w urządzeniu Mastercycler®ep

realplex (Eppendorf). Początkowa ilość matrycy wyznaczana była na podstawie parametru Ct (teoretyczny numer cyklu, przy którym wartość fluorescencji jest wyższa niż przyjęta arbitralnie wartość graniczna). Pomiar wartości Ct wykonano w dwóch powtórzeniach, jako gen referencyjny wykorzystano GAPDH. Do badań zastosowano następujące sondy TaqMan® Gene Expression Assays (Applied Biosystems, USA): GLUT1 – Hs00892681_m1; GLUT3 – Hs00359840_m1, GAPDH – Hs00266705_g1.



Analiza statystyczna



Analizy statystycznej wyników dokonano przy użyciu programu komputerowego STATISTICA wersja 9.0 (StatSoft, Poland). Do oceny rozkładów wykorzystano test Kołmogorowa-Smirnowa i po stwierdzeniu rozkładów odmiennych od normalnych do dalszych obliczeń stosowano testy nieparametryczne – U Manna-Whitneya i Kruskala-Wallisa.

Wyniki

Ekspresję genu GLUT1 stwierdzono w 37/46 (82%) preparatach moczu pobranego od kobiet chorych oraz w 27/37 (74%) preparatach moczu pozyskanego od kobiet zdrowych. Ekspresji GLUT3 nie stwierdzono w moczu osób zdrowych, natomiast ekspresję tego genu wykazano w 28/46 (62%) próbach moczu pobranego od kobiet chorych. Zestawienie poziomu ekspresji genów GLUT1 i GLUT3 z cechami kliniczno-patologicznymi zawarto w tabeli II.

Wykazano, że ekspresja zarówno GLUT1, jak i GLUT3 była znamiennie statystycznie wyższa w preparatach moczu pozyskanych od chorych na raka wykazującego wyższy stopień zaawansowania klinicznego oraz niższy stopień zróżnicowania histologicznego, odpowiednio T2–T4 oraz G2 i G3, w porównaniu ze stadium Ta–T1 i G1. Nie wykazano natomiast znamiennej różnicy w ekspresji badanych genów w odniesieniu do występowania wznowy u pacjentek.

Dyskusja

Komórki nowotworowe charakteryzują się zwiększonym zapotrzebowaniem na glukozę. Wynika to głównie z faktu, że pozyskują one energię prawie wyłącznie w procesie mało efektywnej glikolizy beztlenowej, która jest sposobem adaptacji tych komórek do warunków hipoksji towarzyszącej rosnącym guzom. Ważnym regulatorem procesów związanych z hipoksją jest czynnik HIF-1α (hypoxia inducible factor 1α). Czynnik ten wpływa na regulację ekspresji wielu genów, m.in. tych zaangażowanych w angiogenezę, transport glukozy i wewnątrzkomórkowy metabolizm [17]. Ekspresja GLUT1 i GLUT3 jest stymulowana przez HIF-1α w warunkach niedoboru tlenu. Z kolei na ekspresję i aktywność HIF-1α wpływa szereg czynników, np. estrogeny. W komórkach raka jajnika estrogeny i progesteron regulują ekspresję HIF-1α poprzez szlak sygnałowy z udziałem kinazy Akt, wpływając na potencjał metastatyczny komórek [18]. Hipoksja związana jest z agresywnym zachowaniem guzów i dlatego wydaje się, że nadekspresja GLUT1 i GLUT3 może odgrywać rolę w progresji nowotworów. W przypadku kilku nowotworów, np. głowy i szyi, raka płuc, pęcherzyka żółciowego, jelita grubego, nerki, piersi i jajników, stwierdzono zależność pomiędzy ekspresją GLUT1 a stopniem zaawansowania oraz złymi rokowaniami dla pacjenta [17–22]. Ekspresja GLUT3 wzrasta także w komórkach raków w odpowiedzi na hipoksję, ale badania kliniczne dają niejednoznaczne wyniki.

Istnieje kilka doniesień dotyczących ekspresji GLUT1 w raku pęcherza moczowego [23–26]. Nie ma natomiast danych dotyczących ekspresji GLUT3. Wyniki badań immunohistochemicznych różnych preparatów nowotworów pęcherza moczowego wskazują na korelację pomiędzy wysoką ekspresją transportera GLUT1 a agresywnym potencjałem komórek nowotworowych, stopniem zaawansowania nowotworu, złymi rokowaniami i niskim wskaźnikiem przeżywalności [23–24].

W prezentowanej pracy analizowano ekspresję GLUT1 i GLUT3 w komórkach pochodzących z osadu moczu kobiet w wieku pomenopauzalnym ze zdiagnozowanymi nowotworami pęcherza moczowego oraz kobiet, u których nie stwierdzono choroby nowotworowej, stanowiących grupę kontrolną. W przeciwieństwie do wcześniejszych immunohistochemicznych badań Changa i wsp. [23], które sugerowały brak ekspresji GLUT1 w normalnej śluzówce pęcherza, przeprowadzona przez autorów niniejszej pracy analiza wykazała ekspresję mRNA GLUT1 w większości przypadków, zarówno w grupie kobiet chorych, jak i w grupie kontrolnej. Stwierdzono jednak, że ekspresja GLUT1 w moczu kobiet chorych była prawie 4-krotnie wyższa niż w grupie kontrolnej. Ekspresję GLUT3 obserwowano w 62% przypadków chorych na raka pęcherza moczowego. Nie stwierdzono natomiast ekspresji tego transportera w osadzie komórek pochodzących z moczu kobiet z grupy kontrolnej. GLUT3 może być zatem dobrym markerem transformacji nowotworowej w przypadku pęcherza moczowego u kobiet w wieku pomenopauzalnym.

Stwierdzono istotne statystycznie różnice w ekspresji obu transporterów glukozy pomiędzy rakami nieinwazyjnymi (Ta–T1) a rakami inwazyjnymi (T2–T4). Ekspresja GLUT1 i GLUT3 koreluje również z uznanym markerem agresywności guzów, tj. stopniem złośliwości histologicznej. Większa ekspresja transporterów obserwowana była w moczu pacjentek z rakami średnio i słabo zróżnicowanymi (G2 i G3) niż u kobiet z nowotworami dobrze zróżnicowanymi o niskim stopniu złośliwości histologicznej (G1).

Uzyskane wyniki sugerują, że ekspresja GLUT1 i GLUT3 oznaczana w osadzie moczu może być ważnym czynnikiem diagnostycznym w przypadku raka pęcherza moczowego u kobiet. Sugerujemy, że wysoka ekspresja GLUT1 i GLUT3 w rakach pęcherza wskazuje na zwiększony transport i zużycie glukozy, co jest skorelowane z agresywnym charakterem nowotworu. Niezależnie od ich znaczenia w diagnostyce wydaje się, że GLUT1 i 3 mogą być również brane pod uwagę jako cel terapii raka pęcherza moczowego, ponieważ zmniejszenie transportu glukozy może ograniczać potencjał proliferacyjny i zdolność do inwazji komórek nowotworowych.



Praca wykonana z funduszy działalności statutowej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi nr 503/0-157-01/503-01.

Praca wykonana z funduszy działalności statutowej Uniwersytetu Łódzkiego.

Piśmiennictwo

1. Kompier LC, van Tilborg AA, Zwarthoff EC. Bladder cancer: novel molecular characteristics, diagnostic, and therapeutic implications. Urol Oncol 2010; 28: 91-6.

2. Teng J, Wang ZY, Jarrard DF, Bjorling DE. Roles of estrogen receptor alpha and beta in modulating urothelial cell proliferation. Endocr Relat Cancer 2008; 15: 351-64.

3. Shen SS, Smith CL, Hsieh JT, et al. Expression of estrogen receptors-alpha and -beta in bladder cancer cell lines and human bladder tumor tissue. Cancer 2006; 106: 2610-6.

4. Davis SR, Burger HG. The role of androgen therapy. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2003; 17: 165-75.

5. Macheda ML, Rogers S, Best JD. Molecular and cellular regulation

of glucose transporter (GLUT) proteins in cancer. J Cell Physiol 2005; 202: 654-62.

6. Kresnik E, Gallowitsch HJ, Mikosch P, et al. Fluorine-18-fluorodeoxyglucose positron emission tomography in the preoperative assessment

of thyroid nodules in an endemic goiter area. Surgery 2003; 133: 294-9.

7. Thorens B, Mueckler M. Glucose transporters in the 21st Century. Am

J Physiol Endocrinol Metab 2010; 298: E141-5.

8. Simpson IA, Dwyer D, Malide D, et al. The facilitative glucose transporter GLUT3: 20 years of distinction. Am J Physiol Endocrinol Metab 2008; 295: E242-53.

9. Yamamoto T, Seino Y, Fukumoto H, et al. Over-expression of facilitative glucose transporter genes in human cancer. Biochem Biophys Res Commun 1990; 170: 223-30.

10. Nagase Y, Takata K, Moriyama N, et al. Immunohistochemical localization of glucose transporters in human renal cell carcinoma. J Urol 1995; 153: 798-801.

11. Ito T, Noguchi Y, Satoh S, et al. Expression of facilitative glucose transporter isoforms in lung carcinomas: its relation to histologic type, differentiation grade, and tumor stage. Mod Pathol 1998; 11: 437-43.

12. Brown RS, Wahl RL. Overexpression of Glut-1 glucose transporter in human breast cancer. An immunohistochemical study. Cancer 1993; 72: 2979-85.

13. Noguchi Y, Marat D, Saito A, et al. Expression of facilitative glucose transporters in gastric tumors. Hepatogastroenterology 1999; 46: 2683-9.

14. Mellanen P, Minn H, Grénman R, Härkönen P. Expression of glucose transporters in head-and-neck tumors. Int J Cancer 1994; 56: 622–9.

15. Matsuzu K, Segade F, Matsuzu U, et al. Differential expression of glucose transporters in normal and pathologic thyroid tissue. Thyroid 2004; 14: 806-12.

16. Younes M, Lechago LV, Somoano JR, et al. Immunohistochemical detection of Glut3 in human tumors and normal tissues. Anticancer Res 1997; 17: 2747-50.

17. Airley RE, Mobasheri A. Hypoxic regulation of glucose transport, anaerobic metabolism and angiogenesis in cancer: novel pathways and targets for anticancer therapeutics. Chemotherapy 2007; 53: 233-56.

18. Hua K, Din J, Cao Q, et al. Estrogen and progestin regulate HIF-1alpha expression in ovarian cancer cell lines via the activation of Akt signaling transduction pathway. Oncol Rep 2009; 21: 893-8.

19. Younes M, Brown RW, Stephenson M, et al. Overexpression of Glut1 and Glut3 in stage I nonsmall cell lung carcinoma is associated with poor survival. Cancer 1997; 80: 1046-51.

20. Reisser C, Eichhorn K, Herold-Mende C, et al. Expression of facilitative glucose transport proteins during development of squamous cell carcinomas of the head and neck. Int J Cancer 1999; 80: 194-8.

21. Haber RS, Rathan A, Weiser KR, et al. GLUT1 glucose transporter expression in colorectal carcinoma: a marker for poor prognosis. Cancer 1998; 83: 34-40.

22. Lidgren A, Bergh A, Grankvist K, et al. Glucose transporter-1 expression in renal cell carcinoma and its correlation with hypoxia inducible factor-1 alpha. BJU Int 2008; 101: 480-4.

23. Ozbudak IH, Shilo K, Tavora F, et al. Glucose transporter-1 in pulmonary neuroendocrine carcinomas: expression and survival analysis. Mod Pathol 2009; 22: 633-8.

24. Chang S, Lee S, Lee C, Kim JI, Kim Y. Expression of the human erythrocyte glucose transporter in transitional cell carcinoma of the bladder. Urology 2000; 55: 448-52.

25. Younes M, Juarez D, Lechago LV, Lerner SP. Glut 1 expression in transitional cell carcinoma of the urinary bladder is associated with poor patient survival. Anticancer Res 2001; 21: 575-8.

26. Lee JH, Kim YW, Chang SG. Glucose transporter-1 expression in urothelial papilloma of the bladder. Urol Int 2005; 74: 268-71.

27. Palit V, Phillips RM, Puri R, et al. Expression of HIF-1alpha and Glut-1 in human bladder cancer. Oncol Rep 2005; 14: 909-13.