Pomimo szybkiego rozwoju nowoczesnych metod badawczych podstawą diagnostyki raka płuca pozostaje ocena materiału tkankowego lub komórkowego w mikroskopie świetlnym. Specyfika anatomiczna płuc, jak również zaawansowanie nowotworu w chwili rozpoznania powodują, że w większości przypadków pierwszą morfologiczną weryfikacją raka płuca jest ocena mikroskopowa materiału cytologicznego. W znacznym odsetku przypadków jest to jedyne morfologiczne rozpoznanie przed podjęciem leczenia. Rozpoznanie to stanowi podstawę wyboru i prowadzenia leczenia, szczególnie radioterapii i chemioterapii. Badanie cytologiczne materiału komórkowego z płuc jako metoda skriningowa u osób o zwiększonym ryzyku wystąpienia raka nie znalazło praktycznego zastosowania.
Materiałem cytologicznym, który stanowi podstawę oceny mikroskopowej, może być: plwocina, popłuczyny oskrzelowe, wymaz oskrzelowy, biopsja aspiracyjna cienkoigłowa transtorakalna lub transbronchialna. W przypadkach zaawansowanych raków płuca dodatkowo materiałem takim może być płyn z jamy opłucnej oraz aspirat z węzłów chłonnych nadobojczykowych.
Wybór rodzaju materiału cytologicznego z płuc do oceny mikroskopowej zależy od lokalizacji zmiany (tab. I) i ogólnego stanu pacjenta, w tym zaawansowania nowotworu. Badanie cytologiczne plwociny zalecane jest u pacjentów z guzem zlokalizowanym centralnie, u których zachodzi potrzeba weryfikacji mikroskopowej – ustalenia rozpoznania patomorfologicznego, a pacjent z uwagi na stan ogólny lub zaawansowanie nowotworu (np. obraz radiologiczny) nie jest kandydatem do bronchoskopii i ewentualnego zabiegu chirurgicznego. U pacjentów, u których planuje się wykonanie bronchoskopii, bardziej uzasadniona jest ocena wymazu z materiału pobranego w czasie wziernikowania oskrzeli.
Materiał uzyskany drogą wymazu jest obfitszy, lepiej zachowany niż plwocina (mniej komórek martwiczych) i pobrany z odpowiednio wybranego miejsca błony śluzowej oskrzeli. W przypadkach guzów zlokalizowanych obwodowo podstawowym materiałem cytologicznym w diagnostyce raka płuca jest aspirat cienkoigłowy. Materiał taki może być pobrany pod kontrolą konwencjonalnego aparatu rentgenowskiego, ultrasonografii, a przede wszystkim tomografii komputerowej. W przypadkach guzów zlokalizowanych obwodowo oraz powiększenia węzłów chłonnych wnęki zaleca się biopsję aspiracyjną transbronchialną w celu oceny stopnia zaawansowania nowotworu.
Do diagnostyki raka płuca mogą być również wykorzystane popłuczyny oskrzelowe.
1. Zastosowanie immunohistochemii w celu określenia typu histologicznego w preparatach cytologicznych z pierwotnych raków płuca
Postęp w onkologii, a w szczególności w onkologii klinicznej, powoduje konieczność jak najdokładniejszego określenia typu histologicznego raka płuca. Stosowane przez ostatnie kilkadziesiąt lat określenie rak niedrobnokomórkowy, szczególnie w odniesieniu do raków zaawansowanych, nieoperacyjnych, jest niewystarczające. Podstawą oceny mającej na celu określenie typu histologicznego jest wnikliwe badanie mikroskopwe standardowych preparatów.
W odniesieniu do gruczolakoraka i raka płaskonabłonkowego w celu potwierdzenia typu histologicznego można w wybranych przypadkach zastosować panel przeciwciał:
• rak płaskonabłonkowy: p63, CK5/6,
• gruczolakorak: TTF1, CK7, napsin A.
Jest to najczęściej spotykany problem w różnicowaniu podtypu raka niedrobnokomórkowego.
W celu wykonania barwień immunohistochemicznych najlepszą metodą w cytologii jest technika cell block. Tak przygotowany materiał komórkowy pozwala na wykonanie wielu barwień immunohistochemicznych. W większości przypadków jednak nim nie dysponujemy. Barwienia immunohistochemiczne mogą być wykonane w rozmazach uprzednio utrwalonych i barwionych, np. HE (ryc. 1.). Można do tych celów wykorzystać dodatkowe preparaty cytologiczne niebarwione, a przechowywane w celu wykonywania barwień dodatkowych po ustaleniu wstępnego rozpoznania cytologicznego (ryc. 3.).
Ocena reakcji immunohistochemicznych w materiale cytologicznym, a w szczególności w aspiratach cienkoigłowych, wymaga bardzo ostrożnej interpretacji. Odnosi się to w szczególności do odczynów błonowych, np. EGFR (ryc. 2.).
Uszkodzenie błony komórkowej w czasie aspirowania materiału i wykonywania rozmazów może być przyczyną oceny błędnie ujemnej. Bardziej wiarygodne są wyniki badań immunohistochemicznych, w przypadkach lokalizacji jądrowej odczyn np. TTF1, ER czy PR.
Poniżej, oprócz cech cytologicznych poszczególnych typów i podtypów raka płuca, jak również guzów przerzutowych, przedstawiono ich profile immunohistochemiczne. Informacje te powinno się uwzględniać w diagnostyce różnicowej, pamiętając o pewnej odrębności w ocenie materiału tkankowego i cytologicznego. 2. Obrazy cytologiczne raka płuca
W ocenie materiału cytologicznego pochodzącego z płuc w diagnostyce mikroskopowej stosuje się klasyczne kryteria: rozproszenie i polimorfizm komórek, ocenę stosunku jądrowo-cytoplazmatycznego (N/C ratio), polimorfizm jąder komórkowych i ich strukturę, strukturę i układ chromatyny jądrowej, jak również obecność i wielkość jąderek.
Sugerowany jest podział tych kryteriów na tzw. główne i pomocnicze. Kryteria główne pozwalają zwykle na określenie złośliwego lub łagodnego charakteru zmiany, natomiast kryteria pomocnicze najczęściej umożliwiają określenie typu histologicznego na podstawie oceny rozmazów (tab. II).
Należy podkreślić pewne różnice w obrazach mikroskopowych stwierdzanych w rozmazach w zależności od sposobu pobrania i rodzaju materiału do oceny cytologicznej. Ponieważ najczęściej mamy do czynienia z aspiratami cienkoigłowymi oraz wymazami z oskrzeli wykonanymi w czasie bronchoskopii, przedstawione opisy obrazu mikroskopowego dotyczyć będą tych dwóch rodzajów materiału. Różnice w obrazach mikroskopowych w zależności od sposobu pobierania materiału przedstawiono w tabelach III i IV.
Podobnie jak w ocenie mikroskopowej materiału tkankowego (wycinek pobrany w czasie bronchoskopii lub biopsja gruboigłowa) istnieje możliwość niedokładnego określenia typu histologicznego z uwagi na heterogenność utkania raków płuca. 2.1. Rak płaskonabłonkowy
Obraz mikroskopowy w aspiratach wykonanych z tego typu raka płuca cechuje występowanie komórek nowotworowych w drobnych grupach lub w rozproszeniu. Cechą charakterystyczną jest obecność rozproszonych komórek o dobrze zachowanej, wyraźnie odgraniczonej, kwasochłonnej cytoplazmie. Jądra komórkowe są często pyknotyczne, hiperchromatyczne, o nieregularnych obrysach. W rozmazach z aspiratów stwierdza się ponadto komórki o pęcherzykowych jądrach, czasem z wyraźnymi jąderkami (tab. V, ryc. 5., 6). Należy podkreślić, że pierwotne raki płaskonabłonkowe płuca są zwykle nisko lub średnio dojrzałe. Stwierdzenie w rozmazach znacznej liczby komórek z wyraźnymi cechami rogowacenia, szczególnie gdy ognisko zlokalizowane jest obwodowo, winno budzić podejrzenie przerzutu.
Ocena rzadkich podtypów raka płaskonabłonkowego (np. podtyp małych komórek, bazaloidny) na podstawie materiału cytologicznego jest praktycznie niemożliwa.
W przypadkach nisko dojrzałych raków płaskonabłonkowych istnieje konieczność zastosowania badań immunohistochemicznych w celu dokładnego określenia typu histologicznego (ryc. 4.). 2.2. Gruczolakorak
Cechą charakterystyczną jest występowanie grup i płatów komórek nowotworowych tworzących często wyraźne struktury trójwymiarowe. Stwierdza się struktury zrazikowe (ryc. 7.). W komórkach nowotworowych zazwyczaj występują: wyraźna, delikatna, piankowata cytoplazma i niezbyt ostro zaznaczone granice komórkowe. Jądra komórkowe zwykle mają tzw. pęcherzykową strukturę i często widać wyraźne lub duże jąderka (tab. VI, ryc. 7B.).
W guzach mniej dojrzałych stwierdza się większe rozproszenie komórek.
Rzadziej niż w innych typach raka płuca obserwuje się martwicę, występuje ona jednak w guzach mniej dojrzałych. 2.3. Rak oskrzelikowo-pęcherzykowy
Zainteresowanie tym podtypem gruczolakoraka wynika z wprowadzenia do leczenia raka płuca inhibitorów kinazy tyrozynowej. Zgodnie z definicją Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) z 2004 r. rozpoznanie raka oskrzelikowo-pęcherzykowego jest możliwe tylko w przypadku oceny histologicznej całego guza i niestwierdzenia cech naciekającego rozrostu w podścielisku lub opłucnej. W przygotowywanej do publikacji klasyfikacji WHO raków płuca ten typ rozrostu nowotworowego został zaliczony do raków przedinwazyjnych. Rozpoznanie cytologiczne raka oskrzelikowo-pęcherzykowego jest wprawdzie niemożliwe na podstawie materiału cytologicznego, jednak opisano jego cechy mikroskopowe w materiale cytologicznym. Nowotwór ten cechuje się w rozmazach obecnością dużych, płaskich lub trójwymiarowych płatów komórkowych. Komórki nowotworowe charakteryzuje monomorfizm (ryc. 9.). Cechą charakterystyczną tych komórek jest obecność tzw. bruzd (grooves) oraz śródjądrowych wpukleń cytoplazmatycznych (tab. VII, ryc. 8.).
Należy pamiętać, że zarówno obraz cytologiczny, jak i profil immunohistochemiczny odnosi się do podtypu nieśluzotwórczego raka oskrzelikowo-pęcherzykowego. Podtyp wydzielniczy ma profil immunohistochemiczny podobny jak rak jelita grubego: TTF1(–), CK7(–) i CK20(+). W obrazie mikroskopowym tego podtypu stwierdza się występowanie cylindrycznych komórek o obfitej cytoplazmie tworzących niekiedy drobne struktury brodawkowe (ryc. 10.). 2.4. Rak wielkokomórkowy
W obrazie cytologicznym ten typ histologiczny raka płuca cechuje obecność licznych, rozproszonych komórek nowotworowych. Występują nieliczne, drobne grupy luźno zespolonych komórek. W rozmazach z reguły stwierdza się masy martwicze (ryc. 12.). Zachowane komórki cechują duże, hiperchromatyczne jądra z wyraźnymi, a niekiedy dużymi jąderkami. Można obserwować liczne jądra komórkowe pozbawione cytoplazmy lub z nieznacznym rąbkiem cytoplazmy (ryc. 11.). Luźno leżące jądra komórkowe mogą być pyknotyczne lub z zachowaną strukturą chromatyny.
W rozmazach stwierdza się obecność komórek wielojądrowych, jak również wrzecionowatych komórek nowotworowych (tab. VIII).
Podobnie jak w ocenie preparatów histologicznych rozpoznanie raka wielkokomórkowego niezróżnicowanego w rozmazach ustala się na podstawie braku innych cech mikroskopowych – tzn. kryteriów charakterystycznych dla raka drobnokomórkowego (morfologia jąder), cech rogowacenia (rak płaskonabłonkowy) czy też cech mikroskopowych gruczolakoraka. 2.5. Rak neuroendokrynny wielkokomórkowy
W obrębie raków wielkokomórkowych wyodrębnia się podtyp raka neuroendokrynnego. W obrazie histologicznym cechują go układy gniazdowe z palisadowym ułożeniem komórek na obwodzie gniazd. Dodatnie są odczyny immunohistochemiczne dla markerów neuroendokrynności [chromogranina A (+), synaptofizyna (+), NCAM/CD56(+)].
W rozmazach stwierdza się drobne grupy komórek nowotworowych z charakterystycznym palisadowatym układem jąder (komórek) na obwodzie.
Jądra komórkowe cechuje gruboziarnista struktura chromatyny, pogrubiała błona jądrowa i obecność wyraźnych jąderek.
Należy podkreślić, że dodatnie odczyny immunohistochemiczne dla markerów neuroendokrynności nie są wystarczające do rozpoznania tego typu histologicznego, ponieważ w pewnym odsetku raków płaskonabłonkowych lub gruczolakoraków stwierdza się dodatnie reakcje na chromograninę i synaptofizynę. 2.6. Rak drobnokomórkowy
Materiał cytologiczny raka drobnokomórkowego płuca daje bardzo charakterystyczny obraz, pozwalający na jednoznaczne określenie typu histologicznego. Podstawą rozpoznania raka drobnokomórkowego płuca jest struktura jąder (tab. IX).
Rozmazy, szczególnie aspiraty ciekonkoigłowe, są bogatokomórkowe. Zwraca uwagę znaczne, niekiedy prawie całkowite, rozproszenie komórek, ale zawsze udaje się stwierdzić w rozmazach drobne grupy komórek (ryc. 13.). Komórki nowotworowe niewielkich rozmiarów mają skąpą lub niekiedy słabo zaznaczoną cytoplazmę. W rozmazach obserwuje się często dwa rodzaje jąder komórkowych. Okrągłe lub nieznacznie owalne jądra cechuje drobnoziarnista, równomiernie rozłożona chromatyna jądrowa. Błona jądrowa jest niepogrubiała. Z reguły nie stwierdza się jąderek lub występują one w pojedynczych komórkach i są niewielkich rozmiarów. Ponadto obecne są mniejsze, całkowicie pyknotyczne jądra komórek nowotworowych bez widocznej struktury chromatyny. Ten typ jąder komórkowych występuje w większym odsetku w plwocinie lub wymazach z oskrzela. Charakterystyczną cechą jest wzajemne modelowanie się jąder komórkowych. 2.7. Rakowiak
Komórki nowotworowe cechuje znaczne rozproszenie z obecnością drobnych skupisk, najczęściej monomorficznych komórek. Komórki są okrągłe, nieco wydłużone lub plazmocytoidalne.
Cechą charakterystyczną jest struktura chromatyny – określana w piśmiennictwie angielskim jako ,,salt and pepper” (ryc. 14., 15.). Można stwierdzić drobne jąderka. Cytoplazma najczęściej jest skąpa, drobnoziarnista. Nie stwierdza się martwicy.
Różnicowanie rakowiaka i rakowiaka atypowego na podstawie oceny preparatów cytologicznych jest praktycznie niemożliwe. Morfologia komórek (zaznaczona atypia), obecność mas martwiczych, jak również wzmożona aktywność mitotyczna (Ki67) sugerują, że możemy mieć do czynienia z rakowiakiem atypowym. Rakowiaka atypowego należy brać pod uwagę, gdy obraz mikroskopowy, cytologiczny przemawia za rakiem drobnokomórkowym, a klinicznie (radiologicznie) mamy do czynienia z dobrze odgraniczonym guzem zlokalizowanym na obwodzie płuca. 3. Diagnostyka różnicowa nowotworów przerzutowych do płuc na podstawie materiału cytologicznego
Płuca są częstą lokalizacją przerzutów nowotworowych. Obraz kliniczno-radiologiczny cechuje zwykle obecność mnogich, obwodowo zlokalizowanych, często dobrze odgraniczonych zmian ogniskowych. Przy uwzględnieniu historii choroby i typu uprzednio stwierdzonego nowotworu ustalenie rozpoznania jest stosunkowo proste. Zdarzają się jednak przypadki nietypowe, np. pojedyncza zmiana ogniskowa w płucu przy braku informacji o chorobie nowotworowej w wywiadzie może stanowić istotny problem diagnostyczny w ocenie mikroskopowej materiału cytologicznego – uzyskanego zwykle drogą biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej.
Nowotworami, w przebiegu których w praktyce klinicznej mamy do czynienia z przerzutami do płuc, są: rak piersi, jelita grubego, trzustki, żołądka oraz czerniak złośliwy. Nowotwory te mają niekiedy charakterystyczny obraz cytologiczny, a także odmienny profil immunohistochemiczny (tab. X).
W ocenie potencjalnych przerzutów nowotworowych, gdy znane jest ognisko pierwotne, podstawą postępowania diagnostycznego jest znajomość obrazu mikroskopowego ogniska pierwotnego i porównanie z obrazem cytologicznym aspiratu z płuca. 3.1. Rak piersi
W rozmazach stwierdza się drobne grupy komórek lub komórki nowotworowe w rozproszeniu. Komórki mają zwykle skąpą cytoplazmę i wyraźne jądra, czasem z jąderkami. Obraz mikroskopowy ma cechy pośrednie między gruczolakorakiem a rakiem płaskonabłonkowym. Prawie patognomonicznym obrazem jest występowanie w rozmazach komórek, w których stwierdza się śródcytoplazmatyczne wodniczki. Czasem w środku tych wodniczek widać zagęszczenie zawartości. Ten charakterystyczny dla raka piersi obraz obserwuje się w niektórych typach tego nowotworu, np. raku zrazikowym.
Pomocny jest profil immunohistochemiczny. 3.2. Rak jelita grubego
W rozmazach stwierdza się grupy komórek nowotworowych z charakterystycznym palisadowatym układem komórek na obwodzie. Komórki nowotworowe o cylindrycznym kształcie (kształt cygara) cechują wydłużone, hiperchromatyczne jądra (ryc. 17.). 3.3. Rak żołądka
Obraz mikroskopowy przerzutów raka żołądka cechuje podobna jak guzów pierwotnych różnorodność. Charakterystyczny jest obraz raka typu signet ring carcinoma. W przerzutach raka typu jelitowego stwierdza się obrazy cytologiczne wymagające różnicowania z przerzutami raka jelita grubego lub pęcherzyka żółciowego. 3.4. Rak nerki
Przerzuty tego nowotworu cechuje obecność drobnych płatów komórek o obfitej, jasnej cytoplazmie i często delikatnych, ale wyraźnych granicach komórkowych. Komórki te zawierają dość duże, zwykle regularnie obrysowane jądra z wyraźnymi jąderkami. Taki obraz stwierdza się w najczęstszym raku nerki, tzw. raku jasnokomórkowym. Należy pamiętać, że w płucach może występować pierwotny rak o jasnej, obfitej cytoplazmie. 3.5. Czerniak złośliwy
Rozmazy są zwykle bogatokomórkowe i cechuje je bardzo duża różnorodność morfologii komórek nowotworowych. Odzwierciedla to charakterystyczny polimorfizm tego nowotworu. Komórki występują w rozproszeniu lub drobnych skupieniach i rzadko stwierdza się wyraźne zmiany martwicze.
Komórki mogą być wieloboczne, okrągłe, wydłużone lub olbrzymie. Polimorficzne jądra komórkowe wykazują obecność jąderek, niekiedy bardzo dużych. Szczególnie charakterystyczną cechą jest obecność wewnątrzjądrowych inkluzji cytoplazmatycznych oraz melaniny, która w postaci drobnych, pyłkowych ziarenek występuje w cytoplazmie komórek nowotworowych (ryc. 18.).
W niektórych przypadkach nie ma jednak ani inkluzji wewnątrzjądrowych, ani melaniny, a pomocna w prawidłowym rozpoznaniu jest obecność licznych, rozproszonych komórek nowotworowych niewykazujących martwicy. W diagnostyce przerzutów czerniaka złośliwego bardzo pomocna jest znajomość obrazu mikroskopowego ogniska pierwotnego. Piśmiennictwo
1. Domagała-Kulawik J, Olszewski WT. Atlas cytopatologii układu oddechowego. Alfa Medica Press, Bielsko-Biała 2009.
2. Jing Zhai. Lung, Pleura and Mediastinum. In: Differential Diagnosis in Cytopathology. Cambridge Uniuersity Press 2010; 509-556.
3. Siddiqui MT. Pulmonary neuroendocrine neoplasms: A review of clinicopathologic and cytologic features. Diagn Cytopathol 2010; 38: 607-617.
