Diagnostyka toksokarozy z zastosowaniem metod biologii molekularnej

Toksokaroza to odzwierzęca choroba inwazyjna wywołana zarażeniem formą rozwojową nicienia należącego do rodzaju Toxocara. Glista psia (T. canis) i glista kocia (T. cati) to powszechne pasożyty psów i kotów na terenie Polski (do 72% bezpańskich psów i 10,5–30% kotów może być zarażonych glistami) [1]. Pełen cykl rozwojowy T. canis i T. cati zachodzi jedynie u młodych zwierząt, natomiast u dorosłych mięsożernych, drobnych gryzoni czy ptaków larwy nie rozwijają się do postaci dorosłych. Chorobę u człowieka mogą także wywołać nicienie z gatunku Toxascaris leonina i potencjalnie Toxocara malaysiensis, które nie są spotykane na terenie Polski. Do organizmu kociąt, szczeniąt, młodych lisów czy wilków larwy dostają się drogą śródmaciczną, laktogenną lub doustną i po odbyciu wędrówki przez płuca lokalizują się w jelicie cienkim, gdzie osiągają dojrzałość oraz produkują wydalane z kałem jaja [2]. Jedna samica glisty jest w stanie wytworzyć ok. 200 tys. jaj na dobę, które dzięki grubym otoczkom mogą zachowywać inwazyjność nawet przez 10 lat. Szacuje się, że w zależności od warunków demograficznych na świecie 2–10% populacji jest zarażone Toxocara spp. [3]. Według Hozyasz i wsp. dodatnie odczyny serologiczne na obecność inwazji glistami występują w zachodnich województwach Polski u ok. 3,5% dzieci, natomiast w południowo-wschodnich regionach kraju nawet u ok. 19% [4]. Człowiek jest żywicielem przypadkowym, u którego rozwój Toxocara spp. jest nietypowy i zostaje zahamowany na poziomie larw. Inwazję pasożyta nabywa się za pośrednictwem jaj pochodzących ze środowiska zewnętrznego. Jaja bezpośrednio wydalone z kałem chorego zwierzęcia nie są od razu zdolne do zarażenia. Dopiero po ok. 3 tyg., przy dostępie tlenu, w odpowiedniej temperaturze (10–30°C) oraz wilgotności środowiska w jaju rozwija się larwa drugiego stadium (L2) – postać inwazyjna Toxocara spp. [2]. Ludzie (najczęściej dzieci w wieku 2–7 lat) nabywają toksokarozę głównie przez kontakt ze skażoną ziemią. Zarówno niski poziom higieny, jak i spożywanie surowych warzyw z zanieczyszczonych upraw może doprowadzić do inwazji. Rzadziej wiąże się to z konsumpcją surowego mięsa zwierząt będących potencjalnymi gospodarzami pasożyta, takich jak kurczaki, jagnięta czy króliki [5]. Z połkniętych jaj pasożyta w przewodzie pokarmowym człowieka uwalniają się inwazyjne larwy, które przechodzą przez ścianę jelita i wędrują z prądem krwi do różnych tkanek – głównie wątroby (80%), a także płuc, mózgu, gałki ocznej, mięśni szkieletowych czy mięśnia sercowego. Larwy nigdy nie osiągają postaci dojrzałej, ale są silnymi antygenami i wywołują odczyn zapalny w otaczających tkankach, co prowadzi do powstania ziarniniaków i blizn łącznotkankowych. Różnorodność objawów klinicznych zależy od masywności zarażenia, lokalizacji narządowej pasożyta oraz zapalno-immunologicznej odpowiedzi ze strony organizmu człowieka [6].
Kliniczny przebieg toksokarozy
Z klinicznego punktu widzenia rozróżnia się pięć form toksokarozy, tj. zespół larwy wędrującej trzewnej (ang. visceral larva migrans – VLM), toksokarozę oczną (ang. ocular larva migrans – OLM), toksokarozę ośrodkowego układu nerwowego, toksokarozę ukrytą (ang. covert toxocarosis – CT) oraz bezobjawową. Według badań przeprowadzonych przez Pracownię Parazytoz Zwierząt Domowych Instytutu Parazytologii PAN w Warszawie najczęściej występuje VLM (45,4%), rzadziej rozpoznaje się postać ukrytą (37,5%) i oczną (17,1%) [2]. Następstwem masywnego zarażenia, głównie u małych dzieci, jest uogólniona postać trzewna (zespół VLM), objawiająca się bólami brzucha i głowy, gorączką, osłabieniem apetytu, hepatomegalią, splenomegalią i powiększeniem węzłów chłonnych. Towarzyszą im nieprawidłowości w badaniach laboratoryjnych, takie jak leukocytoza z eozynofilią (>2000 komórek/mm3), niedokrwistość niedobarwliwa, hipergammaglobulinemia oraz wzrost aktywności aminotransferaz [2, 5]. Przy mniej intensywnej inwazji i słabiej nasilonych objawach stwierdza się postać ukrytą (CT) lub bezobjawową. W przypadku, gdy larwa dotrze do ośrodkowego układu nerwowego, choroba manifestuje się jako encefalopatia z zaburzeniami funkcji poznawczych, zapalenie opon mózgowych i mózgu, zapalenie naczyń mózgowych, padaczka, osłabienie widzenia, zapalenie rdzenia kręgowego i korzeni rdzeniowych lub zapalenie nerwów czaszkowych [7]. Zapis elektroencefalogramu (EEG) jest nieprawidłowy, natomiast w badaniach obrazowych (tomografia komputerowa, rezonans magnetyczny) często nie stwierdza się zmian ogniskowych. Toksokaroza oczna (OLM) jest miejscowym powikłaniem inwazji Toxocara spp. i zazwyczaj występuje u dzieci, chociaż opisano także przypadki u dorosłych. Objawy kliniczne obejmują pogorszenie widzenia w ciągu kilku dni lub tygodni, wysięk zapalny w ciele szklistym i komorze przedniej, ziarniniaki (często podejrzenie retinoblastoma), zapalenie i wylewy wewnątrzgałkowe, odwarstwienie siatkówki, wtórny zez i zaćmę [8].
Tradycyjne metody diagnostyczne
W diagnostyce toksokarozy wykorzystuje się badania serologiczne. Poszukuje się swoistych przeciwciał IgG skierowanych przeciwko antygenom wydalniczo-wydzielniczym glist, które są uważane za bardziej swoiste od antygenów somatycznych [9]. Obecnie rutynowo wykonuje się test ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay) do wykrywania przeciwciał typu IgG, brak natomiast komercyjnych testów dla IgM [2]. Metoda ELISA charakteryzuje się czułością ok. 78% i swoistością >90% (dla miana ł1:32) [10]. Jednak specyficzność stadialna niektórych antygenów oraz zmienność antygenowa pasożytów sprawia, że badania serologiczne nie są wystarczająco czułe. Przeciwciała wykrywane u żywiciela są jedynie pośrednim dowodem obecności patogenu i wysokie ich miana mogą utrzymywać się nawet po wyeliminowaniu pasożyta. Dodatkowy problem stanowią reakcje krzyżowe uniemożliwiające definitywne określenie, który z pasożytów – T. canis czy T. cati – spowodował w danym przypadku chorobę. Zazwyczaj przy rozpoznaniu zespołu larwy migrującej Toxocara przyjmuje się, że to T. canis [11]. Natomiast T. cati – migrująca larwa stadium L2 – także może powodować OLM czy VLM. Istnieje również możliwość dodatkowego zarażenia człowieka dorosłymi pasożytami, co w przypadku T. canis występuje bardzo rzadko (nie potwierdzono obecności jaj w kale). Sugeruje się, że T. cati częściej wywołuje OLM niż VLM [11]. Metody mikroskopowe natomiast, także wykorzystywane do diagnostyki toksokarozy, są mało obiektywne, gdyż silnie zależą od umiejętności i doświadczenia osoby badającej. Często w obrębie danego rodzaju pasożytów poszczególne gatunki nie wykazują ponadto znaczących różnic w morfologii lub tylko niektóre ich stadia rozwojowe umożliwiają różnicowanie. Poza tym, aby ocenić cechy budowy nicienia, konieczna jest jego izolacja z tkanek gospodarza. Chorzy nie wydalają jaj Toxocara spp. z kałem, a biopsja lub operacyjne usunięcie ziarniniaka powstałego wokół larwy w ludzkich narządach w celu wykonania serii histologicznych skrawków rzadko są możliwe. Dokładna identyfikacja nicieni w każdym stadium rozwojowym jest niezmiernie ważna do rozpoznania i leczenia choroby. Zazwyczaj poszczególne nicienie są identyfikowane i rozróżniane na podstawie ich cech morfologicznych, gospodarza, którego zaraziły, objawów u żywiciela i ich geograficznego pochodzenia. Kryteria te nie zawsze są jednak wystarczające, co może poważnie ograniczyć możliwości trafnej diagnozy [12]. Dlatego też w diagnostyce toksokarozy i pewnej identyfikacji organizmu pasożyta przewagę mogą mieć techniki oparte na badaniu materiału genetycznego [13, 14]. Znalezienie DNA pasożyta jest jednoznacznym świadectwem jego obecności. Wysoką czułością i specyficznością charakteryzują się jedynie metody biologii molekularnej, które zaczęto stosować w parazytologii po 1990 r.
Metody diagnostyki molekularnej
Podstawową techniką badawczą i diagnostyczną metod biologii molekularnej jest łańcuchowa reakcja polimerazy (ang. polimerase chain reaction – PCR), która w ciągu kilku godzin umożliwia amplifikację określonego fragmentu DNA w bardzo dużych ilościach [15]. Substraty niezbędne do przeprowadzenia PCR to matryca (DNA lub RNA), startery (krótkie fragmenty materiału genetycznego, od których rozpoczyna się reakcja), deoksynukleotydy, enzym – polimeraza – oraz bufory reakcyjne [2, 16]. W czasie trwania jednej reakcji przeprowadza się 30–40 cykli, na które składają się trzy etapy, tj. denaturacja cząsteczki DNA (rozdzielenie podwójnej nici na dwie pojedyncze, z których każda staje się następnie matrycą), przyłączanie starterów do odpowiednich sekwencji na powielanych niciach oraz synteza nowej nici między starterami przez enzym – polimerazę (wydłużanie zachodzi w ściśle określonej temperaturze ok. 72°C) [17, 18]. Do wykonania PCR wystarczają pikogramowe ilości DNA [16], co jest szczególnie ważne, gdy dysponuje się jedynie niewielką ilością materiału do badania. Łańcuchowa reakcja polimerazy może być przydatnym molekularnym narzędziem do badania materiału biopsyjnego lub próbek z autopsji od chorych podejrzewanych o VLM czy OLM. Dzięki temu możliwe jest wyjaśnienie wielu problemów epidemiologicznych, takich jak względna częstość występowania określonych gatunków nicieni u ludzi [19]. Podstawowe znaczenie dla identyfikacji pasożytów przy użyciu metod PCR ma wybór odpowiedniego regionu DNA (marker genetyczny lub locus), który umożliwi odróżnienie danego gatunku od innych, a jednocześnie będzie wykazywał minimalną zmienność wewnątrzgatunkową. Zidentyfikowane na podstawie morfologii dorosłe osobniki T. canis, T. cati i T. leonina mogą być rozróżniane dzięki ich ITS-2 sekwencjom [20]. Wewnętrzne sekwencje rozdzielające (ang. internal transcribed spacer – ITS) to niekodujące regiony sekwencji DNA (tzw. rybosomalnego DNA – rDNA), które oddzielają geny kodujące rybosomalny RNA. Sekwencje te między gatunkami różnią się o ok. 26–50%, co jest znamiennie większe od wewnątrzgatunkowych polimorfizmów (0–0,6%) [21]. Dodatkowo są one wielokrotnie powtarzane w genomie, grupują się w zespoły i rodziny, dzięki czemu możliwa jest ich detekcja nawet w niewielkiej próbce materiału, co podwyższa czułość badania [22]. Porównując sekwencje ITS1 i ITS2 dla T. canis, T. cati i T. leonina, stworzono startery umożliwiające amplifikację odpowiednich fragmentów DNA w reakcji PCR. Wspólne startery dla ITS1 i ITS2 oraz 5.8S mają następującą sekwencję NC5 5’-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3’ oraz NC2 5’TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT 3’. W celu amplifikacji fragmentów charakterystycznych dla poszczególnych gatunków używa się natomiast odrębnych par starterów [19]. Ważną zaletą reakcji PCR ze starterami komplementarnymi do ITS2 konkretnych gatunków Toxocara jest fakt, że nie są wtedy jednocześ- nie powielane fragmenty DNA pochodzące z tkanek gospodarza. Umożliwia to wykrywanie larw nicieni bezpośrednio w homogenacie tkanki pochodzącej z biopsji czy w płynach ustrojowych pacjenta. Nie ma konieczności izolacji pasożyta czy wykonywania serii histologicznych skrawków w celu lokalizacji larwy [13, 23]. W diagnostyce ludzkiej toksokarozy stosuje się także technikę PCR-RFLP [24] – połączenie łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) z analizą polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (ang. restriction fragment length polymorphism – RFLP). Polega ona na amplifikowaniu DNA pasożytów, a następnie trawieniu produktów PCR endonukleazami restrykcyjnymi i analizowaniu ich w świetle UV po elektroforetycznym rozdziale w żelu agarozowym (ryc. 1.). Do identyfikacji Toxocara spp. wykorzystuje się enzymy restrykcyjne Hinf1 oraz Rsa1. Trawienie powielonego DNA endonukleazą Hinf1 pozwala odróżnić gatunki Toxocara od innych nicieni mogących pasożytować w ludzkich tkankach. Sekwencje ITS2 T. canis i T. cati nie są podatne na cięcie tym enzymem, podczas gdy kwasy nukleinowe pokrewnych gatunków, takie jak T. leonina, Ascaris suum czy A. lumbricoides mają sekwencje rozpoznawane przez Hinf1. Endonukleazę Rsa1 stosuje się natomiast do rozróżnienia T. canis od T. cati, gdyż przecina ich DNA w różnych miejscach. Materiał po amplifikacji regionu ITS2 pochodzący z T. cati przy użyciu Rsa1 rozcinany jest na trzy fragmenty (110, 160 i 280 pb), a pochodzący od T. canis na 2 (250 i 290 pb) [23]. Szybką i łatwą do przeprowadzenia metodą umożliwiającą wykrywanie pasożytów o nieznanych gatunkowo swoistych sekwencjach DNA jest losowa amplifikacja polimorficznego DNA RAPD-PCR (ang. random amplification of polymorphic DNA – RAPD). W metodzie tej do reakcji PCR używa się krótkie, przypadkowo dobrane startery, a pasożyta identyfikuje się na podstawie wzoru elektroforetycznego produktu [25, 26]. W przypadku T. canis i T. cati przy użyciu tej metody otrzymuje się produkt wielkości 293 pb, a nie są jednocześnie namnażane fragmenty DNA innych nicieni, takich jak A. lumbricoides, A. lumbricoides suum czy Anisakis simplex [23]. Niestety, metoda RAPD-PCR ma poważną wadę, jaką jest brak specyficzności starterów i możliwość jednoczesnej amplifikacji, a potem migracji podczas elektroforezy, niehomologicznych fragmentów pochodzących z zanieczyszczeń [21]. Rozróżnianie sekwencji różniących się tylko jednym lub kilkoma nukleotydami umożliwia z kolei analiza polimorfizmu konformacyjnego jednoniciowego DNA (ang. single strand conformation polymorphism – SSCP) [12, 27]. Technika ta polega na analizie szybkości migracji pojedynczych nici DNA w niedenaturującym żelu poliakryloamidowym. Każda cząsteczka jednoniciowego DNA przybiera charakterystyczną konformację, która jest wynikiem parowania się komplementarnych zasad między nukleotydami, dzięki czemu w żelu migrują z określoną prędkością. Jeżeli natomiast zmieni się pierwszorzędowa struktura kwasu dezoksyrybonukleotydowego, nawet w wyniku punktowej mutacji, ma to swoje odbicie w odmiennej konformacji drugorzędowej i trzeciorzędowej. Cząsteczka taka migruje już z inną prędkością (ryc. 2.). Technikę SSCP wykorzystuje się do wykrywania zmienności w obrębie gatunku czy indywidualnych osobników, badania mechanizmów ewolucji i dziedziczenia. Stanowi ważne narzędzie do monitorowania genów ulegających i nieulegających ekspresji oraz poszukiwania mutacji w allelach, odpowiedzialnych za oporność na leki. Zbyt intensywne wykorzystywanie niektórych leków mogło bowiem doprowadzić do selekcji w heterogennych populacjach nicieni [12].
Podsumowanie
Metody molekularne w diagnostyce zakażeń i inwazji są stosowane stosunkowo od niedawna, dlatego brak jeszcze standardów pracy laboratoryjnej, które zminimalizowałyby prawdopodobieństwo fałszywie ujemnych i fałszywie dodatnich wyników. Dotyczy to zwłaszcza technik związanych z PCR, dla których niezwykle ważna jest kontrola jakości. Mimo to, techniki biologii molekularnej są najbardziej wiarygodnymi metodami w identyfikacji gatunków pasożytów i diagnostyce chorób przez nie wywoływanych. Mogą w istotny sposób wspomóc i uzupełniać tradycyjne metody rozpoznawania toksokarozy z korzyścią zarówno dla pacjenta, jak i lekarza.
Praca finansowana z grantu nr 2 PO5E 015 27.

Piśmiennictwo
1. Kornaś S, Nowosad B, Skalska M. Występowanie glisty Toxocara canis u psów w krakowskim schronisku dla bezdomnych zwierząt. Wiad Parazyt 2001; 47: 755-62. 2. Borecka A, Dobosz S, Gawor J i wsp. Toksokaroza – epidemiologia, klinika, diagnostyka, leczenie i zapobieganie. Agencja Reklamowo-Wydawnicza, Warszawa 2005. 3. Mizgajska H. Helminth infections – permanent health problem and ecological conditions. Wiad Parazyt 1998; 44: 616. 4. Hozyasz K, Milanowski A. Toxocariasis – an underestimated problem in paediatrics. Med Wieku Rozwoj 2002; 6: 155-62. 5. Magnaval JF, Glickman LT, Dorchies P, Morassin B. Highlights of human toxocariasis. Korean J Parasitol 2001; 39: 1-11. 6. Despommier D. Toxocariasis: clinical aspects, epidemiology, medical ecology, and molecular aspects. Clin Microbiol Rev 2003; 16: 265-72. 7. Finsterer J, Auer H. Neurotoxocarosis. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2007; 49: 279-87. 8. de Visser L, Rothova A, de Boer JH i wsp. Diagnosis of ocular toxocariasis by establishing intraocular antibody production. Am J Ophthalmol 2008; 145: 369-74. 9. Żarnowska-Prymek H. Enhancement of laboratory diagnosis specificity in human toxocariasis. Wiad Parazytol 2001; 47: 489-96. 10. Smith HV. Antibody reactivity in human toxocariasis. W: Lewis JW, Maizels RM (red.). Toxocara and toxocariasis: clinical, epidemiological, and molecular perspectives. London, UK: Institute of Biology and the British Society for Parasitology 1993; 91-109. 11. Fisher M. Toxocara cati: an underestimated zoonotic agent. Trends Parasitol 2003; 19: 167-70. 12. Gasser RB, Chilton NB. Applications of single-strand conformation polymorphism (SSCP) to taxonomy, diagnosis, population genetics and molecular evolution of parasitic nematodes. Vet Parasitol 2001; 101: 201-13. 13. Gasser RB. Molecular taxonomic, diagnostics and genetic studies of parasitic helminthes. Int J Parasitol 2001; 31: 860-4. 14. Zhu XQ, Gasser RB, Chilton NB, Jacobs DE. Molecular approaches for studying ascaridoid nematodes with zoonotic potential, with an emphasis on Toxocara species. J Helminthol 2001; 75: 101-8. 15. Gasser RB. PCR-based technology in veterinary parasitology. Vet Parasitol 1999; 84: 229-58. 16. Biologia molekularna w medycynie. Elementy genetyki klinicznej. Bal J (red.). Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2007. 17. Borecka A, Gawor J. Modification of gDNA extraction from soil for PCR designed for the routine examination of soil samples contaminated with Toxocara spp. eggs. J Helmintol 2007; 82: 119-22. 18. Fogt-Wyrwas R, Jarosz W, Mizgajska-Wiktor H. Utilizing a polymerase chain reaction method for the detection of Toxocara canis and T. cati eggs in soil. J Helminthol 2007; 81: 75-8. 19. Li MW, Lin RQ, Chen HH i wsp. PCR tools for the verification of the specific identity of ascaridoid nematodes from dogs and cats. Mol Cell Probes 2007; 21: 349-54. 20. Ishiwata K, Shinohara A, Yagi K i wsp. Identification of tissue-embedded ascarid larvae by ribosomal DNA sequencing. Parasitol Res 2004; 92: 50-2. 21. Gasser RB. Molecular tools – advances, opportunities and prospects. Vet Parasitol 2006; 136: 69-89. 22. Długosz E, Wiśniewski M. Wykorzystanie sekwencji genu rDNA w molekularnej diagnostyce parazytologicznej. Wiad Parazytol 2006; 52: 263-9. 23. Fogt R. Molecular techniques applied in species identification of Toxocara. Wiad Parazytol 2006; 52: 31-5. 24. Morgan UM. Detection and characterisation of parasites causing emerging zoonoses. Int J Parasitol 2000; 30: 1407-21. 25. Epe C, Meuwissen M, Stoye M, Schnieder T. Transmission trials, ITS2-PCR and RAPD-PCR show identity of Toxocara canis isolates from red fox and dog. Vet Parasitol 1999; 84: 101-12. 26. Wędrychowicz H. Przydatność metody PCR i jej modyfikacji do diagnozowania inwazji pasożytniczych u przeżuwaczy. Wiad Parazytol 2000; 46: 295-304. 27. Zhu XQ, Gasser RB. Single-strand conformation polymorphism (SSCP)-based mutation scanning approaches to fingerprint sequence variation in ribosomal DNA of ascaridoid nematodes. Electrophoresis 1998; 19: 1366-73.