Distribution of Malassezia species in patients with psoriasis – quality assessment

Wprowadzenie

Grzyby z rodzaju Malassezia należą do oportunistów o istotnym znaczeniu klinicznym u ludzi i niektórych zwierząt. Mogą być izolowane ze zdrowej skóry oraz powodować pewne choroby dermatologiczne, a w przypadku znacznego obniżenia odporności mogą się także przyczyniać do wystąpienia zakażeń ogólnoustrojowych. Do naj­częściej występujących dermatoz związanych z zakażeniem grzybami z rodzaju Malassezia u ludzi należą łupież pstry (pityriasis versicolor) i zapalenie mieszków włosowych (Malassezia folliculitis). Grzyby z rodzaju Malassezia mogą również nasilać zmiany chorobowe w takich schorzeniach, jak łojotokowe zapalenie skóry i trądzik pospolity, oraz zaostrzać przebieg łuszczycy i atopowego zapalenia skóry [1–6]. Częstość powierzchownych zakażeń grzybiczych wywołanych przez grzyby z rodzaju Malassezia zależy od wielu czynników, w tym od warunków socjoekonomicznych, klimatycznych czy geograficznych. Dzięki badaniom biologii molekularnej zidentyfikowano obecnie 13 gatunków Malassezia, w tym 12 lipidozależnych (M. furfur, M. globosa, M. obtusa, M. sympodialis, M. slooffiae, M. nana, M. dermatis, M. restricta, M. equina, M. japonica, M. yamatoensis i M. caprae) oraz 1 lipidoniezależny (M. pachydermatis) [1, 6–9].
Łuszczyca (psoriasis) jest jedną z najczęściej występujących genetycznie uwarunkowanych chorób skóry. Szacuje się, że ok. 1–5% populacji europejskiej choruje z powodu łuszczycy. Patogeneza tej choroby nie jest do końca poznana. Istnieje wiele czynników predysponujących do wystąpienia łuszczycy. Zalicza się do nich czynniki genetyczne (antygeny układu HLA: HLA-A2, HLA-B13, HLA-B17, HLA-B27, HLA-Bw57, HLA-Cw2, HLA-Cw6, HLA-DR7), immunologiczne oraz środowiskowe (uraz, światło, infekcje) [10, 11]. Zakażenia zarówno systemowe, jak i miejscowe wywołane przez paciorkowce -hemolizujące czy grzyby z rodzaju Candida są znanym czynnikiem inicjującym epizod łuszczycy wysiewnej i zaostrzającym przebieg łuszczycy plackowatej. W wielu badaniach wykazano, że stymulacja leukocytów jednojądrzastych krwi obwodowej pacjentów z łuszczycą przez superantygeny paciorkowców grupy A wiązała się ze znacznie zwiększoną odpowiedzią proliferacyjną oraz uwalnianiem cytokin prozapalnych przez leukocyty [12]. W badaniu przeprowadzonym przez Okubo i wsp. zaobserwowano zwiększoną ekspresję bakteryjnego 16S rybosomalnego RNA (rRNA) oraz grzybiczego 18S rRNA w monocytach krwi obwodowej pacjentów z łuszczycą, świadczącą o nadmiernej aktywacji monocytów przez drobnoustroje u tych osób [13].

Cel pracy

Ocena częstości występowania grzybów z rodzaju Malassezia na skórze pacjentów z łuszczycą zwyczajną oraz określenie zależności między występowaniem Malassezia a stopniem zaawansowania zmian skórnych oraz wiekiem i płcią pacjenta.

Materiał i metody

Grupa badana



Grupę badaną stanowili pacjenci obu płci, powyżej 18. roku życia, u których rozpoznano łuszczycę zwyczajną. Nasilenie zmian łuszczycowych określano wskaźnikami PASI (psoriasis area and severity index) i powierzchni ciała (body surface area – BSA).

Izolacja i identyfikacja Malassezia sp.

Od każdego pacjenta pobierano za pomocą jałowych wymazówek zwilżonych w soli fizjologicznej materiały do badań mikologicznych w postaci czterech wymazów z okolic skóry bogatych w gruczoły łojowe:
• z owłosionej skóry głowy,
• z twarzy (bruzd nosowo-wargowych i czoła),
• z klatki piersiowej (okolicy mostkowej),
• z pleców (okolicy międzyłopatkowej).
Wymazy były pobierane zarówno ze skóry chorobowo zmienionej, jak i zdrowej. Materiały kliniczne posiewano na zmodyfikowane podłoże Dixona o składzie: ekstrakt słodowy 36 g, pepton 6 g, żółć wołowa 20 g, Tween 40 10 ml, glicerol 2 ml, kwas oleinowy 2 ml, chloramfenikol 250 mg, agar 12 g i woda destylowana 1000 ml. Hodowlę prowadzono w temperaturze 30°C przez 10 dni. Grzyby Malassezia sp. identyfikowano do poziomu rodzaju na podstawie morfologii kolonii, wyglądu mikroskopowego komórek grzyba w preparatach z hodowli, badając zdolność do wzrostu bez dodatku związków lipidowych oraz wykonując próbę na ureazę na stałym podłożu Christensena z dodatkiem Tween 40 i Tween 80.

Analiza statystyczna

Zebrane dane opracowano przy użyciu języka i środowiska do obliczeń statystycznych R w wersji 2.9.1 (2009 r.).

Wyniki

Wyniki badania przedstawiono w tab. 1. i na ryc. 1., 2. Badaniu poddano łącznie 52 pacjentów z łuszczycą w wieku 20–74 lat, w tym 20 kobiet i 32 mężczyzn.
Malassezia sp. wyizolowano od 30 badanych pacjentów (57,7%). Częstość izolacji grzybów tego rodzaju u kobiet wyniosła 50,0% (10 pacjentek), a u mężczyzn 62,5% (20 pacjentów). Łącznie z różnych lokalizacji wyizolowano 51 izolatów Malassezia sp. – 18 izolatów od kobiet i 33 izolaty od mężczyzn. Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic dotyczących częstości izolacji Malassezia między mężczyznami a kobietami (test 2, p = 0,3747).
Grzyby z rodzaju Malassezia najczęściej izolowano z klatki piersiowej. Łącznie z tego miejsca uzyskano 19 izolatów, co stanowiło 37,3% ogółu przypadków izolacji Malassezia (7 izolatów od kobiet – 38,9%, i 12 izolatów od mężczyzn – 36,4%). Najrzadziej Malassezia sp. izolowano z owłosionej skóry głowy (5 izolatów – 9,8%), dotyczyło to zarówno kobiet, jak i mężczyzn (1 izolat od kobiet – 5,6%, i 4 izolaty od mężczyzn – 12,1%). Z pleców i twarzy Malassezia sp. izolowano z porównywalną częstością 27,5% i 25,5% – odpowiednio 33,3% (6 izolatów) i 22,2% (4 izolaty) od kobiet oraz 24,2% (8 izolatów) i 27,3% (9 izolatów) od mężczyzn. W przypadku połowy badanych pacjentów, u których stwierdzono występowanie Malassezia sp. (50% kobiet i 55% mężczyzn), grzyby te izolowano tylko z jednego miejsca ciała. Malassezia sp. uzyskiwano jednocześnie z 2 i 3 lokalizacji ciała z częstością 20% i 30% od kobiet oraz 25% i 20% od mężczyzn. Nie izolowano Malassezia sp. jednocześnie z 4 badanych miejsc ciała. W badaniu nie zaobserwowano różnic dotyczących częstości izolacji Malassezia między skórą zdrową i chorobowo zmienioną. W badaniu nie odnotowano różnic dotyczących występowania Malassezia w zależności od wieku pacjentów (test U Manna-Whitneya, p = 0,7456).
Nasilenie zmian łuszczycowych wyrażone wskaźnikiem PASI mieściło się w przedziale 1,8–20, średnio wynosiło 9,4. Większe wartości PASI stwierdzano w grupie pacjentów, od których izolowano Malassezia (test U Manna-Whitneya, p < 0,001). Nie zaobserwowano różnic w wartościach PASI w zależności od płci.
Rozległość zmian skórnych określona wskaźnikiem BSA u badanych pacjentów zawierała się w przedziale 5–70%, średnia wynosiła 23,8%. W grupie pacjentów z Malassezia obserwowano większe wartości BSA (test U Manna-Whitneya, p = 0,003462). Obecność Malassezia nie miała wpływu na wartości BSA w badanej grupie mężczyzn (test t-Studenta, p = 0,08142), natomiast kobiety, od których izolowano Malassezia, wykazywały istotne statystycznie większe wartości BSA (test U Manna-Whitneya, p = 0,01776).

Omówienie wyników

Wiele badań klinicznych i przedklinicznych potwierdza udział grzybów z rodzaju Malassezia w rozwoju zmian łuszczycowych. Wysiew grudek łuszczycowych w miejscach aplikacji ekstraktów zawierających komórki Malassezia obserwowano zarówno u ludzi, jak i w badaniach przeprowadzonych na zwierzętach [14, 15]. W badaniach klinicznych wykazano również zmniejszenie nasilenia łuszczycy po zastosowaniu doustnych i miejscowych leków przeciwgrzybiczych (bifonazol, ketokonazol) [16, 17]. Obecnie uważa się, że grzyby z rodzaju Malassezia mogą zaostrzać przebieg łuszczycy wskutek uwalniania cytokin prozapalnych, zwłaszcza interleukiny 8, dzięki aktywacji tzw. receptorów żetonowych (toll-like receptor) typu II [18]. W następstwie inkubacji keratynocytów z grzybami z rodzaju Malassezia obserwowano również zwiększoną ekspresję TGF-1 oraz białek szoku cieplnego – HSP70, w keratynocytach [19]. Do innych mechanizmów mogących uczestniczyć w indukcji zmian skórnych należą: aktywacja układu dopełniacza, chemotaksja neutrofilów oraz zwiększona migracja innych komórek immunologicznych do skóry pod wpływem infekcji Malassezia [20, 21]. Wysoka aktywność enzymatyczna grzybów z rodzaju Malassezia, w szczególności produkcja lipaz, może stanowić mechanizm spustowy inicjujący proces zapalny w skórze pod wpływem aktywacji kaskady kwasu arachidonowego. Do innych istotnych w aktywacji stanu zapalnego enzymów produkowanych przez Malassezia należą lipooksygenaza oraz lipoperoksydaza. Utlenianie wolnych i zestryfikowanych kwasów tłuszczowych błon komórkowych przez wymienione enzymy powoduje uszkodzenie komórek i rozwój procesu zapalnego [22].
Przedstawiana w piśmiennictwie częstość kolonizacji skóry przez grzyby z rodzaju Malassezia u pacjentów z łuszczycą wynosi 50–90%. Różnice te wynikają głównie z zastosowanej metody badawczej. W badaniach autorów niniejszej pracy grzyby z rodzaju Malassezia izolowano od 57,7% pacjentów z łuszczycą, najczęściej (37,3%) z okolicy klatki piersiowej. Podobne wyniki uzyskali Zomorodian i wsp. [23] oraz Gupta i wsp. [2]. U 27,5% pacjentów z łuszczycą stwierdzono kolonizację przez Malassezia sp. okolicy międzyłopatkowej, a u 25,5% badanych kolonizację skóry twarzy. Pozytywne wyniki hodowli najrzadziej uzyskiwano z wymazów pobranych z owłosionej skóry głowy (9,8%), co może wynikać z częstego stosowania przez pacjentów dostępnych bez recepty szamponów przeciwłupieżowych. Zaobserwowano większe nasilenie łuszczycy określane wg PASI u pacjentów z kolonizacją skóry przez Malassezia. W grupie mężczyzn nie stwierdzono istotnego wpływu kolonizacji grzybami Malassezia na wartości wskaźnika BSA, natomiast w grupie kobiet izolacji Malassezia towarzyszyły większe wartości tego wskaźnika. Znacząco częstsza izolacja grzybów z rodzaju Malassezia u pacjentów z większym nasileniem zmian skórnych może potwierdzać udział tych grzybów w rozwoju zmian łuszczycowych i zaostrzaniu przebiegu łuszczycy. W badaniu nie zaobserwowano natomiast zależności między częstością izolacji Malassezia i wiekiem oraz płcią pacjentów.
Do najczęściej izolowanych gatunków Malassezia u pacjentów z łuszczycą należą M. furfur, M. restricta oraz M. globosa. Większa aktywność enzymatyczna M. furfur w porównaniu z innymi gatunkami Malassezia może dodatkowo nasilać przebieg łuszczycy w związku z aktywacją kaskady kwasu arachidonowego [23, 24]. Charakterystyka gatunkowa oraz enzymatyczna izolowanych szczepów będzie przedmiotem dalszych badań prowadzonych w Zakładzie Mykologii.

Praca została wykonana w Zakładzie Mykologii Katedry Mikrobiologii Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum w Krakowie.



Piśmiennictwo

 1. Dworecka-Kaszak B, Adamski Z. Zakażenia grzybami z rodzaju Malassezia. Wydawnictwo SGGW, Warszawa 2005; 61-114.  
2. Gupta AK, Batra R, Bluhm R, et al. Skin diseases associated with Malassezia species. J Am Acad Dermatol 2004; 51: 785-98.  
3. Diaz MR, Boekhout T, Theelen B, et al. Microcoding and flow cytometry as a high-through put fungal identification system for Malassezia species. J Med Microbiol 2006; 55: 1197-209.  
4. Batra R, Boekhout T, Guého E, et al. Malassezia Baillon, emerging clinical yeasts. FEMS Yeast Res 2005; 5: 1101-13.  
5. Ashbee HR. Recent developments in the immunology and biology of Malassezia species. FEMS Immunol Med Microbiol 2006; 47: 14-23.  
6. Cabanes FJ, Theelen B, Castellá G, Boekhout T. Two new lipid-dependent Malassezia species from domestic animals. FEMS Yeast Res 2007; 7: 1064-76.  
7. Hirai A, Kano R, Makimura K, et al. Malassezia nana sp. nov., a novel lipid-dependent yeast species isolated from animals. Int J Syst Evol Microbiol 2004; 54: 623-7.  
8. Sugita T, Takashima M, Kodama M, et al. Description of a new yeast species, Malassezia japonica, and its detection in patients with atopic dermatitis and healthy subjects. J Clin Microbiol 2003; 41: 4695-9.  
9. Sugita T, Tajima M, Takashima M, et al. A new yeast, Malassezia yamatoensis, isolated from a patient with seborrheic dermatitis, and its distribution in patients and healthy subjects. Microbiol Immunol 2004; 48: 579-83.
10. Jabłońska S, Majewski S. Choroby skóry i choroby przenoszone drogą płciową. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2005.
11. Braun-Falco O, Plewig G, Wolff H, Burgdorf W. Erythemato-papulo-squamous diseases. In: Dermatology. Ed. 2. Springer Verlag, Berlin 2000; 585-608.
12. Baker BS, Bokth S, Powles AV, et al. Group A streptococcal antigen – specific T lymphocytes in guttae psoriatics lesion. Br J Dermatol 1993; 128: 493-9.
13. Okubo Y, Oki N, Takeda H, et al. Increased microorganisms DNA levels in peripheral blond monocytes from psoriatic patients using PCR with universal ribosomal RNA primers. J Dermatol 2002; 29: 547-55.
14. Lober CW, Belew PW, Rosenberg EW, Bale G. Patch test with killed sonicated microflora in patients with psoriasis. Arch Dermatol 1982; 118: 322-5.
15. Rosenberg EW, Belew PW, Bale G. Effect of topical applications of heavy suspensions of killed Malassezia ovalis on rabbit skin. Mycopathologia 1980; 72: 147-54.
16. Farr PM, Krause LB, Marks JM, Shuster S. Response of scalp psoriasis to oral ketoconazole. Lancet 1985; 2: 921-2.
17. Alford RH, Vire CG, Cartwright BB, King LE. Ketoconazole’s inhibition of fungal antigen-induced thymidine uptake by lymphocytes from patients with psoriasis. Am J Med Sci 1986; 291: 75-80.
18. Baroni A, Orlando M, Donnarumma G, et al. Toll-like receptor 2 (TLR2) mediates intracellular signaling in human keratinocytes in response to Malassezia furfur. Arch Dermatol Res 2006; 297: 280-8.
19. Baroni A, Paoletti I, Ruocco E, et al. Possible role of Malassezia furfur in psoriasis: modulation of TGF-beta1, integrin and HSP70 expression in human keratinocytes and in the skin of psoriasis affected patients. J Cutan Pathol 2004; 31: 35-42.
20. Bunse T, Mahrle G. Soluble Pityrosporum – derived chemoattractant for polymorphonuclear leukocytes of psoriatic patients. Acta Derm Venerol 1996; 76: 10-2.
21. Mohla G, Brodell RT. Koebner phenomenon in psoriasis. A common response to skin trauma. Postgrad Med 1999; 106: 39-40.
22. Zawirska A. Grzyby z rodzaju Malassezia. Nowe informacje. Post Dermatol Alergol 2004; 2: 97-103.
23. Zomorodian K, Mirhendi H, Tarazooie B, et al. Distribution of Malassezia species in patients with psoriasis and healthy individuals in Tehran, Iran. J Cutan Pathol 2008; 35: 1027-31.
24. Mancianti F, Rum A, Nardoni S, Corazza M. Extracellular enzymatic activity of Malassezia spp. isolates. Mycopathologia 2001; 149: 131-5.