Effects of transdermal oestrogen replacement therapy on interleukin-6 production in postmenopausal women

Wstęp


Wyniki wielu badań wykazały, że estrogeny posiadają właściwości przeciwmiażdżycowe, jakkolwiek dokładne mechanizmy tego działania nie zostały w pełni poznane [2, 3, 4]. Miażdżyca w ostatnich latach zyskała miano przewlekłej choroby zapalnej [16], czego dowodem jest obecność nacieków komórek układu odpornościowego (makrofagów, limfocytów) w blaszkach miażdżycowych [8] oraz obecność markerów stanu zapalnego w surowicy krwi chorych na miażdżycę i/lub chorobę niedokrwienną serca [19]. Cytokiny są to hormonopodobne peptydy i niskocząsteczkowe białka wpływające na funkcje komórek i warunkujące ich wzajemne oddziaływanie. Do najbardziej znanych przedstawicieli cytokin zdolnych do indukcji stanu zapalnego należą: czynnik martwicy guza (TNF), interleukina-1 (IL-1), interleukina-8 (IL-8) oraz interleukina-6 (IL-6).

IL-6 jest plejotropową cytokiną o masie cząsteczkowej 26 kDa, produkowaną przez różne komórki organizmu ludzkiego. Bierze ona udział w regulowaniu odpowiedzi immunologicznej, hematopoezie oraz reakcji ostrej fazy [10]. Poza wpływem na odporność humoralną, aktywację limfocytów T [9], dojrzewanie megakariocytów [20] oraz produkcję białek ostrej fazy [13], zdaje się także brać udział w patogenezie różnych chorób, w tym także miażdżycy i jej późnych następstw [5, 7, 15,17, 18].

Celem naszej pracy było zbadanie wpływu przezskórnej estrogenoterapii na produkcję IL-6 u kobiet w wieku pomenopauzalnym. Być może przeciwmiażdżycowy efekt działania estrogenów związany jest z ich hamującym wpływem na produkcję IL-6 – cytokiny zdającej się odgrywać dużą rolę w patogenezie miażdżycy i jej późnych powikłań.


Materiał


W badaniach wzięło udział 50 zdrowych kobiet w wieku od 45 do 71 lat, z klinicznymi objawami niedoboru estrogenów i poziomami FSH >40 U/l. Pacjentki podzielono na 2 grupy. W grupie I znalazły się kobiety, które wyraziły chęć poddania się hormonalnej terapii zastępczej (grupa HTZ), natomiast w grupie II pacjentki, które nie wyraziły zgody na tego typu leczenie (grupa kontrolna). W tab. I przedstawiono ogólną charakterystykę badanych kobiet z obydwu grup. Po wykluczeniu przeciwwskazań do estrogenoterapii, kobiety z grupy HTZ rozpoczęły przyjmować 17β-estradiol w dawce 50 mg/dobę drogą przezskórną (Estraderm 50MX, Novartis PharmaAG, Bazyleja) przez wszystkie dni w mies. oraz 10 mg octanu medroksyprogesteronu (Provera, Pharmacia and Upjohn, Ascoli Piceno) drogą doustną przez 10 dni w mies. Od wszystkich kobiet przed oraz po 6. i 12. mies. obserwacji pobrano 20 ml krwi żylnej do badań. Zgoda na przeprowadzenie powyższych badań została wydana przez Niezależną Komisję Etyki Badań Naukowych przy Akademii Medycznej w Gdańsku.


Metody badawcze


1. Uzyskiwanie surowic
Surowice uzyskiwano z 5 ml krwi żylnej, którą pobrano do sterylnej probówki. Krew wirowano przez 15 min przy prędkości 2 500 obrotów/min. Następnie surowicę zbierano do sterylnych plastikowych probówek o pojemności 1 ml i przechowywano w temperaturze -70˚C do dnia badania.

2. Izolacja jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC)
15 ml krwi żylnej pobranej do sterylnej probówki na EDTA, rozcieńczano w buforowanym roztworze soli fizjologicznej (PBS) (Gibco BRL, Life Technologies, Berlin) w stosunku 1:1 i nawarstwiano na mieszaninę Ficollu (Amersham Pharmacia Biotech AG, Uppsala) i Uropoliny (Polfa, Starogard) o gęstości 1,077 g/ml. Następnie wirowano przez 15 min przy prędkości 2 500 obrotów/min. Pipetą pasterowską ściągano interfazę, która zawierała PBMC. Po 3-krotnym płukaniu komórek w PBS, zawieszano je w medium RPMI 1640 (Gibco BRL, Life Technologies, Berlin) z dodatkiem 5% płodowej surowicy cielęcej (FCS) (Gibco BRL, Life Technologies, Berlin).

3. Hodowle PBMC
Hodowle z PBMC zakładano na 24-dołkowych plastikowych płytkach zawieszając 1 x 10⁶ komórek w 1 ml medium RPMI 1640 z dodatkiem 5% FCS. Po 24 godz. inkubacji w temp. 37˚C, w atmosferze zawierającej 5% CO₂, w 100% wilgotności, zbierano nadsącze (supernatanty) znad hodowli i przechowywano w temperaturze -70˚C do dalszych oznaczeń.

4. Oznaczanie aktywności IL-6
Aktywność IL-6 w surowicy i supernatantach znad hodowli PBMC oznaczano używając linii komórkowej B9 wrażliwej na ludzką IL-6 (dar od dr Lucien Aarden, Holenderski Czerwony Krzyż, Amsterdam). Komórki B9 hodowano w medium RPMI 1640 z 2-merkaptoetanolem (2-ME), penicyliną, streptomycyną, glutaminą, pirogronianem i 10 U/ml ludzkiej rekombinowanej IL-6 (Sigma). Do dołków eksperymentalnych na 96-dołkowej, sterylnej plastikowej płytce płaskodennej dodawano 10 x 10³/50 (l komórek B9, uprzednio wypłukanych czystym RPBMI 1640, zawieszonych w medium zawierającym RPMI 1640, 5% FCS, 2 mM L-glutaminę oraz penicylinę i streptomycynę oraz 10 μl rozcieńczonej 1:10 próbki (badanej surowicy lub supernatantu znad hodowli PBMC). Próby wykonano w trzech powtórzeniach. Następnie płytki inkubowano przez 48 godz. w cieplarce w temp. 37˚C, w atmosferze zawierającej 5% CO² i 100% wilgotności. Żywotność komórek mierzono testem kolorymetrycznym przy użyciu (3-4.5 dimethylthiazol-2-yl)-2.5 diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) (Sigma, Steinheim). Po 48-godzinnej inkubacji do każdego dołka 96-dołkowej płytki dodano po 20 μl roztworu sterylnego MTT – o stężeniu 5 mg/ml i inkubowano przez następne 3 godz. w cieplarce w temp. 37˚C w atmosferze zawierającej 5% CO² i 100% wilgotności. Po inkubacji do każdego dołka dodawano 100 μl kwaśnego izopropanolu 0,04 NHCl i wytrząsano przez 15 min do rozpuszczenia kryształków MTT. Odczyt gęstości optycznej wykonano przy pomocy urządzenia Labsystems Multiscan^® MCC/340, przy długości fali 570 nm. Otrzymane wyniki z dołków eksperymentalnych porównywano z wynikami otrzymanymi z dołków zawierających seryjne rozcieńczenia ludzkiej rekombinowanej IL-6. Aby potwierdzić specyficzność testu do wybranych losowo dołków dodawano poliklonalne przeciwciało anty-IL-6 (Genzyme, Russelsheim) w mianie 1:10, 1:20 oraz 1:50 do wybranych dołków. Przeciwciało to całkowicie hamowało zdolność komórek B9 do IL-6 zależnej proliferacji.

5. Oznaczenia poziomów hormonów
Oznaczeń wyjściowych poziomów FSH i 17β-estradiolu w surowicy dokonano metodą immunoenzymatyczną przy użyciu komercyjnego zestawu firmy Abbott AxSYM (Abbott Park, IL, USA).

6. Statystyczne opracowanie wyników
Otrzymane wyniki analizowano przy użyciu programu komputerowego Statistica’99 dla Windows. Różnice pomiędzy dwoma badanymi grupami oceniano przy użyciu testu Studenta dla prób niezależnych. Wpływ HTZ na poziomy IL-6 oceniano testem Studenta dla prób zależnych.


Wyniki


Wyjściowe poziomy IL-6 w surowicy krwi oraz w nadsączach z hodowli PBMC kobiet z obydwu grup nie różniły się w obydwu badanych grupach (tab. I). Po 12. mies. obserwacji w surowicy kobiet z grupy HTZ, poziomy bioaktywnej IL-6 były znamiennie niższe po 12. mies. obserwacji w porównaniu do kobiet z grupy kontrolnej (6,62±4,68 pg/ml vs 9,5±5,4 pg/ml, p<0,05), u których doszło do niewielkiego ich wzrostu (ryc. 1.).
Ponadto w grupie kobiet przyjmujących HTZ produkcja bioaktywnej IL-6 przez niestymulowane PBMC znacznie się obniżyła po 12. mies. jej trwania (14,83±6,37 pg/ml vs 11,11±4,44 pg/ml, p<0,05) (ryc. 2.). W grupie kontrolnej spontaniczna produkcja IL-6 przez PBMC po 12. mies. obserwacji nieznacznie się zwiększyła, jakkolwiek różnica ta nie była istotna statystycznie (p>0,05).

Podsumowując uzyskane wyniki można stwierdzić, że przezskórna estrogenoterapia zmniejsza produkcję IL-6 u kobiet w wieku pomenopauzalnym.


Dyskusja


Wyniki licznych badań wykazały, iż estrogeny posiadają właściwości przeciwmiażdżycowe, a hormonalna terapia zastępcza opóźnia rozwój miażdżycy [3, 4]. Dokładne mechanizmy tego zjawiska nie zostały jednak w pełni poznane. IL-6 jako jeden z głównych mediatorów reakcji zapalnej, może brać udział w patogenezie miażdżycy i jej późnych następstw. Wyniki badań na zwierzęcym modelu miażdżycy dowiodły, iż 17β-estradiol hamuje ekspresję IL-6 w płytkach miażdżycowych [18].

Celem naszej pracy było zbadanie wpływu przezskórnego podawania 17β-estradiolu na produkcję IL-6 u kobiet w wieku pomenopauzalnym. Wyniki naszych badań wykazały, iż po 12. mies. przyjmowania przezskórnej estrogenoterapii, zarówno poziomy IL-6 w surowicy, jak i spontaniczna produkcja IL-6 przez niestymulowane PBMC była znamiennie niższa w porównaniu do kobiet, które nie wyraziły zgody na leczenie hormonalne i u których po roku obserwacji poziomy IL-6 w surowicy nieznacznie się podwyższyły. Poprzednie wyniki wieloletnich badań naszego zespołu wykazały, iż produkcja IL-6 rośnie wraz z wiekiem. Ponadto jednojądrzaste komórki krwi osób starych charakteryzują się konstytutywną ekspresją genu kodującego IL-6 [14]. Jaki jest jednak udział wzrastającej produkcji IL-6 w rozwoju miażdżycy? Okazuje się, iż IL-6 może brać zarówno pośredni, jak i bezpośredni udział w patogenezie miażdżycy i jej późnych powikłań. IL-6 posiada właściwości chemotaktyczne w stosunku do niektórych komórek, tworzących naciek w obrębie płytki miażdżycowej [1]. Ponadto poprzez zwiększanie produkcji płytkowego czynnika wzrostu (PDGF), IL-6 pobudza proliferację komórek mięśniówki gładkiej naczyń, co jest jednym z kluczowych mechanizmów aterogenezy [6]. Obecność podwyższonych poziomów IL-6 wiele lat przed wystąpieniem zawału serca sugeruje udział tej cytokiny w procesie uszkodzenia płytki miażdżycowej [15]. Aktywowane przez IL-6 limfocyty T są obecne w płytce miażdżycowej i prawdopodobnie poprzez produkowanie cytokin prozapalnych przyczyniają się do jej destabilizacji i rozerwania [11]. IL-6 jako silny induktor produkcji białek ostrej fazy, zwiększa stężenie fibrynogenu w surowicy [12]. Ponadto IL-6 stymuluje trombopoezę i aktywację trombocytów [20]. Te prokoagulacyjne efekty działania IL-6 zwiększają ryzyko zakrzepów oraz także prowadzą do destabilizacji płytki miażdżycowej. Stosowanie więc terapii zmniejszających nadmierną produkcję IL-6 może mieć działanie przeciwmiażdżycowe.


Wnioski


Podsumowując wyniki naszych badań, można stwierdzić, iż przezskórna estrogenoterapia zmniejsza produkcję IL-6 u kobiet w wieku pomenopauzalnym co może być jednym z pośrednich mechanizmów przeciwmiażdżycowego działania estrogenów.


Piśmiennictwo

1. Akira S, Kishimoto T. IL-6 and NF-IL-6 in acute-phase response and viral infection. Immunol Rev 1992; 127: 25-50.
2. Golden SH, Maguire A, Ding J, et al. Endogenous postmenopausal hormones and carotid atherosclerosis: a case-control study of the atherosclerosis risk in communities cohort. Am J Epidemiol. 2002; 155: 437-45.
3. Hodis HN, Mack WJ, Lobo R. Postmenopausal hormone replacement therapy as antiatherosclerotic therapy. Curr Atheroscler Rep 2002; 4: 52-8.
4. Holm P. Effect of estrogen on development of atherosclerosis. A review of experimental animal studies. Dan Med Bull 2001; 48: 146-60.
5. Huber SA, Sakkinen P, Conze D, et al. Interleukin-6 exacerbates early atherosclerosis in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1999; 19: 2364-7.
6. Ikeda U, Ikeda M, Oohara T, et al. Interleukin-6 stimulates growth of vascular smooth muscle cells in a PDGF-dependent manner. Am J Physiol 1991; 260: H1713-17.
7. Ikeda U, Ikeda M, Seino Y, et al. Interleukin – 6 gene transcripts are expressed in atherosclerotic lesions of genetically hyperlipidemic rabbits. Atherosclerosis 1992; 92: 213-8.
8. Jonasson L, Holm J, Skalli O, et al. Regional accumulations of T cells, macrophages, and smooth muscle cells in the human atherosclerotic plaque. Arteriosclerosis 1986; 6: 131-8.
9. Kuhweide R, Van Damme J, Lorre K, et al. Accessory cell-derived helper signals in human T-cell activation with phytohemagglutinin: induction of interleukin-2, responsiveness by interleukin-6 and production of interleukin-2 by interleukin-1. Cytokine 1990; 2: 45-54.
10. Le J, Vilcek L. Interleukin-6: a multifunctional cytokine regulating immune reactions and the acute phase protein response. Lab Invest 1998; 61: 588-602.
11. Libby P, Sukhova G, Lee RT, Galis ZS. Cytokines regulate vascular functions related to stability of the atherosclerotic plaque. J Cardiovasc Pharmacol 1995; 25 (suppl 2): S9-S12.
12. Margaglione M, Grandone E, Mancini FP, Di Minno G. Genetic modulation of plasma fibrinogen concentrations: possible importance of interleukin-6. J Thromb Thrombolysis 1996; 3: 51-6.
13. Mayer P, Geissler K, Valent P, et al. Recombinant human interleukin 6 is a potent inducer of the acute phase response and elevates the blood platelets in nonhuman primates. Exp Hematol 1991; 19: 688-96.
14. Myśliwska J, Bryl E, Foerster J, et al. Increase of interleukin-6 and decrease of interleukin-2 production during the ageing process are influenced by the health status. Mech Ageing Dev 1998; 100: 313-28.
15. Ridker PM, Rifai N, Stampfer MJ, Hennekens CH. Plasma concentration of interleukin-6 and the risk of future myocardial infarction among apparently healthy men. Circulation 2000; 101: 1767-72.
16. Ross R. Atherosclerosis – an inflammatory disease. N Engl J Med 1999; 340: 115-26.
17. Seino Y, Ikeda U, Ikeda M, et al. Interleukin 6 gene transcripts are expressed in human atherosclerotic lesions. Cytokine 1994; 6: 87-91.
18. Sukovich DA, Kauser K, Shirley FD, et al. Expression of interleukin-6 in atherosclerotic lesions of male ApoE-knockout mice: inhibition by 17beta-estradiol. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1998; 18: 1498-505.
19. Tracy R. Atherosclerosis, thrombosis and inflammation: a question of linkage. Fibrinol Proteolysis 1997; 11 (Suppl 1): 137-42.
20. Williams N, Bertoncello I, Jackson H, et al. The role of interleukin-6 in megakaryocyte formation, megacaryocyte development and platelet producion. Ciba Found Symp 1992; 167: 160-70.


Adres do korespondencji

Zakład Immunologii, Katedra Histologii i Immunologii AM w Gdańsku
ul. Dębinki 1
80-210 Gdańsk