Expression of interleukin-6 and its receptor subunits in the microenviroment of renal cell cancer

WSTĘP


Rak jasnokomórkowy jest najczęstszym nowotworem nerki, stanowiącym 3 proc. wszystkich nowotworów u ludzi dorosłych [1]. Rak ten występuje częściej u mężczyzn (5:1), głównie w 50.–70. roku życia. Tylko 37 proc. chorych z takim rozpoznaniem przeżywa 5 lat. U 30 proc. chorych w chwili rozpoznania obecne są już przerzuty w narządach odległych (płucach, tkankach miękkich, kościach, wątrobie). Rak jasnokomórkowy wywodzi się z nabłonka kanalików proksymalnych.



Interleukina 6 (IL–6) odgrywa ważną rolę w zapewnieniu sprawnego funkcjonowania mechanizmów obronnych organizmu. Jest produkowana przez szereg komórek układu immunologicznego (limfocyty T, aktywowane limfocyty B, makrofagi, monocyty – szczególnie po stymulacji). IL–6 moduluje wzrost szpiczaków, guzów szyjki macicy oraz hamuje wzrost niektórych guzów litych (raka gruczołu piersiowego, czerniaka, raka płuc, raka nerki). Wykazano również, że komórki niektórych nowotworów mogą tę cytokinę wytwarzać. Ostatnio wykazano autokrynową stymulację proliferacji komórek raka nerki IL–6. IL–6 wpływa na komórki poprzez wiązanie się z błonowym kompleksem receptorowym, który składa się z podjednostki alfa (gp 80, IL–6R) – wiążącej IL-6 oraz podjednostki beta (gp 130, CD 130) – przekaźnika sygnału [2]. Najpierw IL-6 łączy się z podjednostką alfa, następnie powstały kompleks przyłącza 2 podjednostki beta i dochodzi do przekazania sygnału do wnętrza komórki.



Celem pracy była ocena ekspresji IL–6 oraz podjednostki alfa i beta jej receptora w obrębie raka jasnokomórkowego nerki, w tkance zdrowej tej samej nerki i w pierwotnej hodowli komórek wyizolowanych z guza.



MATERIAŁY I METODY


Chorzy


44 chorych: 18 kobiet w wieku 41–81 lat (mediana 63) i 26 mężczyzn w wieku 39–86 lat (mediana 61) z rakiem jasnokomórkowym nerki zoperowano w latach 1997–1998 w Szpitalu im. J. Strusia w Poznaniu. U 17 chorych histopatologicznie rozpoznano carcinoma clarocellulare w stopniu G1, u 10 chorych w stopniu G2, a u 14 chorych carcinoma granulocelulare w stopniu G2.



Hodowle pierwotne

raka jasnokomórkowego nerki


Z 44 usuniętych operacyjnie guzów nerki o różnym typie histopatologicznym założono pierwotne jednowarstwowe hodowle komórkowe. W sterylnych warunkach tkankę rozkawałkowano, a następnie trawiono kolagenazą (0,14 proc.) i DNA-zą typu I (0,1 proc.). Wyizolowane komórki hodowano w pożywce DMEM i F12 (1:1), wzbogaconej w 10-procentową surowicę płodową cielęcą (FCS) i antybiotyk (gentamycynę).



Izolacja RNA z hodowanych komórek raka jasnokomórkowego nerki, tkanek nowotworowych oraz tkanki zdrowej


RNA izolowano stosując metodę Chomczyńskiego i Sazzil. Uzyskane RNA zawieszano w wodzie z dodatkiem DEPC i poddawano dalszej analizie.


Reakcja odwrotnej transkrypcji


Do 1 mg RNA rozpuszczonego w 4 ml sterylnej wody dodano 1 mg 50 M heksamerów i inkubowano przez 2 min w temp. 90°C. Do ochłodzonej do temp. 42°C mieszaniny dodano: 4 ml buforu 4RT, 8 ml 10 M dNTPs, 1 µl odwrotnej transkryptazy AMV (250U/ml) i 1 µl (280/ml) inhibitora RNA-zy. Następnie mieszaninę inkubowano przez 1 godz. w temp. 42°C.



Reakcja PCR


W celu amplifikacji fragmentów cDNA, uzyskanych w wyniku reakcji RT na matrycy RNA, przeprowadzono reakcje PCR, dodając do 1 µl mieszaniny reakcyjnej RT 9 µl roztworu Master-Mix, który zawierał primery swoiste dla poszczególnych czynników.



Primery dla receptora alfa i beta zostały skonstruowane na podstawie programu Oligo Vers 5.0. Primery dla GAPDH i IL–6 zostały skonstruowane na wzór opublikowanych wcześniej sekwencji. Wszystkie primery zostały wyprodukowane przez firmę Eurogentec (Belgia). Dla każdej pary primerów, biorąc pod uwagę temperaturę topnienia i długość produktu, ustalono warunki PCR. Poniżej przedstawiono sekwencje stosowanych primerów. Pod numerem 1. primer w orientacji sens, pod numerem 2. primer w orientacji anty-sens.



GAPDH

1:5’ GGT CGG AGT CAA CGG ATT TG 3’

2:5’ ATG ACG CCC AGCC CTT CTC CAT 3’



IL-6

1:5’ ATG AAC TCC TTC TCC ACA AGC GC 3’

2:5’ GAA GAG CCC TCA GGC TGG ACT G 3’



IL-6R

1:5’ TGC TGA CCA GTC TGC CAG GAG A 3’

2:5’ ACA CTA CTG GCG ACG CAC ATG 3’



gp130

1: 5’ TGT TGA CGT TGC AGA CTT GG 3’

2: 5’ TCT GGA GGC AAG CCT GAA AT 3’



Powstałe produkty oceniano poprzez analizę restrykcyjną. Każde badanie wykonywały niezależnie 2 osoby, powtarzając je 2-krotnie.



WYNIKI


Ekspresja interleukiny 6

w badanych tkankach


Ekspresję IL–6 w tkance zdrowej wykazano w 45 proc. analizowanych przypadków. W obrębie guza o stopniu zróżnicowania G1 IL–6 występowała w 81 proc. przypadków, a w stopniu zróżnicowania G2 w 80 proc. W hodowlach komórek nowotworowych ekspresję mRNA dla IL-6 wykazano w 41 proc. hodowli komórek guzów nerki o stopniu zróżnicowania G1 oraz w 68 proc. hodowli z guzów o stopniu zróżnicowania G2.


Analiza ekspresji receptora alfa IL-6


Ekspresja mRNA receptora alfa IL-6, w zdrowej tkance wyizolowanej z nerki usuniętej z powodu zmian nowotworowych występowała w 59 proc. przypadków. mRNA IL-6R obecne było w 100 proc. guzów o stopniu zróżnicowania G1 oraz w 80 proc. guzów G2. Hodowla komórek nowotworowych wyizolowanych z guzów o odpowiednim stopniu zróżnicowania wykazywała ekspresję mRNA IL-6R w 70,5 proc. przypadków guzów G1 oraz w 72 proc. przypadków guzów G2.



Ekspresja gp130 w badanych tkankach i hodowlach komórkowych


Ekspresję mRNA podjednostki beta (gp130) receptora IL-6 w tkance zdrowej wykryto w 70 proc. przypadków. W guzach o stopniu zróżnicowania G1 mRNA dla gp130 występowało w 83 proc., a w guzach G2 w 88 proc. przypadków. Hodowla komórek wyizolowanych z guzów scharakteryzowanych jako G1 lub G2 wykazywała ekspresję gp130 odpowiednio w 65 i 56 proc. przypadków.



DYSKUSJA


Badania autorów wykazały wyższą ekspresję IL–6 w mikrośrodowisku raka jasnokomórkowego nerki niż w tkance zdrowej pochodzącej z tego samego narządu. Pierwotne hodowle komórek nowotworowych wykazały, że w znacznym odsetku źródłem pochodzenia IL–6 są same komórki transformowane. Ponadto stwierdzono, że komórki pochodzące z guzów o stopniu zróżnicowania G2 wytwarzają więcej IL–6 niż komórki w stopniu G1. Również Costes i wsp. [3], stosując detekcję białka IL–6 w skrawkach tkankowych stwierdzili ekspresję w ok. 50 proc. przypadków. Tekanawa i wsp. [4], przy użyciu metody Northern Blot wykazali ekspresję mRNA IL–6 w ponad połowie przypadków. W badaniach autorów odsetek guzów, w których stwierdzono ekspresję mRNA IL–6 był wyższy. Jest to prawdopodobnie związane z zastosowaniem bardziej czułej metody.



IL–6 może oddziaływać na drodze autokrynowej i parakrynowej na komórki nowotworowe. Aby jednak były one w stanie odpowiedzieć na IL–6, muszą posiadać na powierzchni receptor dla IL–6. W związku z tym postanowiono ocenić ekspresję podjednostek receptora w badanych tkankach i hodowlach komórkowych. IL–6R obecny był we wszystkich preparatach nowotworowych o stopniu zróżnicowania G1, ale już tylko w 80 proc. preparatów G2. Niższa ekpresja obserwowana była w przypadku hodowli komórkowych, chociaż nie stwierdza się różnic między komórkami w stopniu G1 i G2. Costes i wsp. [3] wykazali, stosując metody RT–PCR, obecność mRNA dla IL–6R w 100 proc. guzów niezależnie od stopnia zróżnicowania. Jednak przy pomocy barwienia immunohistochemicznego wykryli białko IL–6R tylko w 26 proc. guzów. Różnica w odsetku nowotworów produkujących IL–6R może być związana z faktem, że nie we wszysktich komórkach dochodzi do translacji na matrycy zsyntnetyzowanego mRNA.



W przypadku zdrowej tkanki nerki, metodą RT–PCR wykazano obecność IL–6R w 59 proc. przypadków, podczas gdy Costes i wsp. [3] metodami immunohistochemicznymi wykazywali całkowity brak ekspresji IL–6R. Różnice w ocenie obecności tego białka mogą być spowodowane głównie metodami użytymi do wykrycia obecności IL–6R, jak również sposobem izolacji zdrowej tkanki nerki. Również Tekanawa i wsp. [4], przy pomocy RT–PCR wykazali obecność mRNA dla IL–6R w 100 proc. raków jasnokomórkowych nerek, ale ocena mRNA dla IL-6R metodą Northern Blot była dodatnia tylko w 26 proc. Nie ma doniesień na temat ekspresji podjednostki gp130 w raku nerki. Badania autorów wykazały wysoki odsetek preparatów, w których występowało mRNA dla gp130. Podobnie w hodowlach komórkowych – mRNA dla gp130 występowało rzadziej niż w preparatach operacyjnych. Zjawisko to może być związane ze zmianami komórek nowotworowych, zachodzącymi in vitro lub też wykazywać, że komórki te w trakcie transformacji tracą niektóre geny. Podobne zjawisko obserwowano w raku piersi [5].

Uzyskane wyniki wskazują na ważną rolę, jaką może odgrywać IL–6 w patogenezie raka nerki. Obserwuje się ekspresję genu dla IL–6 w mikrośrodowisku guza oraz odpowiednich podjednostek jej receptora, co podkreśla funkcjonalność omawianej cytokiny.


PIŚMIENNICTWO

1. Blay J-Y, Negrier S, Combaret V, Attali S, Goillot E, Merrouche Y, Mercatello A, Ravault A, Tourani J-M, Moskovtchenko J-F, Philip T, Favrot M. Serum level of IL-6 as a prognosis factor in metastatic renal cell carcinoma. Cancer Research 1992; 52: 3317-22.

2. Graeve L, Kolorenko TA, Hemman U, Weiergraber O, Dittrich E, Heinrich P C A complex of a soluble IL-6R and IL-6 is internalized via the signal transducer gp 130. FEBS Letters 1996; 399: 131-4.

3. Costes V, Liautard J, Picot M-C, Robert M, Lequeux N, Brochier J, Baldet P, Rossi J-F. Expression of the interleukin 6 receptor in primary renal cell carcinoma. J Clin Pathol 1997; 50: 835-40.

4. Tekanawa J, Kanako Y, Fukyumoto M, Fukatsu A, Hirano T, Fukuyama H. Enhanced expression of IL-6 in primary human renal cell carcinoma. J Natl Cancer Inst 1991; 83: 1668-72.

5. Karczewska A, Nawrocki S, Bręborowicz D, Filas V, Mackiewicz A. Expression of IL-6, IL-6R and gp130 correlates with good prognoses for patients with breast carcinoma. Cancer 2000; 88: 2061.


ADRES DO KORESPONDENCJI

Małgorzata Mackiewicz-Wysocka

Zakład Immunologii Nowotworów

Wielkopolskie Centrum Onkologii

ul. Garbary 1561-866 Poznań

e-mail: gmackiewicz@efis2000



*Praca sponsorowana przez KBN 4P05B 035 12