MMAC/PTEN gene expression in endometrial cancer – RT-PCR studies

Wstęp

W wielu krajach na całym świecie rejestruje się stały wzrost liczby chorych na raka błony śluzowej jamy macicy, w związku z czym choroba ta staje się poważnym problemem diagnostycznym i terapeutycznym. Rocznie odnotowuje się na świecie 150 tys. nowych zachorowań na raka endometrium (najwyższy wskaźnik zachorowalności we Flandrii, region Varese – 247/100 tys., 21 w USA, 2,7 w Japonii) [1]. Wyodrębniono co najmniej dwa typy raków. Typ I to głównie raki endometrioidalne (ang. endometrioid carcinoma), stanowią one do 80% raków endometrium i związane są głównie z rozrostem endometrium. Typ II to rzadszy typ nieendometrioidalny, wywodzący się z atroficznego endometrium [1]. Są to najczęściej raki surowicze (ang. serous), jasnokomórkowe (ang. clear cell) lub rzadziej brodawkowe (ang. papillary), czy płaskonabłonkowe (ang. squamous carcinomas) rozwijające się na podłożu atroficznej tkanki endometrium u starszych kobiet [2].
Czynnikami ryzyka raka endometrium są:
• otyłość,
• źle dobrana terapia hormonalna,
• dieta bogata w tłuszcze,
• cukrzyca,
• nadciśnienie tętnicze,
• predyspozycje rodzinne [3].
Czynniki prognostyczne nie dają jednak pełnego obrazu biologii nowotworu [4]. Dlatego istotne wydaje się badanie i poszukiwanie innych, nowych czynników rokowniczych.
Gen MMAC/PTEN jest genem supresorowym zlokalizowanym na chromosomie 10q, kodującym białko fosfatazę (fosfatydyloinozytol 3,4,5-trifoforan fosfatazy) modulującą wzrost komórek i proces apoptozy. Mutacje somatyczne w genie MMAC/PTEN stwierdza się w różnych nowotworach. Mutacje somatyczne lub delecje MMAC/PTEN wykrywa się w 40–76% raków endometrium [5–8]. W szczególności region 10q23 i 10q25-q26 mogą być silnie związane z kancerogenezą raka endometrium [9, 10]. Mutacje genu MMAC/PTEN spotyka się w 22% rozrostów endometrium zarówno bez, jak i z atypią [11, 12].
Kappes i wsp. wykazali znaczące zmniejszenie poziomu ekspresji MMAC/PTEN w raku endometrium w porównaniu z prawidłowym endometrium [13].
Dla lepszego zrozumienia wpływu MMAC/PTEN w kancerogenezie raka endometrium analizowano ekspresję tego genu u kobiet z rakiem endometrium.

Materiały i metody


Pacjentki

Materiał do badań stanowiły bloczki parafinowe pochodzące z archiwum Zakładu Patomorfologii Klinicznej Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi. W badaniach uczestniczyło 70 kobiet w wieku 58–71 lat (średnia 68 lat). Wszystkie przypadki zostały określone wg kryteriów FIGO (International Federation of Gynaecology and Obstetrics). Do badań zakwalifikowano 15 nowotworów I stopnia, 43 II stopnia i 12 III stopnia. Grupę kontrolną stanowiły próbki uzyskane z prawidłowego endometrium (n=68).

Izolacja RNA i reakcja RT-PCR

Izolację mRNA przeprowadzono z zastosowaniem TRIzol^RReagents (Invitrogen^TM, San Diego, CA) zgodnie z zaleceniami producenta. cDNA uzyskano w reakcji odwrotnej transkrypcji przy użyciu zestawu firmy Invitrogen^TM. Sekwencje starterów w reakcji PCR amplifikujące region od 117 do 741 pz były następujące: F1- 5' CAGAAAGACTTGAAGGCGTAT 3' i B1- 5' AACGGCTGAGGGAACTC 3'). Startery do amplifikacji a-enolazy obejmujące region od 77 do 532 pz: EF1- 5' TGGCAGGATGACTTCAGA 3' i EB1- 5' AGTGGCTAGAAGTTCACC 3'. Reakcja PCR została przeprowadzona w DNA Thermal Cycler (GeneAmp PCR System 2400; Perkin-Elmer, Norwalk, CT, U.S.A.). Warunki reakcji były następujące 45 s w 94°C, 45 s w 54°C, 1 min w 72°C, powtórzenie 40 cykli. Mieszanina reakcyjna 25 ml zawierała 100 ng cDNA, 1 ml każdego startera (ARK Scientific GmbH Biosystems, Darmstad, Germany), 1,5 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTP (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) i 1 jednostkę Taq Polymerase (Qiagen GmbH, Hilden, Germany). Produkt PCR był analizowany w 2-procentowym żelu agarozowym po barwieniu bromkiem etydyny.

Wyniki

Ekspresję genu MMAC/PTEN stwierdzono w 46% przypadków raka endometrium (32/70) i w 62% próbek kontrolnych (42/68). Ekspresja MMAC/PTEN w próbkach komórek guza była znacząco zredukowana w porównaniu z poziomem ekspresji w tkankach prawidłowych
(p<0,05).
Zależność poziomu ekspresji MMAC/PTEN od stopnia zaawansowania nowotworu u pacjentek z rakiem endometrium przedstawiono w tab. I. Ekspresja MMAC/PTEN w stopniu III była znacząco zredukowana w porównaniu z niższymi stopniami zaawansowania raka endometrium.

Dyskusja

Wiadomo, że rozwój raka endometrium jest związany z akumulacją pewnych specyficznych zmian genetycznych. W procesie nowotworzenia biorą udział
3 główne grupy genów. Zmiany w genach reprezentujących wszystkie klasy zostały zidentyfikowane w rakach endometrium. W warunkach prawidłowych podlegają one kontrolowanej ekspresji podczas embriogenezy, różnicowania i proliferacji komórek, natomiast ich mutacje prowadzą do zaburzenia tych procesów i w konsekwencji do transformacji nowotworowej. Są to:
• onkogeny,
• geny supresorowe,
•·geny mutatorowe.
Gen MMAC/PTEN, którego mutacje stwierdza się w licznych nowotworach, koduje glikoproteinę o masie 54 kDa, która działa jako specyficzna fosfataza. U ludzi z konstytutywnymi mutacjami PTEN stwierdza się dziedziczne predyspozycje do nowotworów złośliwych określane jako choroba Cowdena, charakteryzująca się wysoką częstością raków piersi, tarczycy i innych w połączeniu z hamartoma wielu organów. Stwierdza się tendencję zwiększonego ryzyka raka endometrium u kobiet z chorobą Cowdena, lecz prace nad tym zagadnieniem wymagają dalszych badań [8, 9]. MMAC/PTEN jest genem często zmutowanym w raku endometrium. Mutacje MMAC/PTEN wykrywa się w 33–55% raków endometrium [14–16].
W naszej pracy przeprowadzonej w grupie 70 kobiet z rakiem endometrium zaobserwowano, że ekspresja MMAC/PTEN była znacząco niższa u chorych niż w kontroli. Dane literaturowe wskazują, że podobne wyniki zaobserwowano w raku prostaty [17], tarczycy [18] oraz raku piersi [13]. Brak ekspresji może być związany z różnymi mechanizmami. Jedną możliwością jest zmiana metylacji regionu regulującego transkrypcję [6, 7]. W otoczeniu locus chromosomu 10 zawierającego gen PTEN mogą znajdować się inne geny supresorowe, które mogą ulegać usunięciu wraz z PTEN. Jednym z nich jest gen EMX2 zawierający homeodomenę. Podwyższona ekspresja natywnego genu EMX2 jest związana z obniżonym tempem proliferacji endometrium, co może zostać przypisane genowi supresorowemu. Delecję EMX2 obserwuje się w niektórych gruczolakorakach endometrium. [19]. Inną możliwością zaproponowaną przez zespół Li i wsp. jest sytuacja, kiedy identyfikacja MMAC/PTEN bazuje na podobieństwie do fosfatazy [20, 21].
Badania autorów niniejszej pracy wskazują, że zmiana ekspresji genu MMAC/PTEN może być związana z rozwojem raka endometrium. Do potwierdzenia tego przypuszczenia konieczne są następne badania.

Piśmiennictwo

1. Sherman M. Theories of endometrial carcinogenesis: a multidisciplinary approach. Mod Pathol 2000; 13: 416-18.
2. Rose PG. Endometrial carcinoma. N Engl J Med 1996; 335: 610-9.
3. Bremond A, Bataillard A, Thomas L, et al. Cancer of the endometrium. French National Federation of Cancer (FNCLCC). Br J Cancer 2001; 84: 31-6.
4. Salvesen HB, Akslen LA. Molecular pathogenesis and prognostic factors in endometrial carcinoma. APMIS 2002; 110: 673-89.
5. Kurose K, Bando K, Fukino K, et al. Somatic mutations of the PTEN/MMAC1 gene in fifteen Japenese endometrial cancers: evidence for inactivation of both alleles. Jpn J Cancer Res 1998; 89: 842-8.
6. Risinger JI, Hayes K, Maxwell GL, et al. PTEN mutation in endometrial cancers is associated with favorable clinical and pathologic characteristics. Clin Cancer Res 1998; 4: 3005-10.
7. Risinger JI, Hayes AK, Berchuck A, Barret JC. PTEN/MMAC1 mutations in endometrial cancers. Cancer Res 1997; 57: 4736-8.
8. Simpkins SB, Peiffer-Schneider S, Mutch DG, et al. PTEN mutations in endometrial cancers with 10q LOH: additional evidence for the involvement of multiple tumor suppressors. Gynecol Oncol 1998; 71: 391-5.
9. Kinzler KW, Vogelstain B. Landscaping the cancer terrain. Science 1998; 280: 1036-7.
10. Nagase S, Yamakawa H, Sato S, et al. Identification of a 790-kilobase region of common allelic loss in chromosome 10q25-q26 in human endometrial cancer. Cancer Res 1997; 57: 1630-3.
11. Levine RL, Cargile CB, Blazes MS, et al. PTEN mutations and microsatellite instability in complex atypical hyperplasia, a precursor lesion to uterine endometrioid carcinoma. Cancer Res 1998; 58: 3254-8.
12. Maxwell GL, Risinger JI, Gumbs C, et al. Mutation of the PTEN tumor suppressor gene in endometrial hyperplasias. Cancer Res 1998; 58: 2500-3.
13. Kappes H, Goemann C, Bamberger AM, et al. PTEN expression in breast and endometrial cancer: correlations with steroid hormone receptor status. Pathobiology 2001; 69: 136-42.
14. Kong H, Suzuki A, Zou TT, et al. PTEN1 is frequently mutated in primary endometrial carcinomas. Nat Genet 1997; 17: 143-4.
15. Tashiro H, Blazes MS, Wu R, et al. Mutations in PTEN are frequent in endometrial carcinoma but rare in other common gynecological malignancies. Cancer Res 1997; 57: 3935-40.
16. Tashiro H, Isacson C, Levine R, et al. p53 gene mutations are common in uterine serous carcinoma and occur early in their pathogenesis. Am J Pathol 1997; 150: 177-85.
17. Whang YE, Wu X, Suzuki H, et al. Inactivation of the tumour suppressor PTEN/MMAC1 in advanced human prostate cancer through loss of expression. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 5246-50.
18. Frisk T, Foukakis T, Dwight T, et al. Silencing of the PTEN tumor-suppressor gene in anaplastic thyroid cancer. Genes Chromosomes Cancer 2002; 35: 74-80.
19. Teng DHF, Hu R, Lin H, et al. MMAC1/PTEN mutations in primary tumor specimens and tumor cell lines. Cancer Res 1997; 57: 5221-5.
20. Li DM, Sun Hl. TEP1, encoded by a candidate tumor suppres sor locus, is a novel protein tyrosine phosphatase regulated by transforming growth factor b. Cancer Res 1997; 57: 2130-6.
21. Li J, Yen C, Liaw D, et al. PTEN, a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain, breast, and prostate cancer. Science 1997; 275: 1943-7.