Ekspresja receptora dla witaminy D oraz reduktazy metylenotetrahydrofolianowej w rakach podstawnokomórkowych

Wprowadzenie

W ostatnich latach ukazało się wiele prac wskazujących na przeciwnowotworowe właściwości witaminy D związane z jej aktywnością biologiczną i zdolnością do hamowania proliferacji oraz regulacji różnicowania się komórek. Dane z piśmiennictwa wskazują również, że niedobór witaminy D łączy się ze zwiększonym ryzykiem rozwoju niektórych nowotworów narządów wewnętrznych, a także chorób autoimmunologicznych [1]. Połączenie aktywnej formy witaminy D z jej naturalnym ligandem, którym jest receptor dla witaminy D (ang. vitamin D receptor – VDR) nasila apoptozę komórek nowotworowych, a także, jako czynnik transkrypcyjny, reguluje aktywność ponad 60 genów odpowiedzialnych za procesy różnicowania się komórek oraz efekty antyproliferacyjne [2, 3]. W badaniach eksperymentalnych wykazano zwiększoną ekspresję VDR w komórkach m.in. nowotworów piersi, prostaty, trzustki, jelita grubego oraz tarczycy [4, 5]. Zwiększoną ekspresję tego białka stwierdzono ponadto w komórkach niemelanocytowych raków skóry, tj. raków podstawno- (ang. basal cell carcinoma – BCC) oraz kolczystokomórkowych (ang. squamous cell carcinoma – SCC) [6].
Zinser i wsp. [7] w badaniu na modelu zwierzęcym wykazali, że u myszy pozbawionych ekspresji VDR i poddanych działaniu chemicznego kancerogenu w 85% przypadków dochodzi do rozwoju raków skóry, głównie SCC. U zwierząt z prawidłową ekspresją tego receptora rozwój nowotworów obserwowano zaledwie w 17% przypadków. Wyniki tych obserwacji wskazują na istotną rolę VDR w procesie nowotworzenia [7].
Reduktaza metylenotetrahydrofolianowa (ang. methylenetetrahydrofolate reductase – MTHFR) jest enzymem odgrywającym istotną rolę w metabolizmie folianów. Związki te są niezbędne w procesach naprawy DNA ulegającego uszkodzeniu pod wpływem promieniowania ultrafioletowego. Ponadto wykazano, że foliany biorą udział w regulacji porliferacji keratynocytów oraz innych komórek ulegających szybkim podziałom. Substratem dla MTHFR jest białko wewnątrzkomórkowe, 5,10-metylenotetrahydrofolian, który pełni istotną rolę w syntezie i naprawie DNA jądra komórkowego, podczas gdy w osoczu stwierdza się produkt reakcji enzymatycznej – 5-metylenotetrahydrofolian niezbędny do syntezy metioniny i metylacji DNA. Naprawa uszkodzeń DNA jest kluczowym zjawiskiem chroniącym organizm przed rozwojem nowotworów [8–12].
Nieprawidłowa aktywność MTHFR została uznana za jeden z czynników biorących udział w kancerogenezie. W chwili obecnej pojedyncze prace wskazują na udział polimorfizmów w genie kodującym MTHFR w rozwoju niemelanocytowych raków skóry [13].

Cel pracy

Przytoczone powyżej informacje, wskazujące na udział zarówno witaminy D, jak i receptora VDR oraz enzymu MTHFR w patogenezie nowotworów, stanowiły przesłankę do przeprowadzenia badań własnych oceniających stężenie 25(OH)D oraz parat­hormonu w surowicy u pacjentów z BCC, a także poziom ekspresji VDR i MTHFR w bioptatach skóry pobranych od chorych na raka podstawnokomórkowego.

Materiał i metodyka

Badaniem objęto grupę 79 chorych z potwierdzonym histopatologicznie BCC (41 kobiet, 38 mężczyzn, średni wiek 60,2 roku, fototyp skóry: I/II – 20 osób, III – 52 osoby, IV – 7 osób) leczonych w Katedrze i Klinice Dermatologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi w latach 2005–2008 oraz 46 wolontariuszy stanowiących grupę kontrolną (21 kobiet, 25 mężczyzn, średni wiek 58,4 roku, fototyp skóry: I/II – 10 osób, III – 28 osób, IV – 8 osób) [14]. Żadna z badanych osób nie była biorcą przeszczepu, nie była leczona lekami immunosupresyjnymi ani nie chorowała na inny nowotwór. U wszystkich badanych oznaczano w miesiącach wczesnowiosennych (kwiecień–maj) stężenie witaminy D i parathormonu w surowicy, natomiast u 44 pacjentów z BCC oraz 30 wolontariuszy pobierano biopsje skóry celem oznaczenia ekspresji VDR i MTHFR. Wycinki pobierano wyłącznie ze zmian typu BCC zlokalizowanych w górnej części policzka. U wolontariuszy pobierano biopsje skóry z analogicznej lokalizacji. Stężenia 25(OH)D i parat­hormonu w surowicy nie oznaczano.

Metoda Western blot

Pobrane bioptaty skóry zostały umieszczone w 0,5 ml buforu lizującego, zawierającego 0,25-procentowy Triton X-100 oraz Complete (inhibitor proteaz, Roche, Szwajcaria). Następnie komórki poddano sonifikacji, trzykrotnie przez 15 sekund, a potem odwirowywano (3 minuty, 14 000 rpm). Do pomiaru stężenia całkowitego białka w lizatach komórek użyto zestawu BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, USA). Próbki zawierające 50 µg białka przed naniesieniem elektroforezą były denaturowane w buforze próbkowym (95°C, 5 minut) zawierającym DDT, a nastepnie rozdzielane w 10% żelu poliakrylamidowym SDS-PAGE, w buforze Tris-glycine SDS. Rozdzielone białka przenoszono w polu elektrycznym na membranę PVDF (Millipore, Billerica, USA). Po transferze membranę blokowano w 5% mleku odtłuszczonym z dodatkiem 0,1% Tween20, w temperaturze 4°C, przez 12 godzin. W celu wykrycia białka zastosowano poliklonalne kozie przeciwciała pierwszorzędowe (SantaCruz Biotechnoloy, Santa Cruz, USA) skierowane swoiście przeciwko ludzkiemu MTHFR (1 : 200) oraz mysie przeciwciała pierwszorzędowe (SantaCruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) skierowane swoiście przeciwko ludzkiemu VDR (1 : 200). Jako przeciwciał drugorzędowych użyto oślich przeciwciał znakowanych HRP (1 : 20000) skierowanych przeciwko kozim IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratory, Suffolk, Wielka Brytania) lub oślich przeciwciał znakowanych HRP (1 : 20000) skierowanych przeciwko mysim (Jackson ImmunoResearch Laboratory Suffolk, Wielka Brytania). W celu uwidocznienia uzyskanych prążków użyto ECL Plus Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, Wielka Brytania) oraz system do wizualizacji chemilumi­nescencji ChemiImager™ System (Alpha Innotech, San Leandro, Kanada). Gęstość optyczna (IDV) prążków była analizowana przy użyciu oprogramowania ChemiImager™ Software (Alpha Innotech San Leandro, Kanada).

Oznaczenie stężenia witaminy D i parathormonu

Surowica przechowywana była w temperaturze –25°C do chwili przeprowadzenia oznaczeń. Stężenie witaminy D oznaczano metodą radioimmunoassay (BioSource Europe S.A. Nivelles, Belgium), a parat­hormonu medodą immunochemiluminescencji (IMMULITE Turbointact PTH, Diagnostic Products Corporation, Los Angeles USA).

Analiza statystyczna

W celu porównań statystycznych, poza obliczeniem średniej arytmetycznej i odchylenia standardowego, posłużono się obliczeniem mediany, dolnego i górnego kwartyla, wartości minimum i maksimum. Do oceny istotności różnic badanych parametrów pomiędzy dwoma grupami zastosowano test U Manna-Whitneya. Dla wszystkich porównań i korelacji istotność statystyczną uznawano przy p < 0,05.

Wyniki

Stężenie 25(OH)D było statystycznie istotnie wyższe w grupie kontrolnej niż u chorych na BCC (mediana 29,5 ng/ml vs mediana 24,2 ng/ml, p = 0,0026). U 28 (35,4%) spośród 79 chorych na BCC stężenie witaminy D było poniżej wartosci 20 ng/ml, u 30 (38%) chorych było w granicach 20–30 ng/ml, podczas gdy u pozostałych 21 (26,6%) osób poziom był wyższy od 30 ng/ml. W grupie kontrolnej stężenie 25(OH)D poniżej 20 ng/ml wykazano u 5 (10,9%) osób, u 20 (43,5%) było pomiędzy 20 ng/ml a 30 ng/ml, natomiast u 21 (45,5%) – powyżej 30 ng/ml (ryc. 1. A). Stężenie parathormonu w surowicy u pacjentów z BCC było istotnie wyższe w porównaniu z grupą kontrolną (56,05 pg/ml vs 32,7 pg/ml, p < 0,0001) (ryc. 1. B).
We wszystkich analizowanych bioptatach wykazano ekspresję VDR. U chorych na BCC była ona istotnie wyższa niż w grupie kontrolnej (mediana 1,4 × 106 IDV vs mediana 0,4 × 106 IDV, p < 0,001). Taką samą zależność obserwowano w odniesieniu do ekspresji MTHFR, która była istotnie wyższa w bioptatach skóry pobranych ze zmian typu BCC w porównaniu z grupą kontrolną (mediana 7,9 × × 106 IDV vs mediana 5,3 × 106 IDV, p < 0,01) (tab. I, ryc. 2. i 3.).

Omówienie

Kalcytriol ma swoje receptory nie tylko w kościach, ale również w innych tkankach, między innymi w komórkach układu immunologicznego, krwiotwórczego, skóry, w mięśniach oraz komórkach różnych nowotworów, np. czerniaka. Aktywna postać witaminy D działa w nich jako czynnik antyproliferacyjny oraz proróżnicujący [15, 16]. Na podstawie przeprowadzonych badań wykazano związki pomiędzy niedoborem witaminy D a rozwojem pewnych chorób, do których należą m.in. niektóre nowotwory (np. rak piersi, trzustki, jelita grubego), cukrzyca typu 2, choroby autoimmunologiczne, choroba niedokrwienna serca czy nadciśnienie tętnicze [17, 18]. W ostatnio opublikowanej pracy Asgari i wsp. [19] wykazali związek pomiędzy zwiększonym ryzykiem rozwoju BCC a wysokim stężeniem witamny D w okresie poprzedzającym rozpoznanie nowotworu o 11 lat. Oceniając ryzyko rozwoju BCC, autorzy stwierdzili, że podwyższenie stężenia wita­miny D o 1 ng/ml zwiększało to ryzyko o 2%. Przeciwne wyniki uzyskano w badaniach przeprowadzonych w warunkach in vitro, w których wykazano zahamowanie wzrostu BCC pod wpływem wysokich stężeń witaminy D [20]. Van Dam i wsp. oraz Gandini i wsp. nie wykazali także związku pomiędzy rozwojem raków kolczystokomórkowych a spożyciem witaminy D w codziennej diecie [21, 22].
W badaniu własnym oceniano stężenie 25-hydro­ksycholekalcyferolu w surowicy chorych na BCC, ponieważ stężenie tego związku odpowiada rzeczywistemu zaopatrzeniu organizmu w witaminę D. Ponadto, zgodnie z danymi z piśmiennictwa, jego ocena przewyższa pomiary innych form [23, 24]. Uzyskane w pracy własnej stężenie 25(OH)D było istotnie niższe u chorych na BCC niż w grupie kontrolnej, jednak u większości osób z obu grup stwierdzono stężenie poniżej 30 ng/ml. Obserwacja ta wymaga jednak ostrożnej interpretacji ze względu na przewagę pacjentów starszych wiekowo, u których najczęściej stwierdza się tendencję do występowania niedoborów witaminy D [25]. Mimo to statystycznie istotna różnica pomiędzy badanymi grupami może sugerować, że niedobór witaminy D jest jednym z czynników odgrywających rolę w rozwoju raków podstawnokomórkowych. Ze względu na brak dostępnych w ogólnoświatowym piśmiennictwie danych analizujących stężenie 25(OH)D w surowicy u chorych z już rozwiniętym BCC w porównaniu z grupą kontrolną, dobraną pod względem wieku, płci i fototypu skóry, prezentowane wyniki własne wydają się interesujące i są przesłanką do prowadzenie dalszych badań. Miałyby one na celu ocenę stężenia witaminy D u pacjentów z BCC i jego związku z ryzykiem ujawnienia się zmian nowotworowych. Obniżone stężenie 25(OH)D z równoczesnym wzrostem stężenia parat­hormonu może również przemawiać za udziałem tej wita­miny w złożonym procesie skórnej kancerogenezy.
Reichrath i wsp. [26] wykazali, że ekspresja receptora VDR, a także ekspresja jego mRNA, jest istotnie silniejsza w wycinkach pobranych ze zmian typu BCC niż w skórze pozornie zdrowej, pobranej z okolicy zmian chorobowych, bądź w skórze zdrowej pobranej od osób z grupy kontrolnej. Autorzy na podstawie przeprowadzonych obserwacji zasugerowali, że nasilona ekspresja VDR jest związana z procesami regulacji wzrostu BCC. Uzyskane wyniki własne są zgodne z obserwacjami Reichratha i wsp. [26], wykazano w nich również istotny wzrost ekspresji VDR w bioptatach pobranych z ognisk BCC w porównaniu z osobami zdrowymi. Na podstawie dostępnej wiedzy nie jest obecnie możliwe ustalenie, czy nasilona ekspresja tego receptora ma związek ze zdolnością syntezy kalcytriolu z witaminy D przez raki podstawnokomórkowe. Sugeruje się, że nasilona ekspresja VDR może być związana z obecnością polimorfizmów w genie kodującym VDR, które stwierdza się u chorych na BCC, co funkcjonalnie wiąże się z syntezą częściowo nieaktywnej formy białka, które nie ma zdolności wiązania się z ligandem. Uznaje się, że nasilona ekspresja receptora, mimo upośledzenia jego funkcji, jest mechanizmem protekcyjnym. Hipoteza ta nazwana została przez Reichratha i wsp. sprzężeniem zwrotnym [27]. Również w rakach kolczystokomórkowych obserwowano nasiloną ekspresję receptora VDR [28]. Nie stwierdzono jednak korelacji pomiędzy tym parametrem a histopatologicznym typem ani stopniem złośliwości SCC. Obserwowano, że inkubacja linii komórkowych wywodzących się z SCC z kalcytriolem prowadziła do supresji proliferacji komórek, co jest pośrednim dowodem na rolę VDR w patogenezie SCC oraz stanowi przesłankę do testowania analogów witaminy D w terapii niemelanocytowych raków skóry. Na podstawie przeprowadzonych badań podobne wnioski wysunęli Kamradt i wsp. [29], którzy wykazali istotną rolę witaminy D w patogenezie SCC i BCC.
Podsumowując dane z literatury i wyniki badań własnych, nie można jednoznacznie określić roli VDR i MTHFR w rozwoju raków podstawnokomórkowych skóry, jakkolwiek wiele argumentów przemawia za ich istotnym udziałem w procesie kancerogenezy. Stąd wydaje się, że niezwykle potrzebne i uzasadnione jest prowadzenie dalszych, kompleksowych i wieloośrodkowych badań celem poznania złożonej etiopatogenezy BCC.


Praca finansowana z funduszu prac statutowych UM w Łodzi nr 503-1152-1 oraz projektu MNiSW nr NN402474731.

Piśmiennictwo

 1. Holick M.F.: Vitamin D: the underappreciated D-lightful hormone that is important for skeletal and cellular health. Curr Opin Endocrinol Diabetes 2002, 9, 87-98.  
2. Raimondi S., Johansson H., Maisonneuve P., Gandini S.: Review and meta-analysis on vitamin D receptor polymorphisms and cancer risk. Carcinogenesis 2009, 30, 1170-1180.  
3. Schwartz G.G., Hall M.C., Stindt D., Patton S., Lovato J., Torti F.: Phase I/II study of 19-nor-1alpha-25-dihydroxyvitamin D2 (paricalcitol) in advanced, androgen-insensitive prostate cancer. Clin Cancer Res 2005, 11, 8680-8685.  
4. Bouillon R., Eelen G., Verlinden L., Mathieu C., Carmeliet G., Verstuyf A.: Vitamin D and cancer. J Steroid Biochem Mol Biol 2006 , 102, 156-162.  
5. Köstner K., Denzer N., Müller C.S., Klein R., Tilgen W., Reichrath J.: The relevance of vitamin D receptor (VDR) gene polymorphisms for cancer: a review of the literature. Anticancer Res 2009, 29, 3511-3536.  
6. Bikle D.D.: Vitamin D receptor, UVR and skin cancer: a potential protective mechanism. J Ivest Dermatol 2008, 128, 2357-2361.  
7. Zinser G.M., Sundberg J.P., Welsh J.: Vitamin D(3) receptor ablation sensitizes skin to chemically induced tumorigenesis. Carcinogenesis 2002, 23, 2103-2109.  
8. Larsson S.C., Giovannucci E., Wolk A.: Folate intake, MTHFR polymorphisms, and risk of esophageal, gastric, and pancreatic cancer: a meta-analysis. Gastroenterology 2006, 131, 1271-1283.  
9. Blount B.C., Mack M.M., Wehr C.M., MacGregor J.T., Hiatt R.A., Wang G. i inni.: Folate deficiency causes uracil misincorporation into human DNA and chromosome breakage: implications for cancer and neuronal damage. Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94, 3290-3295.
10. Choi S.W., Kim Y.I., Weitzel J.N., Mason J.B.: Folate depletion impairs DNA excision repair in the colon of the rat. Gut 1998, 43, 93-99.
11. Branda R.F., Blickensderfer D.B.: Folate deficiency increases genetic damage caused by alkylating agents and gamma-irradiation in Chinese hamster ovary cells. Cancer Res 1993, 53, 5401-5408.
12. Wei Q., Shen H., Wang L.E., Duphorne C.M., Pillow P.C., Guo Z. i inni: Association between low dietary folate intake and suboptimal cellular DNA repair capacity. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2003, 12, 963-969.
13. Laing M.E., Dicker P., Moloney F.J., Ho W.L., Murphy G.M., Conlon P. i inni: Association of methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism and the risk of squamous cell carcinoma in renal transplant patients Transplantation 2007,15, 113-116.
14. Fitzpatrick T.B.: The validity and practicality of sun-reactive skin types I through VI. Arch Dermatol 1988, 124, 869-871.
15. Grant W.B., Strange R.C., Garland C.F.: Sunshine is good medicine. The health benefits of ultraviolet-B induced vitamin D production. J Cosmet Dermatol 2004, 2, 86-98.
16. Lehmann B., Querings K., Reichrath J.: New relevance of vitamin D3 metabolism in the skin. Hautarzt 2004, 55, 446-452.
17. Ortlepp J.R., Lauscher J., Hoffmann R., Hanrath P., Joost H.G.: The vitamin D receptor gene variant is associated with the prevalence of type 2 diabetes mellitus and coronary artery disease. Diabet Med 2001, 18, 842-845.
18. Barthel H.R., Scharla S.H.: Benefits beyond the bones- vitamin D against falls, cancer, hypertension and autoimmune diseases. Dtsch Med Wochenschr 2003, 128, 440-446.
19. Asgari M.M., Tang J., Warton M.E., Chren M.M., Quesenberry C.P. Jr, Bikle D., Horst R.L. i inni: Association of prediagnostic serum vitamin D levels with the development of basal cell carcinoma. J Invest Dermatol 2010, 130, 1438-1443.
20. Xiao T.Z., Tang J.Y, Wu A., Shpall E., Khaimsky I., So P. i inni: Hedgehog signaling of BCC is inhibited by vitamin D: implication for a chemopreventive agent against BCC carcinogenesis. J Invest Dermatol 2009, 129, S32.
21. Van Dam R.M., Huang Z., Giovannucci E., Rimm E.B., Hunter D.J., Colditz G.A. i inni: Diet and basal cell carcinoma of the skin in a prospective cohort of men. Am J Clin Nutr 2000, 71, 135-141.
22. Gandini S., Raimondi S., Gnagnarella P., Doré J.F., Maisonneuve P., Testori A.: Vitamin D and skin cancer: a meta-analysis. Eur J Cancer 2009, 45, 634-641.
23. Holick M.F.: The use and interpretation of assays for vitamin D and its metabolites. J Nutr 1990, 120 (Suppl. 11), 1464-1469.
24. Millen A.E., Bodnar L.M.: Assessment of vitamin D in population-based studies. Am J Clin Nutr 2008, 87, 1079S.
25. Holick M.F.: Vitamin D: the underappreciated D-lightful hormone that is important for skeletal and cellular health. Curr Opin Endocrinol Diabetes 2002, 9, 87-98.
26. Reichrath J., Kamradt J., Zhu X.H., Kong X.F., Tilgen W., Holick M.F.: Analysis of 1,25- dihydroxyvitamin D3 receptors VDR in basall carcinoma. Am J Pathol 1999, 155, 583-589.
27. Reichrath J., Kamradt J., Zhu X.H., Kong X.F., Tilgen W., Holick M.F.: Analysis of 1,25- dihydroxyvitamin D3 receptors (VDR) in basal cell carcinoma. Am J Pathol 1999, 155, 583-589.
28. Reichrath J., Rafi L., Rech M., Mitschele T., Meineke V., Gärtner B.C. i inni: Analysis of the vitamin D system in cutaneous squamous cell carcinomas. J Cutan Pathol 2004, 31, 224-231.
29. Kamradt J., Rafi L., Mitschele T., Meineke V., Gärtner B.C., Wolfgang T., i inni: Analysis of the vitamin D system in cutaneous malignancies. Recent results. Cancer Res 2003, 164, 259-269.




Otrzymano : 21 IX 2010 r.
Zaakceptowano : 29 IX 2010 r.