Enhancement of suicide effect of herpes simplex thymidine kinese gene by IL-6 and GM-CSF genes

WSTĘP


Jedną ze strategii terapii genowej nowotworów jest użycie tzw. „genów samobójczych”. Są to geny, które nie występują w komórkach ssaków, a ich produkty mają zdolność metabolizowania nietoksycznych substratów (proleków) w toksyczne metabolity [1]. Na świecie obecnie prowadzi się w oparciu o ww. strategię 54 programy kliniczne, które obejmują 555 chorych (www.wiley.com), a jeden z programów badawczych jest w III fazie prób klinicznych. Próby te dotyczą różnych typów nowotworów, najczęściej guzów mózgu i czerniaka złośliwego. Najczęściej dotychczas stosowanym genem samobójczym jest gen kodujący enzym kinazę tymidynową wirusa opryszczki pospolitej typu 1 (HSV 1-Tk), który fosforyluje analogi nukleozydowe tymidyny, będące jednocześnie lekami przeciwwirusowymi, acyklowir czy gancyklowir (GCV) do trójfosforanów będących inhibitorami polimeraz DNA, co w rezultacie prowadzi do śmierci komórki dzielącej się. Zniszczeniu ulegają komórki w trakcie podziału, do których wprowadzono gen samobójczy oraz sąsiadujące dzielące się komórki, do których produkt genu przenika poprzez połączenia międzykomórkowe. Zjawisko to określa się jako bystander effect. Teoretycznie więc wystarcza mała frakcja komórek, do których wprowadza się gen samobójczy, aby zniszczyć cały guz. Okazuje się jednak, że bardzo ważną rolę w eliminacji guza odgrywają mechanizmy odpornościowe [2-5]. Już w pierwszych doświadczeniach wykazano, że tylko te szczury ze wszczepionym guzem mózgu, które poddano genowej terapii samobójczej i rozwinęły ogólnoustrojową swoistą odpowiedź immunologiczną przeciw wszczepionym komórkom nowotworowym były w stanie całkowicie wyeliminować guz i przeżyć doświadczenie [2]. Z kolei szczury traktowane w identyczny sposób, które nie były w stanie takiej odpowiedzi rozwinąć, padały z powodu rozrostu guza w miejscu wszczepienia. Ostatnio wykazano również, że na skutek reakcji immunologicznych zachodzących w obrębie guza i związanej z tym produkcji cytokin, głównie interleukiny (IL)-1 i -IL-6, a nie INFγ, IL-2 czy IL-4, wzrasta efektywność bystander effect [6].

Kilkuletnie doświadczenia stosowania powyższej strategii zarówno w modelach doświadczalnych, jak i badaniach klinicznych u ludzi, wykazały jednak jej względnie ograniczoną skuteczność terapeutyczną. Główną przyczyną niepowodzeń są nadal niedoskonałe metody dostarczania genów bezpośrednio do guza. Oryginalna strategia polegała na doguzowym podaniu komórek produkujących rekombinowane retrowirusy niosące gen HSV 1-Tk. Później próbowano podawać oczyszczone wektory retrowirusowe. Wirusy te wprowadzają geny (transdukują) do komórek dzielących się, więc „atakują” tylko komórki nowotworowe oraz ewentualnie komórki śródbłonka naczyń zaopatrujących w krew komórki guza. Jest to więc bardzo korzystne zjawisko, gdyż omija komórki prawidłowe. Jednak frakcja komórek dzielących się w obrębie guza jest ograniczona i tylko w niektórych nowotworach sięga 20 proc. Wydajność tej metody nie przekracza więc od 1 do 5 proc. komórek transdukowanych. Od pewnego czasu próbuje się stosować rekombinowane adenowirusy, które wprowadzają geny również do komórek nie dzielących się i wykazują znacznie wyższą wydajność transdukcji niż wektory retrowirusowe [7].

Na podstawie zgromadzonych danych można sądzić, że efektywność terapii samobójczej zależy głównie od 3 czynników, a mianowicie: wydajności transdukcji genu samobójczego, poziomu bystander effect i odpowiedzi immunologicznej. W związku z tym prowadzone obecnie badania ogniskują się głównie na tych zagadnieniach. W naszych poprzednich badaniach wykazaliśmy, że zastosowanie genu dwucistronowego zawierającego gen znacznikowy (LacZ) połączony sekwencją IRES z genem oporności na neomycynę (Neo) w wektorze retrowirusowym, zapewnia produkcję wysokiego miana rekombinowanych retrowirusów niosących ten gen przez komórki pakujące [8], a podanie tych komórek do guza mózgu u szczurów, prowadzi do transdukcji genu do ponad 3 proc. komórek nowotworowych [9]. Wykazaliśmy również, że gen dwucistronowy zawierający gen HSV 1-Tk połączony sekwencją IRES a genem Neo w wektorze retrowirusowym zapewnia wysoką ekspresję genu samobójczego w komórkach mysiego czerniaka B-78-H1 i jego funkcję in vivo [10]. W niniejszej pracy przedstawiamy wyniki badań nad zwiększeniem efektywności terapii samobójczej czerniaka złośliwego poprzez podniesienie wydajności bystander effect przy użyciu genu kodującego IL-6 oraz skojarzenie efektu samobójczego z immunostymulacją wykorzystując geny HSV 1-Tk i granulocytarno-makrofagowego czynnika stymulującego powstawanie kolonii (GM-CSF).



MATERIAŁ I METODY


Wektory retrowirusowe i transdukcja

komórek mysiego czerniaka – B-78-H1

Do wektora retrowirusowego opartego na murine stem cell virus (MSCV) po wycięciu kasety pgk-Neo (genu oporności na neomycynę z egzogennym promotorem) w miejsca XhoI i Sal I wklonowano gen fuzyjny złożony z genu HSV 1-Tk i genu selekcyjnego – oporności na hygromycynę (Hy) (pozyskany dzięki uprzejmości Dr R. G. Hawley, Toronto, Kanada). Uzyskany wektor oznaczono symbolem MSCV-HyTk. Do tego samego wektora (MSCV) po wycięciu kasety jw. w miejsca Bgl II i BamH I wklonowano gen dwucistronowy zawierający cDNA ludzkiej IL-6 połączonej sekwencją IRES z genem Neo (symbol wektora – MINV-IL-6). W podobny sposób, poprzez wklonowanie genu dwucistronowego zawierającego cDNA mysiego GM-CSF połączonego sekwencją IRES z genem Neo w miejsca Bgl II i BamH I MSCV, uzyskano wektor MINV-GM-cSF. W analogiczny sposób skonstruowano wektor MINV-GM-CSF/HyTk, w którym gen mysiego GM-CSF połączono sekwencją IRES z genem fuzyjnym HyTk. cDNA ludzkiej IL-6 oraz mysiego GM-CSF uzyskano dzięki uprzejmości Dr S. Rose-John, Mainz, Niemcy. Uzyskane wektory elektroporowano do komórek pakujących PA317, jak opisano wcześniej [8]. Po elektroporacji wektorów MSCV-Hy-Tk oraz MINV-GM-CSF/HyTk komórki pakujące selekcjonowano przez 3 tygodnie w obecności antybiotyku hygromycyny, a pozostałych wektorów w obecności G418. Następnie uzyskanymi rekombinowanymi retrowirusami transdukowano komórki mysiego czerniaka B-78-H1. W skrócie, nadsącz z odpowiednich komórek pakujących zawierający wirusy dodawano do hodowli komórek B-78-H1 na 48 h w obecności Polybrenu. Następnie pożywkę zmieniano, a transdukowane komórki selekcjonowano w odpowiednim antybiotyku. Komórki hodowano do uzyskania konfluencji bez pozyskiwania klonów. Ekspresję Tk, IL-6 i GM-CSF w komórkach pakujących oraz B-78-H1 oceniano na poziomie mRNA przy pomocy metody Northern blot. Syntezę IL-6 i GM-CSF przez komórki B-78-IL-6 oraz B-78-GM-CSF i B-78-GM-CSF/HyTk badano przy użyciu metody ELISA (odpowiednio Genzyme i R&D, USA). Stwierdzono, że komórki B-78-IL-6 wytwarzają 100 ng/10⁶/24 h, a komórki B-78-GM-CSF i B-78-GM-CSF/HyTk odpowiednio 9 i 5 ng/10⁶/24 h. Aktywność biologiczną Tk in vitro badano poprzez dodanie GCV we wzrastających dawkach do hodowli komórek B-78-HyTk i B-78-GM-CSF/HyTk i cenę ich żywotności stosując test MTT.



Badania in vivo

We wszystkich doświadczeniach stosowano myszy C57Bl/6 x C3H w wieku 6-10 tygodni pochodzące z Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej (Wrocław). W pierwszej serii doświadczeń myszom podawano podskórnie (s.c) 5 x 10⁵ komórek B-78-HyTk. Po 7 dniach przez kolejnych 7 dni co 12 godz. myszom dootrzewnowo (i.p.) podawano GCV w dawkach całkowitych 15, 75, i 150 mg/kg. W kolejnej serii doświadczeń myszom podawano komórki B-78-HyTk lub B-78-IL-6 zmieszane 1:1 z komórkami B-78-H1 oraz mieszaninę 1:1 B-78-HyTk z B-78-IL-6 w ilości całkowitej jw. Po 7 dniach myszom podawano i.p. GCV w dawce 75 mg/kg w sposób jak opisano wyżej. W ostatniej serii doświadczeń myszom podawano s.c. komórki B-78-H1, B-78-GM-CSF oraz B-78-GM-CSF/HyTk w ilości jw. Również po 7 dniach myszom podawano GCV w dawce 75 mg/kg w sposób jw.



WYNIKI


Aktywność Tk in vitro przedstawiono na ryc. 1. Jak wynika z wykresu wektor MSCV-HyTk zapewnia nieco wyższą aktywność Tk in vitro niż MINV-GM-CSF/HyTk.

Wyniki zależności zahamowania wzrostu guza od dawki GCV przedstawiono na ryc. 2. Zastosowanie GCV w dawce 150 mg/kg całkowicie zniszczyło komórki nowotworowe, które nie uformowały guzów. Natomiast GCV w dawce 15 mg/kg miało bardzo niską wydajność. Dawka pośrednia hamowała wzrost guzów u ponad połowy zwierząt. W związku z tym, do badań bystander effect zastosowano dawkę 75 mg/kg. W tej serii doświadczeń, aby stwierdzić wpływ Tk na komórki sąsiadujące, komórki transdukowane Tk mieszano z komórkami wyjściowymi lub transdukowanymi IL-6. Na ryc. 3. przedstawiono wyniki powyższego doświadczenia. Stwierdzono, że komórki B-78-IL-6 zmieszane z B-78 podane s.c. myszom we wszystkich przypadkach tworzą guzy, podobnie jak B-78-HyTk. Podanie GCV w dawce jw. powodowało tylko (głównie w przypadku B-78-HyTk) opóźnienie pojawienia się guzów oraz zwolnienie ich wzrostu. Natomiast w przypadku zmieszania komórek B-78-IL-6 z B78-HyTk i podania GCV tylko 20 proc. zwierząt rozwinęło guzy.

U 40 proc. myszy, którym podano B-78-GM-CSF lub B-78-GM-CSF/HyTk i u wszystkich, którym podano B-78-HyTk stwierdzono formowanie guzów (ryc. 4.). Padanie GCV w dawce 75 mg/kg nieznacznie opóźniło formowanie guzów B-78-GM-CSF, spowodowało formowanie guzów z komórek B-78-HyTk u około 30 proc. zwierząt oraz całkowicie zahamowało formowanie guzów z komórek B-78-GM-CSF/HyTk.



DYSKUSJA


Oporność wielu nowotworów na chemio-, radio- czy immunoterapię, będących w fazie rozsiewu stymuluje do poszukiwań nowych metod ich leczenia. W genoterapii już od kilku lat pokłada się nadzieje, iż będzie skutecznie zwalczać tę chorobę. Obecnie prowadzi się próby kliniczne terapii genowej nowotworów oparte na kilku podstawowych strategiach [11]. Obejmują one immunoterapię genową, gdzie dominują tzw. genetycznie modyfikowane rakowe szczepionki komórkowe (gene modified tumor vaccines – GMTV), a ostatnio modyfikację komórek dendrytycznych – prezentujących antygen, terapię antyangiogenną, dyskutowaną w niniejszej pracy terapię samobójczą, naprawę uszkodzonych genów supresorowych lub usunięcie onkogenów, czy ochronę szpiku przed chemioterapią wysokodawkową poprzez wprowadzenie do nich genów oporności wielolekowej. Po fali olbrzymiego optymizmu spowodowanego bardzo obiecującymi wynikami badań przedklinicznych nadszedł okres ich weryfikacji w próbach klinicznych. Okazało się, że wyniki uzyskane w wysublimowanych modelach zwierzęcych nie zawsze przekładają się na konkretne sytuacje kliniczne. Oryginalne obserwacje wykazały zależność efektu samobójczego od odpowiedzi immunologicznej [2]. Ostatnio wykazano, że komórki nowotworowe w wyniku terapii samobójczej eliminowane są raczej poprzez martwicę niż na drodze apoptozy, a odpowiedź immunologiczna spolaryzowana jest w kierunku Th1 [3]. Ostatnio zwrócono również uwagę, że mediatory reakcji odpornościowych mogą wpływać na bystander effect [6]. W związku z tym próbuje się łączyć ze sobą niektóre strategie. Ponadto, próbuje się ulepszać nośniki genów w taki sposób, aby mogły zapewnić jednoczesną ekspresję kilku wprowadzanych genów.

W tej pracy po raz pierwszy wykazaliśmy, że wprowadzenie genu IL-6 równolegle z genem Tk do tkanki nowotworowej z następową aktywacją mechanizmów samobójczych, zwiększa w synergistyczny sposób bystander effect. Mechanizmy molekularne leżące u podłoża tego zjawiska wymagają dalszych analiz, szczególnie badań in vitro, które pozwolą ostatecznie osądzić czy mamy faktycznie do czynienia ze wzmocnieniem bystander effect, czy ze współaktywacją przeciwnowotworowych mechanizmów obronnych in vivo, które z kolei prowadzą do eliminacji guza. Skojarzenie obu metod poszerza jednak znacznie możliwości terapii samobójczej. Jak wcześniej wspomniano, Freeman i wsp. [6] dopatrywali się związkus między wzmocnieniem bystander effect i ekspresją IL-6. Inna grupa jednak nie stwierdziła wyższego efektu terapeutycznego w wyniku transdukcji guzów przy pomocy wektorów adenowirusowych genem Tk i IL-6, ponad transdukcję samym genem Tk [12].

W ciągu 3 ostatnich lat ukazała się seria publikacji, w których próbuje się łączyć terapię samobójczą z immunoterapią, głównie poprzez jednoczesne wprowadzenie do komórek guza genów kodujących cytokiny czy powierzchniowe cząsteczki kostymulujące [13-16]. Lista obejmuje IL-2, TNFα, GM-CSF czy FGF2 (basic fibroblast growth factor). We wszystkich przypadkach, z jednym wyjątkiem [12], stwierdzono wzmożenie efektu terapeutycznego Tk przez omawiane cytokiny. Forma reakcji była jednak różna w zależności od użytej cytokiny, np. IL-2 bardziej niż inne czynniki hamowała miejscowy wzrost guza, poprzez aktywację nieswoistych mechanizmów przeciwnowotworowych, natomiast GM-CSF najbardziej aktywował pamięć immunologiczną, tym samym odpowiedź ogólnoustrojową. W naszych badaniach wykazaliśmy, że połączenie Tk z GM-CSF całkowicie hamowało formowanie guzów nisko-immunogennego czerniaka mysiego B-78, podczas gdy użycie każdego z tych genów oddzielnie miało tylko połowiczny efekt. Obserwowana w tej pracy wydajność terapii znacznie przekracza wydajność Tk + GM-CSF prezentowaną przez innych [15-16]. Prawdopodobnie spowodowane to jest faktem, że teoretycznie wszystkie komórki nowotworowe stosowane w naszych doświadczeniach transdukowane są oboma genami. Inni natomiast wprowadzali geny do uformowanych wcześniej guzów, transdukując tylko frakcję komórek nowotworowych. Mechanizm, na drodze którego dochodzi do współdziałania Tk i GM-CSF najprawdopodobniej polega na tym, że GM-CSF aktywuje komórki dendrytyczne, które prezentują antygeny uwalniane z komórek nowotworowych w wyniku działania genu samobójczego. Uzyskane wyniki sugerują, że połączenie trzech elementów strategii „samobójczej”, tzn. genu samobójczego (Tk), wzmożenia bystander effect (IL-6) oraz immunostymulacji (GM-CSF) może jeszcze bardziej podnieść jej efektywność.

Nasze poprzednie badania [8-10] oraz dane publikowane przez inne grupy [13, 14] wskazują na to, że zastosowanie genów dwucistronowych w różnych nośnikach znacznie podnosi efektywność dostarczania kilku genów do jednej komórki, a w przypadku wektorów retrowirusowych podnosi miano rekombinowanych wirusów. Również w tej pracy wykazaliśmy wysoką wydajność omawianego systemu. Ponadto, poprzez użycie genu fuzyjnego (HyTk), obejmującego również gen selekcyjny byliśmy w stanie wykorzystać trzy geny, z których ten ostatni nie jest genem terapeutycznym, a genem zapewniającym selekcję komórek pakujących w systemie rekombinowanych retrowirusów. Po kilku latach doświadczeń okazuje się jednak, że wektory retrowirusowe, pomimo ich wielu zalet, nie będą nośnikiem z wyboru w terapii samobójczej nowotworów. Na obecnym etapie rozwoju wektorologii zaczynają wypierać je nośniki adenowirusowe [7]. Szczególnie obiecujące są wektory trzeciej generacji, tzw. helper dependent, które mają zdolność przenoszenia informacji wielkości ok. 30 000 par zasad i zapewniają względnie długą ekspresję genów w komórkach docelowych, gdyż nie są eliminowane na drodze immunologicznej [17]. Podsumowując, zastosowanie genów wielocistronowych stanowi znaczny postęp w rozwoju genowej terapii samobójczej, natomiast nośniki retrowirusowe będą zastępowane innymi.


PIŚMIENNICTWO

1. Moolten FL. Cancer Gene Ther 1994; 1, 279-87.

2. Vile RG, Nelson JA, Castleden S, Chong H, Hart IR. Cancer Res 1994; 54, 6228-34.

3. Vile RG, Castleden S, Marshall J, Camplejohn R, Upton C, Chong H. Int. J Cancer 1997; 2, 267-74.

4. Bernstein M, Adris S, Ledda F, Wolfmann C, Medina J, Bravo A, Mordoh J, Chernajovsky Y, Podhajcer OL. Cancer Gene Ther 1999; 4, 358-66.

5. Todryk S, Melcher AA, Hardwick N, Linardakis E, Bateman A, Colombo MP, Stoppacciaro A, Vile RG. J Immunol 1999; 3, 1398-408.

6. Freeman SM, Ramesh R, Shastri M, Munshi A, Jensen AK, Marrogi AJ. Cancer Lett 1995; 8, 167-74.

7. Wlidner O, Marris JC, Vahanian NN, Ford H Jr., Ramsey WJ, Blease RM. Gene Ther 1999; 6, 57-62.

8. Wiznerowicz M, Fong A, Mackiewicz A, Hawley RG. Gene Ther 1997; 4, 1061-8.

9. Kapcińska M, Wiznerowicz M, Szklarczyk A, Nowak S, Szymaś J, Nawrocki S, Kaczmarek L, Mackiewicz A. Konstrukcja dwucistronowego wektora retrowirusowego dla celów samobójczej terapii genowej guzów mózgu. W: Problemy współczesnej diagnostyki i terapii w neurochirurgii, Nowak S, Żukiel R. (red.). PTPN Poznań 1998; 135-40.

10. Kapcińska M, Nawrocki S, Wiznerowicz M, Mackiewicz A. Współcz Onkol 1998; 2, 197-9.

11. Nawrocki S, Mackiewicz A. Cancer Thre Rev 1999; 25, 29-46.

12. Felzmann T, Ramsey WJ, Blaese RM. Gene Ther 1997; 4, 1322-9.

13. Pizato M, Franchin E, Calvi, Boschetto R, Colombo M, Ferini S, Palu G. Gene Ther 1998; 5, 1003-7.

14. Castleden SA, Chong H, Garcia-Ribas I, Melcher AA, Hutchinson G, Roberts B, Hart IR, Ville RG. Hum Gene Ther 1997; 8, 2087-102.

15. Bonnekoh B, Greenhalgh DA, Chen SH, Block A, Rich SS, Krieg T, Woo SL, Roop DR. J Invest Dermatol 1998; 110, 867-71.

16. Rancourt C, Rogers BE, Sosnowski BA, Wang M, Piche A, Pierce GF, Alvarez RD, Siegal GP, Douglas JT, Curiel DT. Clin Cancer Res 1998; 4, 2455-61.

17. Morsy MA, Gu M, Motzel Sh, Zhao J, Lin J, Su Q, Allen H, Franlin L, Parks RJ, Graham FL, Kochanek S, Bett AJ, Caskey Th. Proc Antl Acad Sci USA 1998; 95, 7866-71.


ADRES DO KORESPONDENCJI

prof. zw. dr hab. med. Andrzej Mackiewicz

Zakład Immunologii Nowotworów

Akademia Medyczna

Wielkopolskie Centrum Onkologii

ul. Garbary 15

61-866 Poznań



Praca finansowana przez Komitet Badań Naukowych i Fundację na Rzecz Nauki Polskiej