Epigenetic modification of gene expression in colorectal carcinogenesis

Epidemiologia raka jelita grubego

Zachorowania i zgony z powodu nowotworów złośliwych na początku XXI w., szczególnie w populacji w wieku 45–64 lat, są jednym z najpoważniejszych problemów zdrowotnych w Polsce. Rak jelita grubego jest najczęściej występującym nowotworem złośliwym przewodu pokarmowego [1]. W ostatnich latach z jego powodu umiera rocznie ok. 8 tys. osób. Ogólna zachorowalność na raka jelita grubego jest zbliżona u obu płci, stanowiąc 9,5% ogółu zachorowań na nowotwory u mężczyzn i 10% u kobiet. Na raka odbytnicy częściej jednak chorują mężczyźni. Częstość zachorowań na raka jelita grubego w populacji ogólnej wzrasta co najmniej o 2,5% rocznie. Przeżycia 5-letnie szacowane są w Polsce na 25–50% i należą do najniższych w Europie [2–4]. Jednym z najważniejszych zadań współczesnej onkologii jest rozpoznanie choroby nowotworowej w jej najwcześniejszym stadium, najczęściej bezobjawowym. Znaczący postęp w tym zakresie przynoszą metody obrazowe – endoskopia, ultrasonografia (USG), tomografia komputerowa lub magnetyczny rezonans jądrowy. Jednak w przypadku niewielkich zmian ogniskowych metody te są mało skuteczne. Wiele nadziei na poprawę współczesnej diagnostyki raka jelita grubego wiąże się z wykrywaniem zaburzeń genetycznych oraz epigenetycznych, stwierdzanych za pomocą technik biologii molekularnej [1, 5, 7, 8].
Zaburzenia epigenetyczne
Efektem epigenetycznym nazywa się zmiany w ekspresji genu, wynikające z modyfikacji struktury chromatyny bez zmian w sekwencji DNA [9, 10]. Zjawisko epigenezy tłumaczy dziedziczenie ilościowych zmian w ekspresji genów w przeciwieństwie do jakościowych zaburzeń genetycznych. Zjawiska epigenetyczne opierają się na 2 mechanizmach: • odwracalnej metylacji cytozyn przy węglu 5. pierścienia pirymidynowego, • zmianie struktury i jakości białek chromatyny [11]. U eukariontów cytozyny znajdujące się w chromosomowym DNA są czasami przekształcane w 5-metylocytozynę przez przyłączenie grupy metylowej. Reakcja przeprowadzana jest przez enzym metylotransferazę DNA. Miejsca metylacji nie są przypadkowe – metylowane są tylko cytozyny wchodzące w skład niektórych sekwencji 5’-CG-3’ [12, 13], a reakcja następuje natychmiast po replikacji w miejscach komplementarnych do zmetylowanych cytozyn na nici DNA służącej za matrycę [9, 14, 15]. Enzymy metylujące można podzielić na 2 grupy. Pierwsza z nich to enzymy przeprowadzające metylację zachowawczą, odpowiedzialne za przyłączenie grup metylowych do nowo zsyntetyzowanej nici DNA w miejscach komplementarnych do miejsc metylowanych w nici rodzicielskiej. Dzięki aktywności tych enzymów 2 potomne cząsteczki DNA są metylowane w taki sam sposób, jak cząsteczka rodzicielska. Druga grupa enzymów to enzymy powodujące metylację de novo. Przyłączają one grupy metylowe w zupełnie nowych miejscach, a więc zmieniają wzór metylacji konkretnych fragmentów genomu [15]. Liczne dane wskazują, że różnorodne mechanizmy biochemiczne odpowiedzialne za pamięć epigenetyczną są ze sobą ściśle połączone i na danym fragmencie chromosomu działają w układzie sprzężeń zwrotnych dodatnich (ryc. 1.) [12]. Metylacja lizyny 9. histonu H3 powoduje deacetylację histonów i metylację DNA, deacetylacja histonów wywołuje metylację DNA i metylację lizyny 9. histonu H3, a metylacja DNA pociąga za sobą deacetylację histonów i metylację lizyny 9. histonu H3 [13]. Przykładem zmian epigenetycznych odgrywających istotną rolę w rozwoju zmian nowotworowych jest hipermetylacja sekwencji CpG, występujących obficie w regionach promotorowych genów [16]. Powstaje w ten sposób fenotyp metylatora wysp CpG (ang. CpG island methylator phenotype – CIMP), w którym hipermetylacja powoduje utratę funkcji genów w związku z zablokowaniem transkrypcji [3, 25]. Co najmniej 4 grupy faktów przemawiają za ważną rolą zmian typowo epigenetycznych w rozwoju nowotworów: • zmniejszenie metylacji zmniejsza intensywność tworzenia polipów w jelicie grubym, a są one zmianami przedrakowymi; • nieprawidłowa bialleliczna metylacja promotora genu H19 występuje w komórkach nerkowych pacjentów z guzem Wilmsa; • metylację promotora genu VHL obserwuje się w przypadkach rodzinnego zespołu von Hippela-Lindaua i genu RB1 w jednostronnej retinoblastomie; • hipermetylacja promotorowych binukleotydów CpG w genie naprawy DNA – MLH1, co w konsekwencji wyraźnie zwiększa częstość mutacji kancerogennych [11]. Wykazano, iż część raków jelita grubego powstaje na podłożu tego właśnie zaburzenia epigenetycznego, przy czym unieczynniane są geny związane zarówno z torem mutacyjnym gruczolak-rak Fearona i Vogelsteina, jak i geny związane z niestabilnością mikrosatelitarną [3, 17]. Zależności pomiędzy zaburzeniami genetycznymi a epigenetycznymi w rozwoju zmian nowotworowych przedstawiono na ryc. 2. [18]. Hipermetylację wykryto m.in. w regionach promotorowych genów APC, p16, p14, p15, MDR1, MINT1, MINT2, MINT12, MINT31, THBS1, TIMP3, hMLH1, MGMT, GSTP1, RASSF1A [6, 19–21]. W raku jelita grubego światowe piśmiennictwo najczęściej opisuje zaburzenia epigenetyczne genów p16, APC oraz MGMT. Wyniki badań autorów poszczególnych prac przedstawiono w tab. 1. Geny p16, APC oraz MGMT w rozwoju raka jelita grubego Gen p16 (CDKN2A) został zlokalizowany na chromosomie 9p21. Gen ten koduje 2 białka – P16 i P14. Białko P14 powstaje na drodze alternatywnego składania zidentyfikowanego eksonu 1B. Białka te są inhibitorami kinaz zależnych od cyklin, w szczególności CDK4 i CDK6, biorąc udział w fosforylacji Rb. Z tej przyczyny gen p16 został zaliczony do grupy genów supresorowych. Gen p16 może kontrolować cykl komórkowy także poprzez bezpośrednią regulację transkrypcji. W tym przypadku CDKN2A, wiążąc się z C-końcową domeną polimerazy RNA II, uniemożliwia fosforylację tego fragmentu przez czynnik transkrypcyjny TFIIH. Dzięki unikalnej organizacji eksonu 1 genu p16 kodowane jest także białko P14ARF. Poprzez wiązanie się z MDM2 zapobiega degradacji białka P53, wpływając w ten sposób na jego stabilizację. Tym samym p16 stanowi istotne ogniwo łączące 2 najważniejsze szlaki regulacji cyklu komórkowego. Mutacje w obrębie części kodującej, jak i wyciszanie ekspresji p16 na skutek metylacji wysp CpG w obrębie odcinka promotorowego tego genu, są często znajdowane w nowotworach jelita grubego [26–28]. Gen APC (Adenomatous Polyposis Coli) również należy do grupy genów supresorowych. Jest zlokalizowany na długim ramieniu chromosomu 5. Koduje białko zbudowane z 2843 aminokwasów o masie 312 kDa. Białko to pełni wiele funkcji w komórce, współdziałając z b-kateniną, kinazą syntazy glikogenu 3b (GSK-b), końcowym białkiem wiążącym 1 (EB1) i kinazami Bub. Na podstawie badań nad zespołami dziedzicznymi, jak również sporadycznymi przypadkami raka jelita grubego uznano, że podstawowym elementem w sekwencji zdarzeń gruczolak-rak są zaburzenia regulacji kompleksu APC i b-katenina. W normalnej komórce b-katenina tworzy niestabilny kompleks z GSK-b i APC, co wpływa na prawidłową degradację tego białka, natomiast w przypadku mutacji APC dochodzi do kumulacji b-kateniny w komórce. Podstawową funkcją b-kateniny jest tworzenie kompleksu z a-kateniną i E-kadheryną, natomiast pozakomórkowa domena E-kadheryny jest odpowiedzialna za adhezję międzykomórkową. Zaburzenia funkcji katenin i kadheryn, poza zmniejszeniem zdolności wzajemnego przylegania komórek, wpływają również na zaburzenie ich różnicowania i uzyskania zdolności do inwazji [3, 29–31]. Gen MGMT jest odpowiedzialny za procesy naprawcze uszkodzonego DNA. Dzięki procesom reperacyjnym może zostać przywrócony pierwotny stan materiału genetycznego. W każdej komórce po zadziałaniu czynnika genotoksycznego następuje uruchomienie mechanizmów naprawczych. Do jednych z najważniejszych enzymów biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA należy metylotransferaza 06-metyloguanina-DNA (MGMT). Katalizuje ona przeniesienie grupy alkilowej z atomu 06-guaniny DNA na cysteinę, w wyniku czego enzym ten ulega nieodwracalnej dezaktywacji. Ekspresję genu MGMT w różnych tkankach prawidłowych i nowotworowych cechuje zróżnicowany poziom. U ludzi najwyższy poziom aktywacji tego enzymu obserwuje się w wątrobie, zaś najniższy w komórkach prekursorowych szpiku kostnego. Ekspresja genu MGMT w komórkach nowotworowych raka jelita grubego ulega zmniejszeniu o 30–40% [19–21, 32–34].
Dyskusja
W ostatnich latach choroba nowotworowa jest traktowana nie tylko jako zaburzenie genetyczne, ale zwraca się również uwagę na współistnienie zaburzeń epigenetycznych. Oba procesy są ze sobą powiązane, stanowiąc kompleks, który w efekcie prowadzi do kancerogenezy. Metylacja wiąże się z represją aktywności genów. Wynika to z eksperymentów, w których do komórek wprowadzono klonowane geny, metylowane lub niemetylowane, a następnie mierzono poziom ich ekspresji. Ekspresja nie zachodziła, jeśli wprowadzony DNA był metylowany. Powiązanie metylacji z ekspresją genów wynika również z obserwacji wzorów metylacji chromosomowego DNA pokazujących, iż geny nieaktywne są położone w rejonach metylowanych. Około 56% ludzkich genów występuje blisko wysp CpG. W genach warunkujących podstawowe funkcje komórki, ulegających ekspresji we wszystkich komórkach, wyspy CpG nie są metylowane. Natomiast w przypadku genów, których ekspresja jest tkankowo specyficzna, wyspy CpG nie są metylowane tylko w tych tkankach, w których ekspresji ulega sąsiadujący z nimi gen [15]. Stopień metylacji wybranych genów został oceniony przez Shannona i wsp. u 58 chorych na raka jelita grubego [35, 36]. Hipermetylację genów hMLH1, p16 oraz MDR1 obserwowano odpowiednio u 23, 29 i 28% chorych. Hipermetylację tych genów częściej znajdowano w nowotworach z niestabilnością sekwencji mikrosatelitarnych (ang. microsatellite instability – MSI) (p<0,001). Ponadto korelowała ona z niskim zróżnicowaniem histologicznym (p<0,001). Ciao-Li Xu i wsp. ocenili profil metylacji wysp CpG rejonu promotora 31 genów w nowotworach jelita grubego. Materiał stanowiły próbki tkanek guza pobrane od 65 chorych z rozpoznanym rakiem jelita grubego. Spośród 31 badanych genów wybrano 17 charakterystycznych dla raka jelita grubego. Stopień metylacji wysp CpG przedstawiał się następująco: MGMT – 20%, hMLH1 – 18%, p16 – 10%, MINT1 – 15,4%, MINT31 – 11%, COX2 – 72%, cyclina A1 – 100%, CDX1 – 100%, RAR – 85%, MYODI – 69%, p15 – 68%, CDH13 – 66%, CXX1 – 58%, p73 – 63%, WT1 – 58% [20]. Gen myf-3 odgrywa ważną rolę w różnicowaniu komórek mięśniowych. W badaniu Shannona i wsp. hipermetylację tego genu stwierdzono w 88% raków jelita grubego. Stopień metylacji korelował z wiekiem, lokalizacją nowotworu (proksymalny vs dystalny), inwazyjnością oraz stopniem zaawansowania histopatologicznego nowotworu, jak również z MSI [36, 37]. Esteller i wsp. w swojej pracy oceniali zaburzenia epigenetyczne 12 genów w raku piersi, nerki, płuca, jelita grubego oraz w białaczkach. Za najbardziej specyficzne geny, ulegające zamianie ekspresji w raku jelita grubego, uznano p16, p14, MGMT, APC oraz hMLH1. Ich stopień metylacji przedstawiał się następująco – 37, 20, 39, 18 oraz 44% [19]. Rijnsoever i wsp. analizowali stopień metylacji 3 genów (p16, MDR1 i MINT2) w 275 przypadkach raka jelita grubego w stopniu zaawansowania II i III (wg skali Dukesa). Materiał stanowiły próbki zatopione w parafinie (n=142) oraz pochodzące z materiału pooperacyjnego pobranego zaraz po resekcji guza (n=133). Podgrupa przypadków, w których występowała równoczesna metylacja 2 lub 3 genów, została określona jako CIMP – fenotyp metylatora wysp CpG. Była ona reprezentowana przez 32% badanych i określono ją jako CIMP+. Nowotwory typu CIMP+ wykazywały mniejsze zróżnicowanie histopatologiczne, mutacja genu p53 występowała rzadziej, częściej lokalizowały się w odcinku proksymalnym jelita grubego w porównaniu do nowotworów CIMP–. Stwierdzono, iż CIMP+ nie ma znaczenia prognostycznego w chirurgicznym leczeniu raka jelita grubego w stopniu II i III. Autorzy badali również zależność pomiędzy przypadkami raków z obecnością metylowanych genów (CIMP+) a niestabilnością mikrosatelitarną (MSI+). Wykazali, iż ww. cechy, charakterystyczne dla CIMP+ , występują niezależnie od MSI+. Większość przypadków guzów z niestabilnością mikrosatelitarną wykazuje metylację genu hMLH1 i dotyczy częściej starszych kobiet (średnia wieku 70 lat). Przypadki te charakteryzowały się mniejszą częstością występowania mutacji genu K-ras, ale nie p53 [25]. Toyota i wsp. oznaczali w swojej pracy mutacje genów K-ras, p53, DPC i TGFbRII oraz stopień ich metylacji w 41 przypadkach raka jelita grubego oraz 64 przypadkach polipów jelita grubego u chorych bez wywiadu rodzinnego. Wykazano, iż mutacja genu K-ras występuje częściej w przypadkach raków określanych jako CIMP+ (68%) w porównaniu z przypadkami CIMP–, które stanowiły 30%. Z drugiej strony, mutacja genu p53 występowała w 24% przypadków raków CIMP+ w porównaniu do przypadków CIMP– (60%). Mutacja genu TGFbRII, która pojawia się w rakach z niestabilnością mikrosatelitarną, była obecna w 88% w rakach MSI+. Znaleziono jedną mutację genu DPC4 w guzie CIMP–, MSI–. Zauważono również, że zarówno metylacja wysp CpG genów występujących w raku jelita grubego, jak i mutacja genu p53 pojawiają się znacznie wcześniej, przed rozwojem zmiany nowotworowej, ponieważ można je wykryć w polipach jelita grubego [6]. Jak wynika z analizy wyników przytoczonych prac, metylacja wysp CpG jest częstsza w guzach mało zróżnicowanych i w wyższym stopniu zaawansowania klinicznego (wg klasyfikacji Dukesa), a podgrupa raków jelita grubego, określana jako fenotyp metylatora wysp CpG (CIMP), występuje częściej w proksymalnym odcinku jelita grubego w porównaniu do odcinka dystalnego (granicę anatomiczną wyznacza zagięcie śledzionowe). Wykazano również, iż tkanka guza nowotworowego wykazuje wyższy stopień metylacji w porównaniu ze zdrową tkanką jelita grubego. Natomiast podgrupa raków określona jako CIMP+ nie ma znaczenia prognostycznego w chirurgicznym leczeniu raka jelita grubego w stopniu II i III (wg klasyfikacji Dukesa) [25]. Precyzyjne określenie zmian genetycznych (mutacji) i epigenetycznych (metylacji wysp CpG) każdej zmiany nowotworowej może być istotne zarówno dla planowania leczenia, jak i prognozowania przeżycia, a podgrupa guzów, która wykazuje wysoki poziom metylacji, może zostać zakwalifikowana do leczenia inhibitorami metylacji [38–40]. Stopień metylacji DNA w guzach jelita grubego może okazać się w przyszłości użytecznym markerem aktywności genomu, a ocena zaburzeń epigenetycznych w marginesie tkanki zdrowej może stać się cenną wskazówką do oceny prawidłowości resekcji zmiany nowotworowej. Należy jednak podkreślić, iż znaczne różnice pomiędzy poszczególnymi nowotworami, dotyczące wieku zachorowania, lokalizacji, budowy histopatologicznej, rokowania oraz zmian molekularnych sugerują, że wiele procesów onkogenezy nadal pozostaje jeszcze niepoznanych [3].
Piśmiennictwo
1. Ławicki S, Mroczko B. Markery nowotworowe przydatne w diagnostyce i monitorowaniu raka jelita grubego. Postępy Hig Med Dośw 2002; 56: 617-34. 2. Nowacki M. Nowotwory jelita grubego. Wydawnictwo Wiedza i Życie, Warszawa 1996; 51-66. 3. Pasz-Walczak G, Jesionek-Kupnicka D. Podstawowe mechanizmy kancerogenezy w jelicie grubym. Współcz Onkol 2004; 8: 303-7. 4. Paduch R, Niedziela P. Markery molekularne w nowotworach układu pokarmowego. Onkol Pol 2004; 7: 19-23. 5. Grzebieniak Z, Szynglarewicz B. Czynniki prognostyczne w raku okrężnicy i odbytnicy. Przew Lek 2004; 61: 43-53. 6. Toyota M, Ohe-Toyota M, Ahuja N, Issa JP. Distinct genetic profiles in colorectal tumors with or without the CpG island methylator phenotype. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 710-5. 7. Vogelstein B, Kinzel K. The genetic basis of human cancer. Trends Genet 1993; 9: 138-41. 8. Jorde L, Carey J. Genetyka nowotworów. W: Genetyka medyczna. Wojcierowski J (red.). Wydawnictwo CZELEJ, Warszawa 2000; 260-83. 9. Feinberg A. Cancer epigenetics takes center stage. PNAS 2001; 98: 392-4. 10. Winter PC, Hickey G, Fletcher H. Epigenetyka i modyfikacje chromatyny. W: Krótkie wykłady. Genetyka. Winter PC, Hickey G, Fletcher H. (red.). Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2003; 374-81. 11. Srebro Z, Lach H. Genetyczne, epigenetyczne i bioenergetyczne mechanizmy starzenia się i nowotworów. Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków 2000. 12. Wierzbicki A. Dziedziczenie epigenetyczne. Kosmos 2004; 53: 271-80. 13. Richards E, Elgin S. Epigenetic codes for heterochromatin formation and silencing, rounding up the usual suspect. Cell 2002; 108: 489-500. 14. Costello J, Plass C. Methylation matters. J Med Genet 2001; 38: 285-303. 15. Brown TA. Genomy. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2001; 172-193. 16. Robertson K, Jones P. DNA methylation: past, present and future directions. Carcinogenesis 2000; 21: 461-7. 17. Neibergs H, Hein D, Spratt J. Genetic profiling of colon cancer. J Surg Oncol 2002; 80: 204-13. 18. Baylin SB, Esteller M, Rountree MR, Bachman KE, Schuebel K, Herman JG. Aberrant patterns of DNA methylation, chromatin formation and gene expression in cancer. Hum Mol Genet 2001; 10: 687-92. 19. Esteller M, Corn PG, Baylin SB, Herman JG. A gene hypermethylation profile of human cancer. Cancer Res 2001; 61: 3225-9. 20. Xu X, Yu J, Zhang H, Sun M, et al. Methylation profile of the promoter CpG islands of 31 genes that may contribute to colorectal carcinogenesis. World J Gastroenterol 2004; 10: 3441-54. 21. Bhakat K, Mitra S. CpG methylation-dependent repression of the human 06-methylguanine-DNA methylotransferase gene linked to chromatin structure alteration. Carcinogenesis 2003; 24: 1337-45. 22. Lind GE, Thorstensen L, Lovig T, Meling GI, Hamelin R, Rognum TO, Esteller M, Lothe RA. A CpG island hypermethylation profile of primary colorectal carcinomas and colon cancer cell lines. Mol Cancer 2004; 3: 1186-97. 23. Jones P, Laird P. Cancer epigenetics come of age. Nature Genet 1999; 21: 163-7. 24. Feinberg A, Oshimura M, Barrett J. Epigenetic mechanisms in human disease. Cancer Res 2002; 62: 6784-7. 25. Rijnsoever M, Grieu F, Elsaleh H, Joseph D. Characterisation of colorectal cancers showing hypermethylation at multiple CpG islands. Gut 2002; 51: 797-802. 26. Mackiewicz K, Lamperska K, Kaczmarek A i wsp. Analiza ekspresji białka oraz mutacji i metylacji wysp CpG p16 w komórkach pierwotnego, sporadycznego czerniaka oka. Współcz Onkol 1999; 6: 231-3. 27. Gmyrek G, Kwiatkowska E, Lamperska K, Mackiewicz A. Analiza metylacji wysp CpG w odcinkach promotorowych genów p15 i p16. Współcz Onkol 2001; 5: 10-2. 28. Yi J, Wang ZW, Cang H, Chen YY, Zhao R, Yu BM, Tang XM. p16 gene methylation in colorectal cancers associated with Duke’s staging. World J Gastroenterol 2001; 7: 722-5. 29. Esteller M, Sparks A, Toyota M, et al. Analysis of adenomatous polyposis coli promoter hypermethylation in human cancer. Cancer Res 2000; 60: 4366-71. 30. Fearnhead N, Britton M, Bodmer W. The ABC of APC. Hum Mol Genet 2001; 10: 721-33. 31. Chen J, Röcken C, Lofton-Day C, Schulz HU, Müller O, Kutzner N, Malfertheiner P, Ebert MP. Molecular analysis of APC promoter methylation and protein expression in colorectal cancer metastasis. Carcinogenesis 2005; 26: 37-43. 32. Qi J, Zhu YQ, Huang MF, Yang D. Hypermethylation of CpG island in 06-methylguanine-DNA methylotransferase gene was associated with K-ras G to A mutation in colorectal tumor. World J Gastroenterol 2005; 11: 2022-5. 33. Esteller M, Risques RA, Toyota M, Capella G, Moreno V, Peinado MA, Baylin SB, Herman JG. Promoter hypermethylation of the DNA repair gene 06-methylguanine-DNA methylotransferase is associated with the presence of G: C to A: T transition mutations in p53 in human colorectal tumorgenesis. Cancer Res 2001; 61: 4689-92. 34. Drewa G, Ferenc T. Podstawy genetyki. Elsevier Urban & Partner, Warszawa 2003; 235-46. 35. Kamieński A, Joseph D. Markery molekularne w raku jelita grubego – doświadczenia z Zachodniej Australii. Współcz Onkol 2003; 7: 54-60. 36. Shannon BA, Iacopetta BJ. Methylation of the hMLH1, p16 and MDR1 genes in colorectal carcinoma: associations with pathological features and with microsatellite instability. Cancer Lett 2001; 167: 91-7. 37. Shannon B, Kay P, House A, Iacopetra B. Hypermethylation of the MYF-3 gene in colorectal carcinoma: associations with pathological features and with microsatellite instability. Int J Cancer 1999; 84: 109-13. 38. Jones P, Gonzalgo M. Altered DNA methylation and genome instability: A new pathway to cancer? Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 2103-5. 39. Su-Lyn K, Meagher A. The relationship between hypomethylation and CpG island methylation in colorectal neoplasia. Am J Pathol 2003; 162: 1361-71. 40. Kopelovich L, Crowell J, Fay J. The epigenome as a target for cancer chemoprevention. J Natl Cancer Inst 2003; 95: 1747-57. 41. Kawakami K, Ruszkiewicz A, Bennett G, Moore J, Grieu F, Watanabe G, Iacopetta B. DNA hypermethylation in the normal colonic mucosa of patients with colorectal cancer. Cancer Res 2006; 94: 593-8.
Adres do korespondencji
lek. Łukasz Krakowczyk Zakład Ogólnej Biologii Lekarskiej ul. Jordana 19 41-808 Zabrze Rokitnica e-mail: helluk@wp.pl