Estrogen receptor alpha and beta expression in normal endometrium and myometrium in premenopausal women

Wstęp


Przez wiele lat uważano, że istnieje tylko jedna forma receptora estrogenowego, przez który estrogeny mogą oddziaływać na komórki [1–3]. W 1996 r. Kuiper i wsp. [4] odkryli istnienie nowej formy estrogenowego receptora w komórkach prostaty szczura. W tym samym roku inna grupa badaczy stwierdziła obecność tego receptora również u człowieka [5, 6]. Wcześniej poznane i scharakteryzowane białko określono jako receptor estrogenowy alfa (ER-alfa), zaś nowe jako receptor estrogenowy beta (ER-beta). Receptory estrogenowe alfa i beta nie są wzajemnymi izoformami, lecz dwoma różnymi białkami, kodowanymi przez dwa odrębne geny, zlokalizowane na różnych chromosomach. Gen kodujący receptor estrogenowy alfa znajduje się w genomie człowieka na długim ramieniu chromosomu 6. (14q22-24) [7], zaś gen kodujący receptor estrogenowy beta na długim ramieniu chromosomu 14. (14q22-24) [8].
Obie postacie receptora po przyłączeniu liganda mogą tworzyć zarówno formy homodimeryczne: alfa-alfa bądź beta-beta, jak i heterodimeryczne alfa-beta. Najniższy wskaźnik powinowactwa do liganda cechuje formę beta-beta [9].
Ekspresja receptorów estrogenowych jest różna w poszczególnych tkankach. Wykazano, że ekspresja ER-beta w nadnerczach myszy znacznie przewyższa ekspresję receptorów alfa [10]. ER-beta przeważa również w układzie sercowo-naczyniowym. Komórki ziarniste jajnika ludzkiego zawierają zarówno ER-alfa, jak i ER-beta [11]. Różnorodna jest również lokalizacja tych receptorów w ośrodkowym układzie nerwowym. Niektóre struktury mózgu posiadają jedynie ER-alfa, inne ER-beta, a niektóre charakteryzują się występowaniem obu receptorów [12].
Brandenberger i wsp. [10], którzy jako pierwsi wykazali koekspresję obu typów receptora estrogenowego u człowieka wykorzystując do badań tkanki macicy płodu, zwrócili uwagę na wyższy poziom ekspresji ER-alfa. Ekspresję obu typów receptora uwidoczniono również w endometrium oraz myometrium uzyskanych od kobiet w okresie reprodukcyjnym [13, 14, 15, 16]. Matsuzaki i wsp. [13] przy pomocy hybrydyzacji in situ wykazali obecność transkryptów dla ER-alfa i ER-beta zarówno w komórkach nabłonkowych, jak i stromalnych endometrium oraz w komórkach błony mięśniowej macicy w przebiegu całego cyklu miesięcznego. W badaniach z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (real-time PCR) stwierdzono wyższy poziom ekspresji ER-alfa w porównaniu do ER-beta w prawidłowym endometrium, przy czym zależność ta była bardziej wyrażona w fazie proliferacyjnej cyklu [16]. Przewagę ekspresji receptora alfa nad receptorem beta w fazie proliferacyjnej cyklu uwidoczniono również w myometrium [15].
Celem pracy była ocena ekspresji receptora estrogenowego alfa i beta w prawidłowych tkankach macicy (myometrium i endometrium) u kobiet w okresie przedmenopauzalnym.


Materiał i metodyka


Badaniem objęto 12 pacjentek w wieku od 45 do 53 lat (średnia wieku 49,6±2,9 lat), które były operowane w II Katedrze i Klinice Ginekologii Akademii Medycznej w Lublinie w latach 1999–2000 z powodu mięśniaków macicy. Z uzyskanych w czasie operacji preparatów pobierano próbki endometrium oraz myometrium. Ponadto, po uzyskaniu pisemnej zgody wykorzystano surowicę krwi pobraną przed zabiegami do oznaczenia poziomu stężenia FSH, LH i estradiolu.
Ekspresję genów receptorów ER-alfa i ER-beta (mRNA) badano metodą odwrotnej transkrypcji (RT) i namnażania cDNA w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Całkowite RNA izolowano z tkanek przy użyciu Trizol (Gibco BRL, USA) wg przepisu producenta. RNA wyizolowane z poszczególnych tkanek rozpuszczano w 10 μl wody depowanej (DEPC H₂O) i przechowywano w temp. -80°C. Porcję RNA (10 μl) przepisywano na cDNA inkubując w temp. 37°C przez 30 min w 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 1 mM dTTP, 5 μg oligo(dT) (Pharmacia, Piscataway, NJ), 40 U RNAsin (Promega, Madison, WI) i 400 IU Maloney Murine Leukemia Virus-reverse transcriptase (M-MLV RT; Gibco BRL) w całkowitej objętości 40 μl. Następnie mieszaninę reakcyjną podgrzewano do temp. 95°C przez 5 min i schładzano do 4°C. Mieszaninę reakcyjną dzielono na porcje po 4 ml i przechowywano w temp. -80°C do czasu wykonania PCR. Jeden pg matrycy kontrolnej z wbudowanym miejscem cięcia DNA, 50 pmol każdego ze starterów, 1X PCR buffer [10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl], 2,5 mM MgCl₂, 10 μCi [³²P]-dCTP (3000 Ci/mmol; Dupont NEN, Boston, MA), i 2,5 U Taq DNA polymerase (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) dodano do porcji cDNA. Reakcję przeprowadzano w całkowitej objętości 100 μl. ER-α i ER-β cDNA amplifikowano oddzielnie przez 25 cykli (94°C przez 60 s; 55°C przez 60 s; 72°C przez 60 s). Produkty amplifikacji wytrącano etanolem i cięto przy użyciu enzymu BamHI, aby otrzymać produkty kontrolne. Produkty PCR rozdzielano na 2% żelu agarozowym. DNA wybarwiano bromkiem etydyny, a następnie z żelu wycinano prążki. Namnożone produkty z komórkowego RNA porównywano do wyniku (cpm) uzyskanego z matrycy kontrolnej DNA. Poziom ekspresji mRNA receptorów przeliczano na całkowite komórkowe DNA, w celu określenia całkowitej liczby komórek w każdej próbie.
Oligonukleotydy starterowe zostały zamówione w Gibco BRL (Grand Island, NY). Specyficzny fragment ER alfa cDNA o długości 505 par zasad amplifikowano przy użyciu starterów komplementarnych do zasad 803-822 i 1288-1307 opublikowanej sekwencji (Genebank accesion numer M1674). Startery dla ER-beta cDNA były komplementarne do zasad 628-647
i 1052-1071 opublikowanej sekwencji (Genebank accession numer AF051427) i flankowały amplifikowany fragment o długości 444 par zasad. W celu otrzymania matryc kontrolnych w sekwencji ER-alfa cytozynę (C) podstawiono adeniną (A) przy zasadzie 1057, a w matrycy dla ER-beta podstawiono C do G przy zasadzie 854 stosując ukierunkowaną mutagenezę, aby uzyskać specyficzne miejsce cięcia dla enzymu restrykcyjnego BamHI [12]. Matryca kontrolna (1 pg) była dodawana do każdej reakcji PCR.
Całkowite komórkowe DNA izolowano z tkanek przy użyciu Trizol (Gibco BRL) wg przepisu producenta. Osad DNA rozpuszczano w 50 μl 8 mM NaOH w 37°C przez 10 min, a następnie ustalano pH do wartości 7.4 1M HEPES. Stężenie DNA mierzono przy użyciu metody fluorescencyjnej (PicoGreen dsDNA Quantitation Kit, Molecular Probes, Inc, Eugene, OR). Dokładnie 20 μl próby rozpuszczano w 2 ml roztworu PicoGreen i mierzono fluorescencję we fluorymetrze Turner Designs (Sunnyvale, CA). Stężenie DNA w próbie wyliczano z krzywej standardowej przez linijną regresję fluorescencji utworzonej z lambda DNA o znanym stężeniu (ryc. 1. i 2.).
W surowicy krwi pacjentek, którą pobierano przed zabiegami operacyjnymi oznaczano poziom stężenia FSH, LH i estradiolu. Uzyskaną surowicę przechowywano w komorze głębokiego zamrażania (-80oC) do czasu analizy. Stężenie FSH, LH oraz estradiolu w badanych próbkach surowicy określano radioimmunologicznie wykorzystując znakowane ¹²⁵J komercyjne zestawy do oznaczeń hormonalnych (Estradiol, LH, FSH: [¹²⁵J] Coated Tube Radioimmunoassay SPECTRIA Orion Diagnostica, Finlandia).
Analizę statystyczną przeprowadzono przy pomocy programu Statistica Statsoft vs 5.1. stosując testy Manna-Whitneya oraz Wilcoxona. Wyniki testów uznano za istotne statystycznie przy p<0,05.


Wyniki


Ekspresję receptorów estrogenowych alfa i beta wykazano we wszystkich badanych próbkach. W mięśniu macicy ekspresja receptora estrogenowego alfa była znacząco wyższa w porównaniu do receptora beta (p=0,02) (tab. I). W endometrium poziom ekspresji obu typów receptora wykazywał zbliżone wartości. Ekspresja receptora estrogenowego alfa była istotnie statystycznie wyższa w myometrium w porównaniu do endometrium (p=0,018), podczas gdy ekspresja ER-beta nie różniła się znacząco pomiędzy badanymi tkankami. Stosunek ekspresji ER-alfa do ER-beta nie różnił się istotnie pomiędzy myometrium a endometrium.
Stężenia FSH, LH oraz estradiolu w surowicy kobiet objętych badaniem przedstawia tab. II.


Dyskusja


W szeregu badań wykazano, że oddziaływanie estrogenów na tkanki docelowe uzależnione jest od dystrybucji obu typów receptora estrogenowego oraz interakcji pomiędzy białkami receptorowymi. Receptor estrogenowy alfa i beta wykazują różne powinowactwo do substratów oraz odmiennie regulują transkrypcję genów [17]. Oba typy receptora tworzą homodimery lub heterodimery, które posiadają zdolność przyłączania się do ERE (ang. estrogen response elements) w odcinkach regulatorowych genów [18]. Wzajemne oddziaływanie obu typów receptora wydaje się być jednym z najważniejszych mechanizmów, odpowiedzialnych za efekt działania estrogenów na tkanki docelowe. Opinię tę potwierdzają badania wykazujące, że receptor estrogenowy beta reguluje aktywność transkrypcyjną receptora typu alfa i w zależności od stężenia estrogenów pobudza lub hamuje ekspresję genów [19].
W niniejszej pracy oceniono i porównano ekspresję receptorów estrogenowych alfa i beta w prawidłowych tkankach macicy. W myometrium zaobserwowano dominację ekspresji ER-alfa nad ER-beta, podczas gdy w błonie śluzowej macicy poziomy ekspresji obu typów receptora nie różniły się znacząco. Pomimo to, stosunek ekspresji ER-alfa do ER-beta nie różnił się pomiędzy badanymi tkankami. Interesujący jest fakt, że ekspresja ER-alfa była ponadtrzykrotnie wyższa w myometrium niż w endometrium.
Różnice w ekspresji receptorów estrogenowych pomiędzy błoną śluzową a mięśniem macicy mogą warunkować specyficzną dla danej tkanki odpowiedź na estrogeny. Mogą także być wyrazem zaangażowania innych mechanizmów, regulujących ekspresję tychże receptorów w endometrium i myometrium. W dotychczas opublikowanych badaniach obserwowana zarówno w myometrium, jak i endometrium przewaga ekspresji ER-alfa nad ER-beta dotyczyła przede wszystkim fazy proliferacyjnej cyklu [15, 16]. W niniejszej pracy badaniami objęto populację kobiet w okresie przedmenopauzalnym. Pomimo że wszystkie uczestniczki badania zgłaszały regularne miesiączkowanie, u znacznej części pacjentek stwierdzono niezgodność pomiędzy fazą cyklu ustaloną na podstawie ostatniej miesiączki a obrazem histologicznym endometrium. W związku z tym niemożliwa była analiza zależności ekspresji receptorów od fazy cyklu płciowego. Z drugiej strony należy zauważyć, że zmiany w funkcjonowaniu osi podwzgórze-przysadka-jajnik zachodzące u kobiet przed menopauzą mogą wywierać istotny wpływ na ekspresję receptorów estrogenowych. W badaniach in vitro wykazano, że synteza obu typów receptora regulowana jest przez estradiol, ale przypuszcza się, że istotną rolę może odgrywać również FSH [20]. U większości uczestniczek naszego badania stężenia FSH w surowicy krwi odzwierciedlają zmiany hormonalne, charakterystyczne dla okresu przedmenopauzalnego (tab. II). Dlatego wielce prawdopodobne jest, że uzyskane przez nas wyniki obrazują zależności w ekspresji receptorów estrogenowych u kobiet w okresie przed menopauzą, które mogą wykazywać inną charakterystykę niż we wcześniejszych latach życia.
W dotychczas opublikowanych pracach nie dokonano ilościowej oceny ekspresji receptorów estrogenowych jednocześnie w błonie śluzowej i mięśniu macicy, uzyskanych od tej samej pacjentki. Zaskakującym wynikiem naszych badań było stwierdzenie wyższej ekspresji ER-alfa w myometrium w porównaniu do endometrium, co mogłoby sugerować większą wrażliwość myometrium na działanie estrogenów. Zważywszy jednak, że w świetle współczesnej wiedzy receptor estrogenowy beta reguluje aktywność transkrypcyjną receptora alfa [19] a stosunek ER-alfa/ER-beta pomiędzy badanymi tkankami nie różnił się istotnie statystycznie, bezwzględnie wyższa ekspresja receptora alfa nie może być uważana za cechę świadczącą o większej estrogenowrażliwości myometrium w porównaniu do endometrium.
Podsumowując, wyniki naszej pracy potwierdzają ekspresję obu typów receptora estrogenowego w prawidłowych tkankach macicy u kobiet w okresie przedmenopauzalnym. W świetle naszych badań różnice w ekspresji receptorów pomiędzy błoną śluzową a mięśniem macicy dotyczą jedynie receptora alfa.


Piśmiennictwo


1. Beato M, Truss M, Chavez S. Control of transcription by steroid hormones. Ann N Y Acad Sci USA. 1996; 784: 93-123.
2. Green S, Walter P, Kumar V, et al. Human oestrogen receptor cDNA: sequence, expression and homology to v-erbA. Nature 1986; 320: 134-9.
3. Mangelsdorf DJ, Thummel C, Beato M, et al. The nuclear receptor superfamily: the second decade. Cell 1995; 83: 835-9.
4. Kuiper GG, Enmark E, Pelto-Huikko M, et al. Cloning of a novel receptor expressed in rat prostate and ovary. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 5925-39.
5. Mosselman S, Pohlman J, Dijkema R. ER beta: identification and characte-risation of novel human estrogen receptor. FEBS Lett 1996; 392: 49-53.
6. Taylor AH, Al-Azzawi F. Immunolocalisation of estrogen receptor beta in human tissues. J Mol Endocrinol 2000; 24: 145-55.
7. Ponglikitmongkol M, Green S, Chambon P. Genomic organization of the human oestrogen receptor gene. EMBO J 1988; 11: 3385-8.
8. Enmark E, Pelto-Huikko M, Grandien K, et al. Human estrogen receptor b-gene structure, chromosomal localization, and expression patern. J Clin Endocrinol Metab 1997; 82: 4258-65.
9. Cowley SM, Hoare S, Mosselman S, Parker MG. Estrogen receptors alfa and beta form heterodimers on DNA. J Biol Chem 1997; 32: 19858- 62.
10. Brandenberger AW, Tee MK, Lee JY et al. Tissue distribution of estrogen alfa and beta mRNA in the midgestational human fetus. J Clin Endocrinol Metab 1997; 82: 3509-12.
11. Jakimiuk JA, Weitsman SR, Yen H-W, et al. Estrogen receptor alpha and beta expression in theca and granulosa cells from women with polycystic ovary syndrome. J Clin Endocrinol Metab 2002; 87: 5532-8.
12. Shughrue PJ, Lane MV, Merchenthaler. Comparative distribution of estrogen receptor-alpha and -beta mRNA in the rat central nervous system. J Comp Neurol 1997; 388: 507-25.
13. Matsuzaki S, Fukaya T, Suzuki T, et al. Oestrogen receptor alpha and beta mRNA expression in human endometrium throughout the menstrual cycle. Mol Hum Reprod 1999; 5: 559-64.
14. Rey JM, Pujol P, Dechaud H, et al. Expression of oestrogen receptor-alpha splicing variants and oestrogen receptor-beta in endometrium of infertile patients. Mol Hum Reprod 1998; 4: 641-7.
15. Wang H, Wu X, Englund K, et al. Different expression of estrogen receptors alfa and beta in human myometrium and leiomyoma during the proliferative phase of the menstrual cycle and after GnRHa treatment. Gynecol Endocrinol 2001; 15: 443-52.
16. Witek A, Mazurek U, Paul M, Bierzyńska-Macyszyn G, Wilczok T. Quantitative analysis of estrogen receptor mRNA in human endometrium through the menstrual cycle using a real-time reverse transcription-polymerase chain react assay. Folia Histochem Cytobiol 2001; 39: 116-8.
17. Kuiper GGJM, Carlsson K, Grandien K, et al. Comparison of the ligand binding specifity and transcript tissue distribution of estrogen receptors a and b. Endocrinology 1997; 138: 863-70.
18. Pace P, Taylor J, Suntharalingam S, et al. Human estrogen receptor (binds DNA in a manner similar to and dimerizes with estrogen receptor a. J Biol Chem 1997; 272: 25832-8.
19. Hall JM, McDonnel DP. The estrogen β-isoform (ERβ) of the human estrogen receptor modulates ERa transcriptional activity and is a key regulator of the cellular response to estrogens and antiestrogens. Endocrinology 1999; 140: 5566-78.
20. Yang P, Kriatchko A, TRoy SK. Expression of ER-alfa and ER-beta in hamster ovary: differential regulation by gonadotropins and ovarian steroids. Endocrionology 2002; 143: 2385-98.


Adres do korespondencji
II Katedra i Klinika Ginekologii AM w Lublinie
Samodzielny Publiczny Szpital Kliniczny Nr 4
ul. Jaczewskiego 8
20-954 Lublin