Evaluation of HOXA group gene expression in endometrium of women with endometriosis

Endometrioza jest przewlekłym schorzeniem związanym z bólem i niepłodnością. Częstość jej występowania ocenia się na 10% wśród kobiet w wieku rozrodczym, natomiast u kobiet z niepłodnością rozpoznawana jest w 50% przypadków [1]. Wyniki metaanaliz dotyczące ciąż kobiet z endometriozą wskazują na 2-krotnie niższy ich odsetek w stosunku do grupy z czynnikiem jajowodowym czy niewyjaśnioną przyczyną niepłodności [2–4]. W sytuacji rozpoznania endometriozy zaawansowanej, pod postacią torbieli endometrialnych oraz zrostów, niemożność zajścia w ciążę wydaje się mieć swoje uzasadnienie. Jednak na podstawie danych literaturowych oraz obserwacji klinicznych wiadomo, że również endometrioza minimalna często współistnieje z niepłodnością. Na podstawie wyników zapłodnienia pozaustrojowego można twierdzić, iż niższy odsetek ciąż w endometriozie jest wynikiem zmniejszonej rezerwy jajnikowej, gorszej jakości oocytów i zarodków oraz niższego odsetka implantacji [4]. Wiadomo, że wśród kobiet z endometriozą, które uzyskały oocyty od dawczyń, liczba uzyskanych ciąż jest limitowana procesem implantacji [5]. Wpływ endometriozy na implantację został zademonstrowany na modelu króliczym [6]. W grupie z endometriozą oraz w grupie kontrolnej liczba ciałek żółtych oraz zapłodnionych komórek jajowych była podobna, natomiast stwierdzono 50-procentową redukcję w częstości implantacji u królików z endometriozą.
Powodzenie implantacji zależne jest od receptywności endometrium. Za markery receptywności endometrium uważa się substancje występujące zarówno na powierzchni endometrium, jak i wydzielane do jamy macicy, których ekspresja maksymalnie nasila się w okresie implantacji blastocysty [7]. U kobiet z endometriozą sugeruje się występowanie zaburzeń w ekspresji uznanych markerów receptywności endometrium, takich jak integryny, Cox-2, kalcytonina oraz trofinina [8–11].
Ostatnio zwrócono szczególną uwagę na geny HOXA-10 i HOXA-11, których ekspresję obserwuje się w endometrium w czasie całego cyklu miesiączkowego, jednak jej największy wzrost stwierdza się w środkowej fazie lutealnej [12].
Geny HOXA-10 i HOXA-11 są członkami podklasy genów homeobox, po raz pierwszy opisanych u Drosophila melanogaster. Geny te charakteryzują się obecnością zbudowanej z 183 par zasad sekwencji DNA, znanej jako homeobox, która koduje 61-aminokwasową domenę zwaną homeodomeną [13]. Produkty tych genów działają jako czynniki transkrypcyjne, regulujące działanie innych genów. Geny z rodziny HOXA, których jest przynajmniej 16, są odpowiedzialne za rozwój segmentowy zarodka, wzdłuż jego przednio-tylnej osi ciała, w tym narządów płciowych. Gen HOXA-10 odgrywa rolę w rozwoju macicy, natomiast gen HOXA-11 w rozwoju dolnej części macicy oraz szyjki macicy [14]. Podczas gdy ekspresja genów HOXA obserwowana jest w gruczołach oraz podścielisku endometrium w ciągu całego cyklu, jej natężenie wzrasta maksymalnie w środkowej fazie lutealnej, w okresie okna implantacyjnego [15, 16]. Mimo że nieznane są mutacje ludzkich genów HOXA-10 i HOXA-11, pacjentki z obniżoną ekspresją tych 2 genów w czasie fazy wydzielniczej mają obniżony odsetek implantacji [17].
Celem pracy była odpowiedź na pytania, czy zaburzona ekspresja genów z rodziny HOXA jako markera receptywności w endometrium może mieć znaczenie w etiopatogenezie niepłodności u kobiet z endometriozą.
Cel pracy realizowano poprzez ocenę ekspresji genów HOXA-10 i HOXA-11 w endometrium w okresie okna implantacyjnego u kobiet z endometriozą, niepłodnością idiopatyczną oraz w grupie kontrolnej.

Materiał i metody

Materiał biologiczny stanowiło endometrium uzyskane od 40 pacjentek w wieku rozrodczym.
Analizą objęto 13 pacjentek z endometriozą, 10 z niepłodnością idiopatyczną oraz 17 kobiet, które stanowiły grupę kontrolną.
U wszystkich pacjentek wykonano laparoskopię (u 15 wraz z histeroskopią) w okresie tzw. okna implantacyjnego, tzn. 7–9 dni po owulacji, której dokładny dzień został ustalony na podstawie ultrasonograficznej oceny jajeczkowania. U 25 pacjentek, u których nie wykonano histeroskopii, endometrium uzyskano za pomocą pipelli. Pacjentki były klasyfikowane do poszczególnych grup na podstawie rozpoznania ustalonego w trakcie laparoskopii.
Pacjentki, u których na podstawie wizualizacji ognisk rozpoznano endometriozę, utworzyły grupę badaną. Stopień zaawansowania endometriozy określono na podstawie klasyfikacji Amerykańskiego Towarzystwa Płodności.
Do grupy kobiet z niepłodnością idiopatyczną zaliczono pacjentki, u których w laparoskopii nie zaobserwowano żadnych zmian w miednicy mniejszej. U tych chorych przed wykonaniem procedury operacyjnej nie stwierdzono odchyleń w badaniu hormonalnym, obrazie HSG oraz ocenie semiologicznej.
Grupę kontrolną utworzyły pacjentki, u których stwierdzono łagodne zmiany w jajnikach lub mięśniaki macicy. Przynajmniej raz rodziły one o czasie i miały regularne cykle miesiączkowe. Badanie histopatologiczne wykluczyło zmiany w endometrium.
Biopsje endometrium pobierano w okresie okna implantacyjnego, za pomocą pipelli lub podczas zabiegu histeroskopii. Materiał został zabezpieczony w buforze RNAlater® (Qiagen, Australia) i zamrożony w temperaturze –80°C do chwili izolacji totalnego RNA.
Izolację kwasu RNA z zabezpieczonych biopsji przeprowadzono wg instrukcji producenta, zestawem do izolacji RNA – Rnaesy Protect Mini Kit (Qiagen, Australia).


Oznaczenie ekspresji poszczególnych genów metodą RT-qPCR przeprowadzono w II etapach:
• I etap – odwrotna transkrypcja zestawem odczynników QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Australia). Z każdej próbki roztwór zawierający nie więcej niż 1 mg wyizolowanego RNA został poddany procesowi RT wg wskazówek producenta zestawu odczynników. W skład procedury wchodziła także eliminacja potencjalnie obecnego DNA. Produktem tego etapu był powstały w wyniku konwersji mRNA komplementarny DNA.
• II etap – reakcja real-time PCR; 2 ml matrycy zawierającej nie więcej niż 200 ng cDNA, uzyskanego w pierwszym etapie zostało wykorzystane do przeprowadzenia ilościowej analizy ekspresji badanych genów zestawem odczynników DyNAmo HS SYBR Green qPCR Kit Finnzymes (Finlandia). Profil reakcji i skład mieszaniny reakcyjnej zostały opracowane wg wskazówek producenta odczynników. Startery do reakcji qPCR zostały zaprojektowane programem Primer3 [18].
Specyficzność oligonukleotydów wyznaczonych w tej procedurze została potwierdzona w bazie BLAST (tab. I) [19].
Do wyznaczenia wydajności reakcji qPCR wykorzystano szereg 6 kolejnych 10-krotnych rozcieńczeń DNA będącego specyficznym produktem reakcji PCR dla każdego z badanych transkryptów.
Reakcje qPCR prowadzono przy użyciu termocyklera Rotor-Gene3000, CorbettResearch (Australia). W trakcie reakcji qPCR, po każdym cyklu wyznaczany był przyrost produktu, a po zakończeniu reakcji program sterujący termocyklerem wyznaczył poziom fluorescencji (Ct), przy którym tempo przyrostu produktu reakcji osiągnęło wartość wykładniczą.
Do wyznaczenia względnego poziomu ekspresji i analizy statystycznej uzyskanych wyników użyto oprogramowania:
• REST2005 [20],
• MedCalc [21].

Wyniki
Ocena ekspresji HOXA-10 w endometrium
Analiza ekspresji genu HOXA-10 przy użyciu metody RT-PCR w endometrium wykazała, iż u kobiet z endometriozą była ona o 44% niższa w porównaniu z endometrium kobiet z grupy kontrolnej oraz o 32% niższa w porównaniu z kobietami z niepłodnością idiopatyczną.
Także ekspresja HOXA-10 w endometrium od kobiet z niewyjaśnioną przyczyną niepłodności była o 33% niższa w porównaniu z pacjentkami z grupy kontrolnej (ryc. 1.).
Obniżoną ekspresję stwierdzano w 64% endometrium w grupie pacjentek z endometriozą oraz w 62% w grupie pacjentek z niepłodnością idiopatyczną.

Ocena ekspresji HOXA-11 w endometrium
Na podstawie badania ekspresji genu HOXA-11 w endometrium stwierdzono, iż w grupie kobiet z endometriozą ekspresja była o 60% niższa w porównaniu z endometrium pacjentek z grupy kontrolnej oraz o 37% niższa w porównaniu z pacjentkami z niepłodnością idiopatyczną.
Podobnie jak podczas analizy ekspresji genu HOXA-10 stwierdzono, iż ekspresja HOXA-11 w endometrium pobranym od kobiet z niepłodnością idiopatyczną była o 46% niższa w porównaniu z chorymi z grupy kontrolnej (ryc. 2.). Obniżoną ekspresję stwierdzano w 67% endometrium w grupie pacjentek z endometriozą oraz w 56% w grupie z niepłodnością idiopatyczną.
Analiza statystyczna nie wykazała jednak istotnych różnic zarówno w natężeniu ekspresji genów HOXA-10 i HOXA-11, jak i w częstości występowania obniżonej ekspresji między analizowanymi grupami.

Analiza korelacjiM

Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono obecność istotnych statystycznie, dodatnich (p<0,0001) korelacji między ekspresją HOXA-10 i HOXA-11 we wszystkich analizowanych grupach (ryc. 3.–5.).

Dyskusja

Liczne badania wskazują, iż obniżona płodność kobiet z endometriozą może wynikać z nieprawidłowej funkcji endometrium. W tej grupie pacjentek stwierdzono zaburzoną ekspresję integryn avb, EMX2, interleukiny 11 oraz czynnika hamującego białaczkę (ang. leukemia inhibitory factor – LIF) w błonie śluzowej macicy w okresie okna implantacyjnego [8, 17, 18, 22, 23].
W prawidłowo funkcjonującym endometrium stwierdza się zróżnicowaną ekspresję genów HOXA-10 i HOXA-11, ze szczytem w okresie okna implantacyjnego, natomiast – jak wykazano na modelu mysim – jej obniżenie związane jest ze zmniejszonym odsetkiem implantacji na skutek zaburzonej receptywności endometrium [21]. W pracy przeanalizowano ekspresję genów HOXA-10 i HOXA-11 w okresie okna implantacyjnego w endometrium kobiet z endometriozą, niepłodnością oraz w grupie kontrolnej.
Benson i wsp. [25] oraz Hsieh-Li i wsp. [26] na podstawie doświadczeń przeprowadzonych na myszach sformułowali wniosek, że najbardziej istotnym warunkiem implantacji jest matczyna ekspresja genów HOXA. Zaobserwowali oni, że u myszy transgenicznych pozbawionych genu HOXA-10 notuje się przemianę górnego segmentu macicy w strukturę podobną do jajowodu i zahamowanie implantacji, nawet jeżeli zarodek jest transportowany do niezmienionego dolnego segmentu macicy. Podobnie myszy homozygotyczne mające zmutowane geny HOXA-11 są niepłodne z powodu defektów w implantacji [26]. Myszy, u których nie zachodzi ekspresja HOXA-10 i HOXA-11, wytwarzają prawidłową liczbę zarodków, które są zdolne do implantowania się u innych myszy. Z kolei zarodki myszy z prawidłową ekspresją HOXA-10 i HOXA-11 nie są zdolne do implantacji u myszy pozbawionych HOXA-10 i HOXA-11 [27]. Znaczenie genu HOXA-10 w procesie implantacji zostało potwierdzone eksperymentalnie przy użyciu oligonukleotydów antysensownych w stosunku do HOXA-10. Zostały one wstrzyknięte do mysich macic, wynikiem czego zmniejszył się odsetek implantacji [28].
Wydaje się, iż zarówno HOXA-10, jak i HOXA-11 mają istotne znaczenie nie tylko u myszy. Również u ludzi zaburzenie ekspresji tych genów w endometrium obserwuje się w sytuacjach związanych z obniżeniem implantacji – w zespole PCO, wodniaku jajowodu oraz endometriozie [29–31]. Ponadto dodanie płynu jajowodowego z wodniaka jajowodu do medium hodowlanego skutkuje obniżeniem ekspresji HOXA-10 in vitro [30]. Wzrost ekspresji HOXA-10 odnotowano natomiast w jajowodzie z ciążą ektopową [32].
Badania, przeprowadzone przez autorów niniejszej pracy przy użyciu metody RT-PCR, nie wykazały istotnej statystycznie różnicy w ekspresji genów HOXA między analizowanymi grupami. W grupie kobiet z endometriozą stwierdzono niższą odpowiednio o 44 i 60% ekspresję genów HOXA-10 i HOXA-11 w porównaniu z pacjentkami z grupy kontrolnej. Prawdopodobnie na brak potwierdzenia statystycznej różnicy miała wpływ zbyt mała liczebność grup. Ciekawym spostrzeżeniem jest również to, iż pacjentki z niewyjaśnioną przyczyną niepłodności, podobnie jak kobiety z endometriozą, wykazywały aż o 1/3 niższą ekspresję HOXA-10 i prawie o połowę niższą ekspresję HOXA-11. Fakt ten sugeruje, iż również w tej grupie pacjentek niepłodność może być wynikiem nieprawidłowego funkcjonowania endometrium. We wszystkich badanych grupach analiza korelacji wykazała ponadto istotną statystycznie (p=0,0001), pozytywną zależność między ekspresją HOXA-10 a HOXA-11. Uzyskany wynik nie jest dla autorów zaskoczeniem i potwierdza fakt, iż wzrost ekspresji obserwowany w okresie okna implantacyjnego dotyczy obu genów.
Istnieją pojedyncze doniesienia, dotyczące badań ekspresji genu HOXA-10 i HOXA-11 u kobiet z endometriozą. Wu i wsp. [34] stwierdzili obniżenie ekspresji genu HOXA-10 w grupie 6 kobiet z torbielami endometrialnymi w porównaniu z kobietami zdrowymi. Ponadto u 3 pacjentek w grupie badanej wykazali zaburzenia w metylacji 3 fragmentów genu HOXA-10. Autorzy sugerują, iż zaburzona ekspresja badanych genów, która prawdopodobnie wpływa negatywnie na implantację zarodka, jest wynikiem ich nieprawidłowej metylacji.
Analiza przeprowadzona przez Taylor i wsp. [17] za pomocą metody Northern blot wykazała brak charakterystycznego wzrostu ekspresji genów HOXA-10 i HOXA-11 w środkowej fazie lutealnej, która była istotnie statystycznie niższa (p=0,01) w grupie kobiet z endometriozą w porównaniu z kobietami zdrowymi zarówno w okresie okna implantacyjnego, jak i późnej fazie lutealnej. Podobne spostrzeżenia opisali Kim i wsp. [35], którzy przeanalizowali ekspresję genu HOXA-10 w endometrium małp z indukowaną endometriozą. Autorzy zaobserwowali stopniowy spadek HOXA-10 mRNA wraz z czasem trwania choroby (istotny od 12. mies.), a także regulowaną przez geny HOXA zaburzoną ekspresję b3-integryny i EMX2.
Zjawisko obniżonej płodności chorych z endometriozą jest najprawdopodobniej złożone. Spośród wielu czynników determinujących zajście w ciążę w tej grupie kobiet, endometrium wydaje się mieć istotne znaczenie. Uzyskanie optymalnych warunków do implantacji wymaga współdziałania ogromnej liczby molekuł, których rola w procesie różnicowania endometrium nie jest, niestety, zrozumiała w stopniu satysfakcjonującym. Geny HOXA-10 i HOXA-11, których nieprawidłowa (nawet w niewielkim stopniu) ekspresja, w postaci braku charakterystycznego jej wzrostu w okresie okna implantacyjnego, może skutkować kaskadą zaburzonego funkcjonowania innych związków, a w efekcie być jednym z etiologicznych czynników niepłodności kobiet z endometriozą.
zaburzenie ekspresji tych genów w endometrium obserwuje się w sytuacjach związanych z obniżeniem implantacji – w zespole PCO, wodniaku jajowodu oraz endometriozie [29–31]. Ponadto dodanie płynu jajowodowego z wodniaka jajowodu do medium hodowlanego skutkuje obniżeniem ekspresji HOXA-10 in vitro [30]. Wzrost ekspresji HOXA-10 odnotowano natomiast w jajowodzie z ciążą ektopową [32]. Badania, przeprowadzone przez autorów niniejszej pracy przy użyciu metody RT-PCR, nie wykazały istotnej statystycznie różnicy w ekspresji genów HOXA między analizowanymi grupami. W grupie kobiet z endometriozą stwierdzono niższą odpowiednio o 44 i 60% ekspresję genów HOXA-10 i HOXA-11 w porównaniu z pacjentkami z grupy kontrolnej. Prawdopodobnie na brak potwierdzenia statystycznej różnicy miała wpływ zbyt mała liczebność grup. Ciekawym spostrzeżeniem jest również to, iż pacjentki z niewyjaśnioną przyczyną niepłodności, podobnie jak kobiety z endometriozą, wykazywały aż o 1/3 niższą ekspresję HOXA-10 i prawie o połowę niższą ekspresję HOXA-11. Fakt ten sugeruje, iż również w tej grupie pacjentek niepłodność może być wynikiem nieprawidłowego funkcjonowania endometrium. We wszystkich badanych grupach analiza korelacji wykazała ponadto istotną statystycznie (p=0,0001), pozytywną zależność między ekspresją HOXA-10 a HOXA-11. Uzyskany wynik nie jest dla autorów zaskoczeniem i potwierdza fakt, iż wzrost ekspresji obserwowany w okresie okna implantacyjnego dotyczy obu genów. Istnieją pojedyncze doniesienia, dotyczące badań ekspresji genu HOXA-10 i HOXA-11 u kobiet z endometriozą. Wu i wsp. [34] stwierdzili obniżenie ekspresji genu HOXA-10 w grupie 6 kobiet z torbielami endometrialnymi w porównaniu z kobietami zdrowymi. Ponadto u 3 pacjentek w grupie badanej wykazali zaburzenia w metylacji 3 fragmentów genu HOXA-10. Autorzy sugerują, iż zaburzona ekspresja badanych genów, która prawdopodobnie wpływa negatywnie na implantację zarodka, jest wynikiem ich nieprawidłowej metylacji. Analiza przeprowadzona przez Taylor i wsp. [17] za pomocą metody Northern blot wykazała brak charakterystycznego wzrostu ekspresji genów HOXA-10 i HOXA-11 w środkowej fazie lutealnej, która była istotnie statystycznie niższa (p=0,01) w grupie kobiet z endometriozą w porównaniu z kobietami zdrowymi zarówno w okresie okna implantacyjnego, jak i późnej fazie lutealnej. Podobne spostrzeżenia opisali Kim i wsp. [35], którzy przeanalizowali ekspresję genu HOXA-10 w endometrium małp z indukowaną endometriozą. Autorzy zaobserwowali stopniowy spadek HOXA-10 mRNA wraz z czasem trwania choroby (istotny od 12. mies.), a także regulowaną przez geny HOXA zaburzoną ekspresję b3-integryny i EMX2.
Zjawisko obniżonej płodności chorych z endometriozą jest najprawdopodobniej złożone. Spośród wielu czynników determinujących zajście w ciążę w tej grupie kobiet, endometrium wydaje się mieć istotne znaczenie. Uzyskanie optymalnych warunków do implantacji wymaga współdziałania ogromnej liczby molekuł, których rola w procesie różnicowania endometrium nie jest, niestety, zrozumiała w stopniu satysfakcjonującym. Geny HOXA-10 i HOXA-11, których nieprawidłowa (nawet w niewielkim stopniu) ekspresja, w postaci braku charakterystycznego jej wzrostu w okresie okna implantacyjnego, może skutkować kaskadą zaburzonego funkcjonowania innych związków, a w efekcie być jednym z etiologicznych czynników niepłodności kobiet z endometriozą.