Expression of human telomerase RNA component (hTR) in basal cell carcinoma and squamous cell carcinoma of skin

Wprowadzenie
Rak skóry jest u ludzi rasy białej jednym z najczęściej występujących nowotworów. Stanowi ok. 98% wszystkich nowotworów złośliwych skóry i ok. 1/3 wszystkich nowotworów złośliwych. Do najczęstszych raków skóry należy rak podstawnokomórkowy (carcinoma basocellulare, BCC) i rak kolczystokomórkowy (carcinoma spinocellulare, SCC). BCC jest nowotworem skóry o stosunkowo niewielkiej i tylko miejscowej złośliwości, niedającym przerzutów, rozprzestrzeniającym się kosztem otaczających go tkanek. Natomiast SCC jest bardziej niebezpieczny ze względu na znacznie większą złośliwość, skłonność do naciekania oraz możliwość pojawiania się przerzutów. Poszukiwanie różnic molekularnych pomiędzy tymi nowotworami może wskazać na czynniki biorące udział w powstawaniu większej złośliwości choroby. Telomeraza jest enzymem syntetyzującym telomery DNA, przez co odgrywa istotną rolę w starzeniu się komórki, jej nieśmiertelności i nieograniczonym namnażaniu się (immortalizacji). Składową telomerazy jest podjednostka hTR, będąca matrycą dla syntezy brakujących fragmentów telomerów [1], może ona również wpływać na ekspresję [2] i aktywność telomerazy [3]. Autorzy licznych badań wskazują, że podjednostka hTR genu telomerazy może być użyta jako marker chorób nowotworowych, m.in. w raku endometrium [4], białaczce [5], nowotworach tkanki nerwowej [6]. W czerniaku skóry (melanoma malignom, MM) gen ten może być wykorzystany jako marker złośliwości i przerzutowania [7] oraz może mieć zastosowanie w terapii nowotworowej czerniaka [8] i raka trzustki [3]. Jednak badania ekspresji hTR w raku żołądka i okrężnicy [9], w raku płuc [10] i endometrium [11] oraz w różnych nowotworach skóry [12, 13] nie potwierdzają korelacji ekspresji tego genu z chorobą.
W związku z powyższymi, sprzecznymi doniesieniami na temat korelacji ekspresji hTR z procesem nowotworowym przeprowadziliśmy analizy oparte na ilościowej ocenie ekspresji podjednostki hTR genu telomerazy w 2 najczęściej występujących rakach skóry, a różniących się stopniem złośliwości: w raku podstawnokomórkowym i kolczystokomórkowym.
Celem naszych badań było oznaczanie stopnia aktywności transkrypcyjnej genu hTR – podjednostki telomerazy odpowiedzialnej za immortalizację komórek techniką real time QRT-PCR w BCC i SCC oraz porównanie ekspresji genu hTR w tych 2 guzach skóry.
Materiał i metody
Ocenie molekularnej poddano wycinki tkanek nowotworowych uzyskane od 18 pacjentów (10 mężczyzn, 8 kobiet), średnia wieku 76 lat, którzy zostali poddani zabiegowi chirurgicznego usunięcia guzów skóry. Materiał do badań porcjowano na 2 części: pierwsza część przeznaczona była do badania patomorfologicznego, drugi jej fragment przechowywano w temp. -80˚C do momentu analizy molekularnej. W próbkach, w których rozpoznano raka podstawnokomórkowego (n=9) i raka kolczystokomórkowego (n=9), oceniano ekspresję mRNA podjednostki hTR genu telomerazy (tab. 1.).
Izolacja RNA przeprowadzona została za pomocą metody chloroformowo-fenolowej, opisanej przez Chomczyńskiego i Sacchi [14]. Ekstrakty RNA oczyszczano poprzez trawienie DNA-zą I na kolumnach RNeasy Mini Kit (Qiagen, Niemcy) w celu uniknięcia zanieczyszczeń genomowym DNA. Otrzymany RNA stanowił matrycę w reakcji real time QRT-PCR dla oznaczenia liczby kopii mRNA podjednostki hTR genu telomerazy. Amplifikacja prowadzona była jednostopniowo w obecności termostabilnej polimerazy Tth, primerów (hTR-24 5' AGG CGC CGT GCT TTT GCT CC 3', hTR-146 5'GGC CAG CTG ACA TTT TTT GTT T 3') i sondy hybrydyzacyjnej (S-hTR 5'FAM CCT GCC GCC TTC CACCGT TCA TTC TAMRA 3') z zastosowaniem detektora sekwencji ABI PRISM^TM 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) [15].
Analizę statystyczną uzyskanych wyników przeprowadzono za pomocą testu F Snedecora dla określenia wariancji porównywanych prób oraz test t z oddzielną estymacją wariancji dla prób niezależnych, przyjmując poziom istotności p<0,05.
Badania przeprowadzone zostały zgodnie z wymogami Deklaracji helsińskiej.
Wyniki
W wyniku reakcji real time QRT-PCR wykazano obecność mRNA podjednostki hTR genu telomerazy we wszystkich 18 wycinkach pobranych z raka podstawnokomórkowego i kolczystokomórkowego. Według komercyjnie dostępnego zestawu stężeń β-aktyny (od 1x10³ do 2x10⁴ kopii mRNA β-aktyny) (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) wykreślono krzywą standardową i na jej podstawie obliczono liczbę kopii mRNA podjednostki hTR genu telomerazy w badanych próbkach. Następnie uzyskane liczby kopii mRNA zostały przeliczone na 1 µg całkowitego RNA. W komórkach BCC ekspresja mRNA hTR była niższa (od 14 550 do 17 351 kopii mRNA hTR/1 µg RNA) w porównaniu z komórkami SCC (14 552 do 98 727 kopii mRNA hTR/1 µg RNA) (tab. 1.). Średnia ekspresja podjednostki hTR genu telomerazy była o ok. 3,8 raza większa w raku kolczystokomórkowym w porównaniu z rakiem podstawnokomórkowym. Ze względu na to, że wariancje porównywanych prób były statystycznie różne (test F Snedecora), porównania średnich dokonano testem t z oddzielną estymacją wariancji, który wykazał, że ekspresja podjednostki hTR genu telomerazy była znamiennie statystycznie wyższa w SCC w porównaniu z BCC (p=0,001) (ryc. 1.).
Omówienie wyników
W naszych badaniach wykazano ekspresję hTR we wszystkich pobranych wycinkach z raka podstawnokomórkowego i raka kolczystokomórkowego. Jednak ocena ilościowa za pomocą real time QRT-PCR wskazała na podwyższoną ekspresję hTR w raku o większej złośliwości (SCC) w porównaniu z rakiem o mniejszej złośliwości (BCC), a zatem możemy podejrzewać, że ekspresja podjednostki hTR genu telomerazy może korelować ze złośliwością choroby. Dane literaturowe potwierdzają nasze wyniki, świadczące o tym, że podwyższona aktywność transkrypcyjna podjednostki hTR może korelować z bardziej złośliwym typem nowotworu skóry. Wiele innych prac wskazuje, że podjednostka hTR obecna jest zarówno w tkankach nowotworowych, jak i prawidłowych, ale poziom jej ekspresji koreluje z przerzutami i wielkością guza w raku żołądka [16] oraz ze stopniem zaawansowania raka krtani [17]. Badania w raku piersi wykazały, że wysoka ekspresja podjednostki hTR wiązała się z gorszą prognozą co do przeżycia [18]. Stwierdzono również, że słaba ekspresja ww. jednostki obserwowana była w łagodnych rozrostach tkanek gruczołu sutkowego, średnia w atypowym rozroście, silna w ciężkim atypowym rozroście, natomiast największą ekspresję stwierdzano w raku sutka, a zatem ekspresja hTR genu telomerazy korelowała ze stopniem zaawansowania choroby nowotworowej [19]. W nowotworach tkanki nerwowej zaobserwowano silną ekspresję podjednostki hTR w zaawansowanych guzach typu neuroblastoma, co wiąże się ze złą prognozą kliniczną, a we wczesnym okresie procesu nowotworowego słabą ekspresję (dobra/bardzo dobra prognoza kliniczna). W związku z tym autorzy wysunęli wniosek, że podjednostka hTR może być dobrym wskaźnikiem agresywności nowotworów tkanki nerwowej [6]. Inne badania wskazują, że podjednostka hTR genu telomerazy może być użyta jako nowy marker diagnostyczny złośliwości czerniaka. Autorzy japońscy wykazali, że ekspresja podjednostki hTR genu telomerazy występowała częściej w czerniaku niż w znamieniu barwnikowym i w normalnej skórze. Co więcej, intensywność ekspresji hTR była statystycznie silniejsza w przerzutujących czerniakach niż w czerniakach niedających przerzutów, co może być wykorzystane w prognozowaniu przerzutowania [7]. Wykazano również, że poziom telomerazowego RNA w tkance czerniaka koreluje z klinicznym stopniem zaawansowania choroby i może pomagać w diagnozie tkanki z linii cięcia operacyjnego [20].
Jednak wyniki badań innych autorów nie potwierdzają korelacji ekspresji podjednostki hTR z chorobą. Okazało się, że ekspresja hTR genu telomerazy występuje zarówno w rakach żołądka i okrężnicy, jak i w normalnej błonie śluzowej i w limfocytach krwi obwodowej [9], w raku płuc i w przyległej do niej prawidłowej tkance [10] oraz w normalnych i nowotworowych wycinkach pobranych z endometrium [11]. Również analizy przeprowadzone przez Hu i wsp. [13] wykazały ekspresję hTR zarówno w prawidłowej skórze, w nieprzerzutowym i złośliwym raku, oraz w rogowaceniu słonecznym i w stanach zapalnych skóry. Wyniki te potwierdzają również badania Wu i wsp., które wykazały ekspresję hTR z podobną częstotliwością zarówno w prawidłowej skórze, jak i w różnych jej schorzeniach (znamię wywodzące się z komórek znamionowych, rogowacenie łojotokowe, guz wywodzący się z gruczołów potowych ekrynowych, choroba Bowena, rogowacenie słoneczne, BCC, MM, mięsak wywodzący się z komórek jasnokomórkowych, SCC, rak wywodzący się z gruczołów potowych ekrynowych, złośliwy guz wywodzący się z histiocytów, złośliwy guz wywodzący się z mięśnia przywłośnego) [12]. Wyniki te wskazują, że ekspresja hTR genu telomerazy nie jest związana ze złośliwymi zmianami skórnymi. Jednak powyższe doniesienia, niepotwierdzające korelacji ekspresji podjednostki hTR z rozwojem choroby nowotworowej żołądka, okrężnicy, płuc, endometrium i skóry opierały się jedynie na badaniu częstości występowania mRNA podjednostki hTR w badanych grupach. Analizy te nie uwzględniały jednak różnic w poziomie aktywności transkrypcyjnej podjednostki hTR. Analiza jakościowa wydaje się być niewystarczająca przy określeniu korelacji pomiędzy aktywnością transkrypcyjną podjednostki hTR a zaawansowaniem choroby. Nasze badania, przeprowadzone na podstawie analizy ilościowej real time QRT-PCR wykazały korelację ekspresji hTR z bardziej złośliwym typem nowotworu skóry, a więc wydaje się, że ocena molekularna podjednostki hTR powinna być wykonana na podstawie analizy ilościowej, a nie tylko jakościowej.
Udział podjednostki hTR w procesie nowotworzenia nie został do końca wyjaśniony. Podjednostka hTR jest składową telomerazy, enzymu, który syntetyzuje DNA telomerów. W trakcie każdego podziału komórek somatycznych zachodzi systematyczne skracanie terminalnych fragmentów chromosomów, czyli utrata DNA telomerów, co prowadzi do blokady podziałów i śmierci komórek. Telomeraza jest enzymem o aktywności odwrotnej transkryptazy specyficznie wydłużającej koniec 3' DNA, a więc utrzymuje ona stałą długość telomerów i zapewnia przekazanie komórce potomnej pełnej informacji genetycznej. Aktywność telomerazową stwierdzono w komórkach nowotworowych, co wiąże się z nieśmiertelnością tych komórek i ich zdolnością do nieograniczonych podziałów [21]. Z danych literaturowych wynika, że podjednostka hTR może regulować zarówno ekspresję [2], jak i aktywność telomerazy [3], a zatem hTR wydaje się być jednym z genów biorących udział w transformacji nowotworowej. Korelacja pomiędzy podwyższoną ekspresją hTR a bardziej złośliwym rakiem SCC nasuwa przypuszczenie, że poziom ekspresji tego genu poprzez silniejszą stymulację telomerazy może wpływać na powstanie bardziej złośliwego raka skóry.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować mgr Longinie Świątkowskiej z Katedry i Zakładu Analizy Instrumentalnej Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach za nieocenioną pomoc w statystycznym opracowaniu wyników.
Piśmiennictwo
1. Counter CM: The roles of telomeres and telomerase in cell life span. Mutat Res 1996; 366: 45-63.
2. Natarajan S, Chen Z, Wancewicz EV, et al.: Telomerase reverse transcriptase (hTERT) mRNA and telomerase RNA (hTR) as targets for downregulation of telomerase activity. Oligonucleotides 2004; 14: 263-73.
3. Hayashidani Y, Hiyama E, Murakami Y, et al.: Attenuation of telomerase activity by hammerhead ribozymes targeting human telomerase RNA and telomerase reverse transcriptase in pancreatic carcinoma cells. Hiroshima J Med Sci 2005; 54: 21-7.
4. Błasiak J, Kadłubek M, Kubryn I, et al.: Expression of human telomerase subunit genes in endometrial cancer. Pol J Gynaecol Investig 2001; 3: 153-6.
5. Nowak J, Januszkiewicz-Lewandowska D, Pernak M, et al.: Wysoka aktywność i ekspresja telomerazy jako marker nowotworowy w ostrych białaczkach u dzieci. Pediat Prakt 2002; 10: 33-6.
6. Maitra A, Yashima K, Rathi A, et al.: The RNA component of telomerase as a marker of biologic potential and clinical outcome in childhood neuroblastic tumors. Cancer 1999; 85: 741-9.
7. Wei Q, Fen S. Significance of human telomerase RNA expression in situ in malignant melanoma. Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao 1999; 24: 107-9.
8. Glukhov AI, Zimnik OV, Gordeev SA, et al. Inhibition of telomerase activity of melanoma cells in vitroby antisense oligonucleotides. Biochem Biophys Res Commun 1998; 248: 368-71.
9. Nowak J, Januszkiewicz D, Lewandowski K, et al.: Activity and expression of human telomerase in normal and malignant cells in gastric and colon cancer patients. Eur J Gastroenterol Hepatol 2003; 15: 75-80.
10. Chen W, Xiong X, Zhou H, et al.: Expression of telomerase activity, telomerase RNA component and telomerase catalytic subunit gene in lung cancer. Chin Med J (Engl) 2002; 115: 290-2.
11. Kyo S, Kanaya T, Takakura M, et al.: Human telomerase reverse transcriptase as a critical determinant of telomerase activity in normal and malignant endometrial tissues. Int J Cancer 1999; 80: 60-3.
12. Wu A, Ichihashi M, Ueda M: Correlation of the expression of human telomerase subunits with telomerase activity in normal skin and skin tumors. Cancer 1999; 86: 2038-44.
13. Hu S, Chan HL, Chen MC, et al.: Telomerase expression in benign and malignant skin neoplasms: comparison of three major subunits. J Formos Med Assoc 2002; 101: 593-7.
14. Chomczyński P, Sacchi N: Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chlorophorm extraction. Anal Biochem 1987; 162: 156-9.
15. Witek A, Mazurek U, Paul M i wsp.: Ilościowa ocena ekspresji genów telomerazy TERT, HTP1 i TR w prawidłowym endometrium. Gin Pol 2001; 72, 12a: 1543-8.
16. Yoo J, Park SY, Kang SJ, wt al.: Expression of telomerase activity, human telomerase RNA, and telomerase reverse transcriptase in gastric adenocarcinomas. Mod Pathol 2003; 16: 700-7.
17. Du BD, Wang P, Liu G, et al.: Telomerase activity and expression of its RNA component in laryngeal cancer. Lin Chuang Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi 2000; 14: 390-2.
18. Poremba C, Heine B, Diallo R, et al.: Telomerase as a prognostic marker in breast cancer: high-throughput tissue microarray analysis of hTERT and hTR. J Pathol 2002; 198: 181-9.
19. Song M, Mi X, Li B, et al.: Expression of telomerase genes in cancer development in atypical hyperplasia of the mammary duct. Chin Med J (Engl) 2002; 115: 1221-5.
20. Ramirez RD, D'Atri S, Pagani E, et al.: Progressive increase in telomerase activity from benign melanocytic conditions to malignant melanoma. Neoplasia 1999; 1: 42-9.
21. Jaruga E. Udział telomerów w regulacji podziałów komórkowych i starzeniu. Kosmos 1999; 48: 255-64.