Genetic analysis of the polymorphisms in nonhomologous DNA end joining gene Ku70 and Ligase IV in postmenopausal breast cancer women

Wstęp

Rak piersi dotyka co dziesiątą kobietę w krajach uprzemysłowionych i jest główną przyczyną śmierci żeńskiej części populacji. Zmiany w obrębie genomu, takie jak translokacje, delecje i duplikacje, są częste w komórkach rakowych, szczególnie w komórkach raka piersi [1–6]. Zmiany w genomie spowodowane są zaburzeniami w naprawie DNA przede wszystkim pęknięć dwuniciowych (double-strand breaks – DSB).

Podwójne pęknięcia DNA są dla komórki śmiertelne w największym stopniu ze wszystkich uszkodzeń DNA. Jeżeli nie nastąpi ich naprawa, dochodzi do utraty fragmentów chromosomów. Kumulowane DSB powodują destabilizację genomu, zmiany w transkrypcji genów, a co za tym idzie – rozwój nowotworów [7, 8]. Pęknięcia dwuniciowe są naprawiane przez dwa mechanizmy – rekombinację homologiczną (homologous recombination – HR) i niehomologiczną (nonhomologous end joining – NHEJ) [9, 10].

Szlak naprawy przez rekombinację homologiczną umożliwia usunięcie uszkodzenia, jednocześnie zapewniając dużą wierność odtwarzania pierwotnej sekwencji zmodyfikowanego DNA. Jako matryca w naprawie uszkodzonego chromosomu wykorzystywana jest cząsteczka DNA cechująca się homologią sekwencyjną. Zwykle stanowi ją nieuszkodzony homolog tego chromosomu. Szlak naprawy DNA przez NHEJ umożliwia połączenie pękniętych nici, nie wymagając istnienia homologii między nimi, system ten cechuje się więc małą wiernością odtwarzania sekwencji wyjściowej. Pomimo to może on stanowić główny szlak naprawy DSB w komórkach ssaków.

Pierwszy etap NHEJ związany jest z przyłączeniem do uszkodzonego DNA heterodimeru składającego się z białek Ku70 (kodowanego przez XRCC6) i Ku80 (kodowanego przez XRCC5). Białka Ku, DNA-PK oraz XRCC4 przyczyniają się do zbliżenia do siebie końców pękniętych cząsteczek [11]. Związany z końcami nici DNA kompleks XRCC4 Ligaza IV dokonuje ligacji pękniętych cząsteczek, co stanowi ostatni etap NHEJ [10].

Ponieważ polimorfizm pojedynczych nukleotydów (single nucleotide polymorphism – SNP) jest bardzo częsty w ludzkim genomie [12], w pracy wybrano SNP w genach szlaku naprawy NHEJ, takich jak Ku70 i Ligaza IV do określenia ich wpływu na rozwój raka piersi.

Cel pracy

Celem badań było określenie związku między polimorfizmem A46922G genu Ku70 oraz polimorfizmem A6008G (Ile591Val) genu Ligazy IV a ryzykiem raka piersi u kobiet po menopauzie.

Materiały i metody

Pacjentki


Pobrano krew od 135 kobiet w wieku pomenopauzalnym chorych na raka piersi, u których stwierdzono brak (n = 55) lub obecność przerzutów (n = 80) do okolicznych węzłów chłonnych. Pacjentki były w wieku 43–82 lat

(średnia wieku 58 lat). Średni rozmiar guza wynosił

20 mm (17–32 mm). Wszystkie nowotwory zostały sklasyfikowane wg skali Scarfa-Blooma-Richardsona. Było

31 (23,0%) nowotworów stopnia I, 81 (60,7%) stopnia II

i 23 (16,3%) stopnia III. W badaniu kontrolnym zastosowano krew osób, u których nie stwierdzono choroby nowotworowej (n = 60).


Genotypowanie


DNA do badań izolowano z zastosowaniem komercyjnie dostępnego zestawu DNA Mini Kit (Qiagen). Genotypowanie w grupie badanej i kontrolnej wybranych polimorfizmów zostało przeprowadzone z wykorzystaniem techniki PCR-RFLP.

Mieszanina reakcyjna (25 l) obejmowała: 60 ng DNA (2 l), 0,2 M startery (0,5 l każdego), 50 M dNTP (deoksynukleotydotrifosforany) (2,5 l), 2,5 l buforu

10  Taq, 1 U polimerazy Taq (Qiagen, Germany) (2,5 l). Reakcję prowadzono w termocyklerze GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems).


Analiza statystyczna


Analizę statystyczną uzyskanych wyników przeprowadzano, stosując program komputerowy STATISTICA w wersji 5.0 (StatSoft, Inc.). Wynik uznawano za istotny statystycznie przy poziomie istotności p < 0,05. Analiza statystyczna rozkładu genotypów oraz alleli w grupie badanej i kontrolnej przeprowadzona została po wcześniejszym potwierdzeniu, że otrzymane układy pozostają w stanie równowagi wg reguły Hardy’ego-Weinberga.

Wyniki

W tabeli I przedstawiono rozkład genotypów polimorfizmu genu Ku70 w grupie chorych na raka piersi i kontrolnej. Stwierdzono statystycznie znaczące różnice (p < 0,05) pomiędzy badanymi grupami. Częstości alleli G i A wynosiły 0,65/0,35 w grupie badanej, a 0,54/0,46 w grupie kontrolnej. U pacjentów częstości genotypów G/G, G/A i A/A różniły się znacząco (p < 0,05) od rozkładu przewidywanego przez prawo Hardy’ego-Weinberga.

Rozkład genotypów A/A, A/G i G/G polimorfizmu genu Ligaza IV, podobnie jak częstości alleli A i G, przedstawiono w tabeli II. Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic (p > 0,05) między badanymi grupami.

Zależność rozkładu genotypów i częstości alleli od stopnia zaawansowania nowotworu wg skali Scarfa-

-Blooma-Richardsona przedstawiono w tabelach III i IV. Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic między badanymi grupami (p > 0,05). Wszystkie rozkłady były zgodne z prawem Hardy’ego-Weinberga.

Dyskusja

DNA jest bardzo precyzyjną cząsteczką, która koduje informacje o składzie i funkcjonowaniu komórek. Uszkodzenia DNA mogą zatem prowadzić do zahamowania cyklu komórkowego, śmierci komórki lub mutacji.

W systemie naprawy NHEJ białka Ku70 i Ku80 wiążą się do podwójnych pęknięć DNA. Do tego procesu potrzebna jest aktywacja białkowej kinazy DNA (DNA-PK).

Kinaza ta wymaga obecności XRCC4 oraz Ligazy IV (LIG4), aby mogło dojść do naprawy uszkodzenia.

Zmiany w genach uczestniczących w naprawie podwójnych pęknięć DNA mogą wpływać na zwiększoną szansę rozwoju raka piersi. Celem prezentowanych badań było określenie, czy warianty polimorficzne w wybranych genach NHEJ, takich jak Ku70 i LIG4, mogą przyczyniać się do rozwoju raka piersi

Kuschel i wsp. sugerują, że warianty w genach XRCC2 i LIG4 wpływają na ryzyko raka piersi wraz z wariantami w genie XRCC3. Warianty polimorficzne genu XRCC2 podwyższają natomiast LIG4 i zmniejszają ryzyko tego nowotworu [13].

Polimorfizm 1310CG w genie Ku70 oraz polimorfizm 2099-2408G>A w genie Ku80 są czynnikami ryzyka raka piersi oraz chromosomalnej wrażliwości na radioterapię. Homozygotyczny wariant genotypu 1781GT (Ku70) wydaje się pełnić funkcję ochronną przed rozwojem raka piersi [14].

Dane z piśmiennictwa wskazują, że polimorfizmy SNPs w Ku70 i XRCC4 mogą być związane z ryzykiem raka piersi [15].

Fu i wsp. określili 30 SNP w 5 genach NHEJ (Ku70, Ku80, DNA-PKcs, Ligaza IV i XRCC4) we wczesnym raku piersi. Dwa SNP – w Ku70 i XRCC4 – korelowały z ryzykiem raka piersi [16].

U kobiet w wieku przedmenopauzalnym cztery warianty pozostają w związku z rakiem piersi – dwa w genie XPF i dwa w genie XRCC3 [17].

W prezentowanej pracy nie znaleziono związku między występowaniem raka piersi a polimorfizmem genu LIG4 u polskich kobiet. Jednakże stwierdzono statystycznie istotne różnice w rozkładzie częstości alleli A i G genu Ku70 między pacjentami a kontrolą grupą osób zdrowych (p < 0,05). Rozkład genotypów G/G, G/A i A/A u pacjentów różnił się od rozkładu przewidywanego przez prawo Hardy’ego-Weinberga, z nad-

ekspresją homozygoty G/G. Jest możliwe, że obecność allelu G pozostaje w związku z innymi niezidentyfikowanymi jeszcze mutacjami zlokalizowanymi poza kodującym regionem genu Ku70, co może być istotne dla stężenia białka Ku70 w osoczu.

Badania sugerują, że polimorfizm genu Ku70 może być związany z ryzykiem raka piersi u polskich kobiet, jednak aby potwierdzić to przypuszczenie, konieczne jest przeprowadzenie badań na większej populacji.

Piśmiennictwo

1. Davidson JM, Gorringe KL, Chin SF, et al. Molecular cytogenetic analysis of breast cancer cell lines. Br J Cancer 2000; 83: 1309-17.

2. Forozan F, Mahlamaki EH, Monni O, et al. Comparative genomic hybridization analysis of 38 breast cancer cell lines: a basis for interpreting complementary DNA microarray data. Cancer Res 2000; 60: 4519-25.

3. Kytola S, Rummukainen J, Nordgren A, et al. Chromosomal alterations in 15 breast cancer cell lines by comparative genomic hybridization and spectral karyotyping. Genes Chromosomes Cancer 2000; 28: 308-17.

4. Loveday RL, Greenman J, Simcox DL, et al. Genetic changes in breast cancer detected by comparative genomic hybridisation. Int J Cancer 2000; 86: 494-500.

5. Romanowicz H, Smolarz B, Fiks T, et al. Znaczenie mechanizmu naprawy DNA błędnie sparowanych zasad azotowych (MMR) w raku piersi. Przegl Menopauz 2010; 2: 95-100.

6. Sobczuk A, Smolarz B, Romanowicz-Makowska H, Pertyński T. Rola polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP) w obrębie genów mechanizmów naprawy DNA przez rekombinację RAD51, XRCC2, XRCC3

i XRCC4 w patogenezie raka piersi u kobiet w wieku pomenopauzalnym. Przegl Menopauz 2009; 4: 228-32.

7. Bahar R, Hartmann CH, Rodriguez KA, et al. Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart. Nature 2006; 441: 1011-4.

8. Vijg J, Dolle ME. Large genome rearrangements as a primary cause of aging. Mech Ageing Dev 2002; 123: 907-15.

9. Jackson SP. Sensing and repairing DNA double-strand breaks. Carcinogenesis 2002; 23: 687-96.

10. Helleday T. Pathways for mitotic homologous recombination in mammalian cells. Mutat Res 2003; 532: 103-15.

11. Lieber MR, Ma Y, Pannicke U, Schwarz K. Mechanism and regulation of human non-homologous DNA end-joining. Nat Rev Mol Cell Biol 2003; 4: 712-20.

12. Seluanov A, Mittelman D, Pereira-Smith OM, et al. DNA end joining becomes less efficient and more error-prone during cellular senescence. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101: 7624-9.

13. Kirk BW, Feinsod M, Favis R, et al. Single nucleotide polymorphism seeking long term association with complex disease. Nucleic Acids Res 2002; 30: 3295-311.

14. Kuschel B, Auranen A, McBride S, et al. Variants in DNA double-strand break repair genes and breast cancer susceptibility. Hum Mol Genet 2002; 11: 1399-407.

15. Willems P, Claes K, Baeyens A, et al. Polymorphisms in nonhomologous end-joining genes associated with breast cancer risk and chromosomal radiosensitivity. Genes Chromosomes Cancer 2008; 47: 137-48.

16. Fu YP, Yu JC, Cheng TC, et al. Breast cancer risk associated with genotypic polymorphism of the nonhomologous end-joining genes: a multigenic study on cancer susceptibility. Cancer Res 2003; 63: 2440-6.

17. Han J, Haiman C, Niu T, et al. Genetic variation in DNA repair pathway genes and premenopausal breast cancer risk. Breast Cancer Res Treat 2009; 115: 613-22.