Genetics research of apoptosis and BRCA1 gene mutations in patients from family with hereditary breast cancer

Wstęp
Fakt występowania rodzinnej, dziedziczonej autosomalnie dominująco predyspozycji do raka piersi skłonił do prowadzenia badań genetycznych, dotyczących tzw. sprzężeń pomiędzy występowaniem określonych markerów genetycznych (fragmentów polimorficznych DNA) a pojawieniem się choroby nowotworowej sutka lub jajnika u członków tych rodzin. Intensywne badania tej, stosunkowo niewielkiej grupy rodzin z dziedziczną predyspozycją do raka piersi, doprowadziły do ważnych odkryć, dotyczących podłoża genetycznego tej choroby [1].
Obecnie uważa się, że mutacje genu BRCA1 występują w 75% rodzin, w których występują zarówno raki sutka, jak i raki jajnika, oraz w 50% rodzin, w których występuje wyłącznie rak piersi [2]. W ostatnich latach wzrosło także zainteresowanie apoptozą, jako istotnym czynnikiem przyczyniającym się do powstawania i rozwoju raka piersi [3, 4]. Dane literaturowe wskazują, że proces apoptozy zachodzi bardzo często w przypadku tego nowotworu [5–8].
Niedawno nastąpił rozwój testów laboratoryjnych umożliwiających wykrycie genetycznych predyspozycji do rozwoju raka piersi. Wprowadzenie tych badań na szeroką skalę będzie miało znaczący wpływ na dotychczasową profilaktykę onkologiczną, zmierzającą do wczesnego wykrywania i leczenia tego nowotworu. Uważa się, że każda kobieta pochodząca z rodziny o podwyższonym ryzyku wystąpienia raka sutka powinna być o tym poinformowana i zaznajomiona z koniecznością wykonania odpowiednich badań. Według Lyncha kobiety te powinny rozpocząć samobadanie piersi już w wieku kilkunastu lat, a od 20. roku życia badanie piersi powinien wykonywać co pół roku lekarz. W wieku 25 lat muszą rozpocząć badania ultrasonograficzne piersi, powtarzane co 6 mies., a następnie także USG narządu rodnego. Począwszy od 35. roku życia powinny raz do roku wykonywać kontrolną mammografię. Jeżeli dojdzie do wykrycia raka w stadium I lub II, zabieg operacyjny w przypadku nosicielek uszkodzonych genów BRCA nie może być oszczędzający – zaleca się obustronną amputację piersi.
Najważniejszym efektem badań molekularnych rodzin z genetyczną predyspozycją do raka piersi jest wyłonienie osób wysokiego ryzyka, u których dzięki systematycznym badaniom profilaktycznym będzie można wykrywać wczesne postacie raka.
W obecnej pracy badano, czy obecność zmian apoptotycznych i mutacji w genie BRCA1 u kobiet z rodzin obciążonych dziedzicznie rakiem piersi może być czynnikiem ryzyka jego wystąpienia.
Materiały i metody
Pacjentki
Krew do badań została uzyskana od 30 kobiet z rodzin obciążonych dziedzicznie rakiem piersi. Wszystkie pacjentki zgłaszały się do Onkologicznej Poradni Genetycznej Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi. Osoby uczestniczące w badaniach wyrażały zgodę na pobranie krwi do badań genetycznych i wypełniały ankietę, podając dane dotyczące historii chorób w poszczególnych pokoleniach.
Jako kontrolę zastosowano krew uzyskaną od zdrowych osób (n=30), u których nie stwierdzono występowania choroby nowotworowej w żadnym pokoleniu.
Analiza apoptozy
Genomowy DNA był izolowany z limfocytów krwi obwodowej pobieranej na cytrynian. Krew była traktowana roztworem lizującym (155 mM NH4CL, 10 mM KHCO3 i 1 mM EDTA, pH 7,4) a następnie buforem ekstrahującym (10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5% SDS i 0,1 mg/ml proteinaza K, pH 8,2) w 57°C, przez całą noc. DNA był wytrącany roztworem 1,5 M NaCl i etanolem. Po przemyciu 70% etanolem, próbka była rozpuszczana w wodzie i stężenie DNA zostało określone poprzez pomiar absorbancji przy długości fali l=260 nm. 3 mikrogramy DNA zostały poddane elektroforezie w 1% żelu agarozowym, z użyciem buforu elektroforetycznego TBE (0,09 M Tris-borate, 2 mM EDTA, pH 8,3). Elektroforeza została przeprowadzona z zastosowaniem napięcia 5 V/cm. Żel był barwiony bromkiem etydyny w stężeniu 1 mg/ml i oglądany w świetle UV (ryc. 1.).
Analiza mutacji genu BRCA1
DNA był izolowany z limfocytów krwi obwodowej z zastosowaniem komercyjnie dostępnego zestawu QIAmp Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Niemcy), zgodnie z zaleceniami producenta.
Analiza mutacyjna została przeprowadzona z zastosowaniem komercyjnie dostępnego zestawu zgodnie z zaleceniami producenta (Pomorski Uniwersytet Medyczny, Szczecin, Polska) (ryc. 2.).
Analiza statystyczna
W celu analizy statystycznej zastosowano test χ², p<0,05 było traktowane jako wynik statystycznie znaczący.
Wyniki
Analiza mutacji genu BRCA1 została przeprowadzona u 30 osób z rodzin obciążonych dziedzicznie tym nowotworem. Wykryto 3 mutacje genu BRCA1; jedną mutację Ex20insC i dwie ExII17delA. Częstość mutacji wynosiła 10% (3/30). Wszystkie mutacje dotyczyły przypadków o wysokiej częstości zmian apoptotycznych. Częstość apoptozy u osób obciążonych dziedzicznie i w kontroli została przedstawiona w tab. I. 11 z 30 osób z rodzin obciążonych dziedzicznie (37%) charakteryzowało się obecnością apoptotycznych uszkodzeń DNA w limfocytach krwi obwodowej, natomiast tylko 4 z 30 przypadków kontrolnych (13%) wykazywało fragmentację DNA. Obecność drabinek apoptotycznych w limfocytach krwi obwodowej u osób z rodzin obciążonych była statystycznie istotnie wyższa niż w kontroli (P<0,05).
Dyskusja
Wiele czynników odgrywa istotną rolę w zapoczątkowaniu rozwoju nowotworu gruczołu piersiowego, a wśród nich ważne miejsce zajmują czynniki genetyczne. Istotnymi regulatorami prawidłowych biologicznych procesów w komórce, np. różnicowania i proliferacji są protoonkogeny komórkowe. Wiele zmian molekularnych, głównie mutacji, może zaburzać funkcje protoonkogenów, prowadząc do ich przekształcenia w onkogeny. Produkty białkowe onkogenów są czynnikami aktywującymi rozwój nowotworu. W nowotworach piersi zaobserwowano zjawisko powstawania wielu kopii (amplifikacji) niektórych onkogenów, lub nadmiernej ekspresji kodowanych przez nie białek. Zjawisko to wiąże się ze zwiększeniem złośliwości guza nowotworowego i tym samym ze złym rokowaniem. Do najczęściej opisywanych onkogenów, ulegających powtarzalnym zaburzeniom w raku piersi należą erbB-2 (HER2/neu), c-myc oraz int2 [9, 10]. Onkogen erbB-2 jest zlokalizowany w 17q21 i koduje glikoproteinę o masie 185 kDa, która jest zaliczana do rodziny receptorów czynników wzrostowych, do których należą m.in. receptor nabłonkowego czynnika wzrostowego (EGFR), oraz białka kodowane przez erbB-3 i erbB-4. Badania wskazują, że onkogen erbB-2 jest markerem agresywności nowotworu gruczołu piersiowego [11].
Geny supresorowe są to geny, które w przypadku utraty swoich funkcji poprzez mutacje somatyczne, głównie delecje, prowadzą w niektórych przypadkach do wzrostu aktywności onkogenów i rozwoju guza nowotworowego. Najsilniej związane z powstawaniem raka piersi są geny supresorowe BRCA1 i BRCA2 [12]. Sugeruje się też, że mutacje w genie supresorowym p53 są koniecznym krokiem w rozwoju wielu nowotworów, w tym raka piersi [13, 14]. Gen supresorowy p53 koduje białko jądrowe, które hamuje progresję cyklu komórkowego, stymuluje naprawę uszkodzonego DNA, jest czynnikiem transkrypcyjnym oraz pełni ważną rolę w indukowaniu apoptozy. Apoptoza indukowana przez p53 pełni istotną rolę w rozwoju nowotworów in vivo, a liczne sygnały mitogenne antagonizują działanie p53 [15, 16].
W celu określenia faktu, czy członkowie rodzin obciążonych dziedzicznie rakiem piersi podlegają zjawisku apoptozy i mutacjom w genie BRCA1 genomowy DNA był izolowany z krwi uzyskanej od osób obciążonych rakiem piersi, zgłaszających się do Onkologicznej Poradni Genetycznej Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi.
Zmiany apoptotyczne zostały znalezione w 37% przypadków rodzin obciążonych rakiem piersi. Stwierdzono, że mutacja w genie BRCA1 występuje u osób z tych rodzin, u których stwierdza się wysoki stopień apoptozy. Sugeruje to, że apoptoza może być związana z wysokim ryzykiem raka piersi u członków tych rodzin, którzy poddali się badaniu genetycznemu.
Wysoka częstość apoptozy oraz mutacji w genie BRCA1 u kobiet obciążonych dziedzicznie rakiem piersi dostarcza motywu do zastosowania tych czynników jako markera wykrywania grupy wysokiego ryzyka wystąpienia tego nowotworu. Kolejne badania, które obejmą większą grupę badaną, są konieczne do potwierdzenia tego przypuszczenia.

Praca powstała w ramach grantów uzyskanych z Komitetu Badań Naukowych nr 3P05C 066 24 i 3 P05E 07124.
Piśmiennictwo
1. Arai M, Utsunomiya J, Miki Y. Familial breast and ovarian cancers. Int J Clin Oncol 2004; 9: 270-82.
2. Narod SA, Foulkes WD. BRCA1 and BRCA2: 1994 and beyond. Nat Rev Cancer 2004; 4: 665-76.
3. Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 1972; 26: 239-257.
4. Wyllie AH. Apoptosis and the regulation of cell numbers in normal and neoplastic tissues: an overview. Cancer and Metastasis Reviews 1992; 11: 95-103.
5. Lipponen P. Apoptosis in breast cancer: relationship with other pathological parameters. Endocr Relat Cancer 1999; 6: 13-6.
6. Mendez O, Manas S, Fabra A, et al. Microsatellite instability is associated with the loss of apoptosis in ductal breast carcinomas. Breast Cancer Res Treat 2001; 65: 171-7.
7. Baekelandt M, Holm R, Nesland JM, et al. Expression of apoptosis-related proteins is an independent determinant of patient prognosis in advanced ovarian cancer. J Clin Oncol 2000; 18: 3775-81.
8. Codegoni AM, Bertoni F, Colelle G, et al. Microsatellite instability and frameshift mutations in genes involved in cell cycle progression or apoptosis in ovarian cancer. Oncol Res 1999; 11: 297-301.
9. Sjogren S, Inganas M, Lindgren A, et al. Prognostic and predictive value of c-erbB-2 overexpression in primary breast cancer, alone and in combination with other prognostic markers. J Clin Oncol 1998; 16: 462-9.
10. Stark A, Hulka B, Scott J, Novotny D. HER-2/neu amplification in benign breast disease and the risk of subsequent breast cancer. J Clin Oncol 2000; 18: 267-74.
11. Revillion F, Bonneterre J, Peyrat JP. ERBB2 oncogene in human breast cancer and its clinical significance. Eur J Cancer, 1998; 34: 791-808.
12. Eisinger F, Jacquemier J, Charpin C, et al. Mutations at BRCA1: the medullary breast carcinoma revisited. Cancer Res 1998; 58: 1588-92.
13. Hollstein M, Sidransky D, Vogelstain B, Haris CC. p53 mutations in human cancers. Science 1991; 253: 49-53.
14. Gretarsdottir S, Thorlacius S, Valgarsdsdottir R, et al. BRCA2 and p53 mutations in primary breast cancer in relation to genetic instability. Cancer Res 1998; 58: 859-62.
15. Symonds H, Krall L, Remington L, et al. p53-dependent apoptosis suppresses tumor growth and progression in vivo. Cell 1994; 78: 703-11.
16. Hong M, Lai MD, Lin YS, Lai MZ. Antagonism of p53-dependent apoptosis by mitogen signals. Cancer Res 1999; 59: 2847-52.
Adres do korespondencji
dr n. med. Hanna Romanowicz-Makowska
Pracownia Biologii Molekularnej,
Zakład Patomorfologii Klinicznej
Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki
ul. Rzgowska 281/289
93-338 Łódź
tel. +48 42 271 20 71
e-mail: smolbea@wp.pl