Geny BRAF, NRAS, HRAS w liniach komórkowych czerniaka ludzkiego

WPROWADZENIE

Czerniak złośliwy wywodzi się z komórek barwnikowych (melanocytów). W życiu płodowym melanoblasty wędrują z cewy nerwowej do skóry, układu nerwowego, błon śluzowych, ucha wewnętrznego oraz naczyniówki oka i dlatego czerniak, który najczęściej lokalizuje się w skórze, może również powstawać w obrębie innych tkanek zawierających melanocyty, np. w naczyniówce oka [1].
Od kilkudziesięciu lat obserwuje się zwiększoną zachorowalność na ten nowotwór. Czynniki prowadzące do transformacji nowotworowej melanocytów nie są do końca poznane. Oparzenia słoneczne w dzieciństwie stanowią najpoważniejszy czynnik ryzyka zwiększający prawdopodobieństwo wystąpienia tego nowotworu [2]. Zwiększenie liczby zachorowań na czerniaka złośliwego obserwuje się również u pacjentów poddanych fotochemoterapii [3]. Innymi czynnikami ryzyka są m.in.: zaawansowany wiek, I i II fototyp skóry według Fitzpatricka, zespół znamion atypowych i znamion wrodzonych olbrzymich, ekspozycja na promieniowanie jonizujące, immunosupresja oraz niektóre zaburzenia genetyczne, takie jak xeroderma pigmentosum [1]. Zwiększone ryzyko rozwoju czerniaka złośliwego zaobserwowano wśród pracowników narażonych na działanie chlorku winylu, pracowników przemysłu naftowego oraz osób zakażonych wirusami brodawczaka ludzkiego (HPV 16, HPV 18, HPV 24, HPV SCI, DL284, DL297, DL436) [4–6]. Rodzinne występowanie czerniaka stwierdza się w około 10% przypadków [7].
Mechanizm inicjacji nowotworowej oraz udział poszczególnych genów w progresji nowotworu są tematem wielu opracowań na temat jego patogenezy. W procesie inicjacji i progresji choroby znaczącą rolę odgrywa uszkodzenie genów kodujących białka regulatorowe cyklu komórkowego (zwłaszcza fazy G1), apoptozy i melanogenezy. W ostatnich latach w badaniach nad patogenezą czerniaka coraz większą uwagę zwraca się na drogę sygnałową Ras/Raf/MEK/ERK, której poszczególne elementy są uszkodzone w komórkach czerniaka złośliwego o małym stopniu zaawansowania klinicznego. Obserwacje te sugerują udział genów BRAF, NRAS, KRAS i HRAS w mechanizmie inicjacji onkogenezy.
Homeostaza komórki barwnikowej zależy od równowagi między procesami proliferacji, nekrozy i apoptozy. Promieniowanie ultrafioletowe oraz inne czynniki ryzyka mogą prowadzić do zaburzeń regulacji cyklu komórkowego. Melanocyty, które „uwolniły się” spod kontroli proliferacji, ulegają szybkim podziałom. Liczba komórek z uszkodzonym aparatem genetycznym zwiększa się, a szybko przebiegający cykl komórkowy sprzyja powstawaniu nowych mutacji. Czas trwania cyklu komórkowego zależy głównie od fazy G1, która podlega kontroli sprawowanej przez protoonkogeny i antyonkogeny wchodzące w skład dróg regulacyjnych z udziałem białek pRb oraz p53. Nieprawidłowe funkcjonowanie białek regulatorowych cyklu komórkowego jest istotnym elementem w inicjacji i progresji nowotworu, dlatego niektórzy autorzy uważają chorobę nowotworową za chorobę zaburzonego cyklu komórkowego [8].
Droga sygnałowa Ras/Raf/MEK/ERK
Droga sygnałowa ERK występuje we wszystkich komórkach eukariotycznych i kontroluje procesy proliferacji, migracji, różnicowania oraz apoptozy (ryc. 1.). Aktywacja jej odbywa się z udziałem wielu czynników wzrostu, hormonów, czynników odpowiedzialnych za różnicowanie komórek oraz czynników onkogennych. Czynniki zewnątrzkomórkowe przyłączają się do odpowiednich receptorów RTK (ang. receptor tyrosin kinase), powodując dimeryzację receptorów i autofosforylację reszt tyrozynowych. Ufosforylowane reszty tyrozynowe wiążą się z białkiem Grb2 (ang. growth-factor-receptor-bound protein 2). Białko Grb2 łączy się w kompleks z czynnikiem wymiany GDP/GTP, tzw. SOS (ang. son of sevenless), i przenosi go do błony komórkowej [9].
Białka Ras (należące do białek G) są produktem ekspresji trzech genów (N-Ras, K-Ras, H-Ras) i licznych modyfikacji potranslacyjnych, takich jak: prenylacja, proteoliza, metylacja i palmitylacja. Białka Ras związane z guanozynodwufosforanem (GDP) są nieaktywne. Ich aktywacja następuje po uwolnieniu GDP i przyłączeniu guanozynotrójfosforanu (GTP). Proces ten zachodzi z udziałem czynnika wymiany SOS. Jedną z dróg sygnałowych związanych z białkiem Ras jest rodzina białek o aktywności kinaz serynowo/treoninowych, tzw. MAPKs (ang. mitogen activated protein kinases). Aktywne białko Ras przyłącza się do białek Raf (A-Raf, B-Raf, C-Raf/Raf1) i przenosi je do błony komórkowej. Do aktywacji białka B-Raf wystarczy utworzenie kompleksu z białkiem Ras, podczas gdy do aktywacji innych białek Ras konieczne są dodatkowe czynniki. Białko B-Raf inicjuje kaskadę fosforylacji, która dotyczy białek MEK1 i MEK2, a następnie ERK1 i ERK2. W cząsteczkach ERK1 fosforylacji ulegają dwie reszty serynowe, a w cząsteczkach ERK2 motyw Thr-Glu-Tyr znajdujący się w pętli aktywacyjnej. Białka ERK stanowią ostatni punkt drogi sygnałowej Ras/Raf/MEK/ERK. W postaci ufosfo-rylowanej kontrolują wiele procesów w obrębie cytozolu, a także przenikają do jądra komórkowego, gdzie regulują ekspresję genów przez fosforylację i aktywację wielu czynników transkrypcyjnych. Wśród genów kontrolowanych przez drogę sygnałową Ras/Raf/MEK/ERK znajdują się geny kodujące białka odpowiedzialne za regulację fazy G1 cyklu komórkowego. Zaburzenia regulacji cyklu komórkowego są jednym z mechanizmów inicjujących przekształcenie prawidłowego melanocytu w komórkę czerniaka złośliwego [10].
Białka Ras odpowiadają również za aktywację innych dróg sygnałowych, takich jak MEKK/SEK/JNK (ang. jun N-terminal kinases), PI3K (ang. phosphatidylinositol 3-kinase)/Akt/NF-KappaB (ang. nuclear factor-kappa B), p120-GAP/p190-B/Rac/NF-KappaB, Raf/MEKK1/IKK (ang. I-kappaB kinase)/I-KappaB/NF-KappaB. Budowa liganda aktywującego białko Ras oraz typ drogi przekazującej sygnał do wnętrza komórki decyduje o rodzaju odpowiedzi na działający bodziec. Aktywacja drogi Ras/Raf/MEK/ERK odgrywa zasadniczą rolę w regulacji proliferacji i w procesie apoptozy, podczas gdy przekazywanie sygnału drogą PI3K/Akt/ NF-KappaB chroni komórkę przed śmiercią [11] (ryc. 1.).

CEL PRACY

Analiza molekularna w zakresie eksonu 2 i 3 (geny NRAS, HRAS) oraz eksonu 11 i 15 (gen BRAF) w liniach komórkowych czerniaka ludzkiego.

MATERIAŁ I METODYKA

W wybranych liniach komórkowych czerniaka ludzkiego przeprowadzono analizę molekularną w zakresie eksonu 2 i 3 (geny NRAS, HRAS) oraz eksonu 11 i 15 (gen BRAF). Grupę kontrolną stanowiły leukocyty krwi obwodowej 10 ochotników. Opis analizowanych siedmiu linii komórkowych czarniaka ludzkiego przedstawiono w tabeli I.
Reakcja PCR
Materiał genetyczny izolowano za pomocą zestawu do izolacji genomowego DNA GENOMIC MINI według załączonego protokołu.
Ocenę stężenia i czystości uzyskanego materiału wykonano, wykorzystując właściwości spektrofotometryczne DNA. Analizę czystości i stężenia DNA przeprowadzono za pomocą aparatu Gene Ray UV Photometr (Biometria). Stosunek absorbancji fal o długości od 260 do 280 nm był miarą czystości uzyskanego roztworu DNA (A260/A280). Wartość współczynnika A260/A280 mieszcząca się w przedziale 1,7–2 świadczyła o prawidłowej czystości roztworu DNA.
Stężenie DNA dwuniciowego obliczano, wykorzystując wzór:
C [mg/ml] = A260 × 50 × R (rozcieńczenie) 1 OD (jednostka optyczna) dla dwuniciowego DNA = 50.
Stopień degradacji DNA oceniano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

Etapy reakcji PCR – SSCP
Reakcja PCR
Skład mieszaniny na jedną próbę (V = 20 ml):
• polimeraza Taq – 0,16 ml,
• startery – 0,5 ml (każdy),
• dNTP’s – 1,6 ml,
• bufor zawierający jony Mg2+ – 2 ml,
• woda – 6,24 ml,
• matryca DNA – 9 ml.
Warunki reakcji PCR:
1) wstępna denaturacja 95°C – 5 minut,
2) denaturacja 95°C – 1 minuta,
3) przyłączanie starterów 53°C – 30 sekund,
4) elongacja 72°C – 2 minuty,
5) cykl powtarzano 40× od etapu 2.,
6) końcowe wydłużanie 72°C – 10 minut,
7) inkubacja w 4°C do wyciągnięcia prób.
Reakcje przeprowadzano z użyciem termocyklera Eppendorf Master-Personal.
Reakcja SSCP
Po zakończonej reakcji PCR do produktu dodawano 5 ml buforu denaturującego firmy BioRad. Całość inkubowano w temperaturze 98°C przez 10 minut, a następnie przenoszono na lód do momentu naniesienia na żel. Następnie dokonywano rozdziału elektroforetycznego.
Analiza produktów PCR – SSCP
Rozdział elektroforetyczny przeprowadzono w 10-procentowym żelu PAA (29 : 1) w buforze 1XTAE. Czas rozdziału wynosił 4 godziny, a moc 10 W. Przez cały proces utrzymywano temperaturę nieprzekraczającą 10°C.
Do uwidocznienia produktów na żelu wykorzystano ich zdolność do wiązania się ze srebrem. Wyniki oceniano i archiwizowano za pomocą zestawu UVP.

WYNIKI

Wyniki badania molekularnego linii komórkowych czerniaka ludzkiego metodą PCR przedstawiono w tabeli II. We wszystkich siedmiu liniach komórkowych stwierdzono uszkodzenia eksonów w zakresie badanych genów. Nie odnotowano mutacji w zakresie badanych eksonów w grupie kontrolnej.

OMÓWIENIE

Podłoże genetyczne czerniaka jest przedmiotem intensywnych badań prowadzonych przez liczne ośrodki naukowe. Zidentyfikowano wiele genów zaangażowanych w proces transformacji nowotworowej oraz predysponujących do zachorowania na czerniaka.
Istotne znaczenie w inicjacji i progresji czerniaka mają protoonkogeny – NRAS, BRAF, KIT, CDK4, CTN NB1, MITF, CCND1, PIK3CA, AKT – oraz geny supresorowe INK4A, ARF, PTEN i TP53. Uszkodzenia protoonkogenów oraz genów supresorowych prowadzą do zaburzeń sygnałowych kontrolujących procesy wzrostu, różnicowania i apoptozy [12, 13].
Najczęściej występującą w komórkach czerniaka zmianą genetyczną skutkującą zaburzeniami w drodze sygnałowej Ras/Raf/MEK/ERK jest mutacja w genie BRAF, którą stwierdza się w 10–80% przypadków czerniaka [14, 15]. Mutacje w genie BRAF występują częściej w czerniakach w fazie wzrostu wertykalnego i w czerniakach przerzutowych (62–80%) w porównaniu z czerniakami w fazie wzrostu powierzchniowego (10–33%) [14–16]. Dużą (70–88%) częstość mutacji genu BRAF stwierdza się w znamionach barwnikowych, co może wskazywać na udział onkogenu BRAF w inicjacji czerniaka [17]. Mutacje w genie BRAF mają charakter substytucji i występują w egzonie 11 lub 15. Najczęściej spotykanym defektem genu BRAF jest mutacja w eksonie 15 (zamiana waliny na kwas glutaminowy, lizynę, argininę lub kwas asparaginowy w kodonie 599 lub 600) [14, 17].
W przeprowadzonym badaniu mutację genu BRAF stwierdzono w 5 (71%) z 7 analizowanych linii komórkowych. Wyniki te są porównywalne z wynikami badań Daviesa i wsp., w których mutację genu BRAF zidentyfikowano w 6 (67%) z 9 linii komórkowych czerniaka [14].
Istotne znaczenie w transformacji nowotworowej czerniaka mają geny należące do rodziny genów RAS. Onkogenne mutacje w genach RAS stwierdzono również w wielu innych nowotworach, m.in. w raku trzustki, okrężnicy, tarczycy, płuc, gruczolakoraku żołądka oraz w ostrej białaczce szpikowej [18]. Mutacje w genach NRAS dotyczą kodonów 11, 12, 13 i 18 w eksonie 1 oraz 59 i 61 w eksonie 2. Najczęściej stwierdzaną mutacją jest substytucja glutaminy przez lizynę bądź argininę w kodonie 61 [19]. Mutacje genu NRAS stwierdza się w 5–37% przypadków czerniaka sporadycznego [20–31]. Wykazano, że mutacje w genie NRAS występują częściej w rodzinnych niż w sporadycznych czerniakach. Mutacje w kodonie 61 genu NRAS wykryto w 95% przypadków czerniaka z mutacją germinalną genu CDKN2A [32]. Mutacje w genie NRAS zidentyfikowano w różnych stadiach rozwoju czerniaka: w czerniaku przedinwazyjnym (melanoma in situ), czerniaku pierwotnym o wzroście obwodowym oraz w fazie przerzutowej czerniaka. Zaobserwowano, że mutacje w eksonie 1 genu NRAS występują częściej w fazie inicjacji nowotworowej, natomiast mutacje w eksonie 2 w późniejszych fazach rozwoju czerniaka [33]. Ugurel i wsp. zidentyfikowali mutacje genu NRAS w 26 (24,8%) ze 105, natomiast Reinfenberger i wsp. w 2 (33%) z 6 analizowanych linii komórkowych czerniaka [34, 35]. We wszystkich 7 badanych przez autorów niniejszego opracowania liniach komórkowych czerniaka stwierdzono obecność mutacji w genie NRAS. Porównywalnie dużą (80%) częstość mutacji w genie NRAS odnotowano we wrodzonych znamionach melanocytowych [36].
Mutacje w genach HRAS i KRAS w czerniakach stwierdza się bardzo rzadko. Demunter i wsp. [33] przeprowadzili badanie mające na celu ocenę częstości występowania mutacji genu KRAS w czerniaku. Badaniu poddano 69 pierwotnych czerniaków złośliwych, 35 czer- niaków przerzutowych oraz 7 melanocytowych znamion komórkowych. W żadnym ze 111 analizowanych przypadków nie odnotowano mutacji w genie KRAS [33].
Reifenberger i wsp. [35] w 1 z 37 analizowanych przypadków czerniaka zidentyfikowali mutację w eksonie 1 genu KRAS o charakterze substytucji glicyny przez kwas asparaginowy w kodonie 12. Mutację genu KRAS wykryto u pacjenta z czerniakiem i przerzutami do mózgu. W żadnym z 37 analizowanych przypadków nie stwierdzono mutacji genu HRAS [35]. Shukla i wsp. [24] zidentyfikowali w 3 z 22 analizowanych przypadków czerniaka pierwotnego mutację w eksonie 1 genu KRAS. W jednym przypadku zidentyfikowano również mutację w eksonie 1 genu HRAS [24]. Znacząco większą w porównaniu z czerniakiem częstość mutacji genu HRAS równą 29% zaobserwowano w znamionach Spitz [37].
Większość autorów jest zgodna co do tego, że mutacje NRAS i BRAF wzajemnie się wykluczają [14, 38]. W badaniu przeprowadzonym przez Goel i wsp. jednoczesne występowanie mutacji BRAF i NRAS stwierdzono w 2 z 69 analizowanych przypadków czerniaka [39]. W przeprowadzonym przez autorów badaniu w 5 z 7 analizowanych linii komórkowych czerniaka odnotowano jednoczesne występowanie mutacji w genach BRAF, NRAS i HRAS. Wyniki te nie potwierdzają teorii wzajemnego wykluczania się mutacji w zakresie badanych genów.
Analiza udziału drogi sygnałowej Ras/Raf/MEK/ERK w patogenezie czerniaka wymaga dalszych badań, których wyniki mogą przyczynić się do opracowania metod skutecznego leczenia tego nowotworu.

Piśmiennictwo

1. Negrier S., Fervers B., Bailly C., Beckendorf V., Cupissol D., Dalac S. i inni: Cutaneous melanoma. Br J Cancer 2001, 84 (Supl. 2), 81-85.
2. Gilchrest B.A., Eller M.S., Geller A.C., Yaar M.: The pathogenesis of melanoma induced by ultraviolet radiation. N Engl J Med 1999, 340, 1341-1348.
3. Stern R.S.; PUVA follow up study. The risk of melanoma in association with long-term exposure to PUVA. J Am Acad Dermatol 2001, 44, 755-761.
4. Langärd S., Rosenberg J., Andersen A., Heldaas S.S.: Incidence of cancer among workers exposed to vinyl chloride in polyvinyl chloride manufacture. Occup Environ Med 2000, 57, 65-68.
5. Wong O., Raabe G.K.: A critical review of cancer epidemiology in the petroleum industry, with a meta-analysis of a combined database of more than 350,000 workers. Regul Toxicol Pharmacol 2000, 32, 78-98.
6. Miracco C., Palummo N., Lavergne D., Nyongo A., Tosi P., de Villiers E.M.: Malignant melanomas: search for human papillomaviruses. Arch Dermatol 2001, 137, 826-827.
7. Piepkorn M.: Melanoma genetics: an update with focus on the CDKN2A(p16)/ARF tumor suppressors. J Am Acad Dermatol 2000, 42, 705-722.
8. Bartek J., Lukas J., Bartkova J.: Perspective: defects in cell cycle control and cancer. J Pathol 1999, 187, 95-99.
9. Aoki Y., Niihori T., Narumi Y., Kure S., Matsu- bara Y.: The RAS/MAPK syndromes: novel roles of the RAS pathway in human genetic disorders. Hum Mutat 2008, 29, 992-1006.
10. Haluska F., Pemberton T., Ibrahim N., Kalinsky K.: The RTK/RAS/BRAF/PI3K pathways in melanoma: biology, small molecule inhibitors, and potential applications. Semin Oncol 2007, 34, 546-554.
11. Haluska F.G., Tsao H., Wu H., Haluska F.S., La- zar A., Goel V.: Genetic alterations in signaling pathways in melanoma. Clin Cancer Res 2006, 12, 2301s-2307s.
12. Dahl C., Guldberg P.: The genome and epigenome of malignant melanoma. APMIS 2007, 115, 1161-1176.
13. Takata M., Saida T.: Genetic alterations in melanocytic tumors. J Dermatol Sci 2006, 43, 1-10.
14. Davies H., Bignell G.R., Cox C.: Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature 2002, 417, 949-954.
15. Dong J., Phelps R.G., Qiao R., Yao S., Benard O., Ronai Z. i inni: BRAF oncogenic mutations correlate with progression rather than initiation of human melanoma. Cancer Res 2003, 63, 3883-3885.
16. Sasaki Y., Niu C., Makino R., Kudo C., Sun C., Watanabe H. i inni: BRAF point mutations in primary melanoma show different prevalences by subtype. J Invest Dermatol 2004, 123, 177-183.
17. Pollock P.M., Harper U.L., Hansen K.S., Yudt L.M., Stark M., Robbins C.M. i inni: High frequency of BRAF mutations in nevi. Nat Genet 2002, 33, 19-20.
18. O’Hara B.M., Oskarsson M., Tainsky M.A., Blair D.G.: Mechanism of activation of human ras genes cloned from a gastric adenocarcinoma and a pancreatic carcinoma cell line. Cancer Res 1986, 46, 4695-4700.
19. Omholt K., Karsberg S., Platz A., Kanter L., Ringborg U., Hansson J.: Screening of N-ras codon 61 mutations in paired primary and metastatic cutaneous melanomas: mutations occur early and persist throughout tumor progression. Clin Cancer Res 2002, 8, 3468-3474.
20. van Elsas A., Zerp S.F., van der Flier S., Krüse K.M., Aarnoudse C., Hayward N.K. i inni: Relevance of ultraviolet-induced N-ras oncogene point mutations in development of primary human cutaneous melanoma. Am J Pathol 1996, 149, 883-893.
21. Raybaud F., Noguchi T., Marics I., Adelaide J., Planche J., Batoz M. i inni: Detection of a low frequency of activated ras genes in human melanomas using a tumo-rigenicity assay. Cancer Res 1988, 48, 950-953.
22. Van‘t Veer L.J., Burgering B.M., Versteeg R., Boot A.J., Ruiter D.J., Osanto S. i inni: N-ras mutations in human cutaneous melanoma from sun-exposed body sites. Mol Cell Biol 1989, 9, 3114-3116.
23. Albino A.P., Nanus D.M., Mentle I.R., Cordon-Cardo C., McNutt N.S., Bressler J. i inni: Analysis of ras oncogenes in malignant melanoma and precursor lesions: correlation of point mutations with differentiation phenotype. Oncogene 1989, 4, 1363-1374. 24. Shukla V.K., Hughes D.C., Hughes L.E., McCormick F., Padua R.: Ras mutations in human melanotic lesions: K-ras activation is a frequent and early event in melanoma development. Oncogene Res 1989, 5, 121-127.
25. Ball N.J., Yohn J.J., Morelli J.G., Norris D.A., Golitz L.E., Hoeffler J.P.: RAS mutations in human melanoma: a marker of malignant progression. J Invest Dermatol 1994, 102, 285-290.
26. Carr J., Mackie R.M.: Point mutations in the N-ras oncogene in malignant melanoma and congenital naevi. Br J Dermatol 1994, 131, 72-77.
27. Platz A., Ringborg U., Månsson Brahme E., La-gerlöf B.: Melanoma metastases from patients with hereditary cutaneous malignant melanoma contain a high frequency of N-ras activating mutations. Melanoma Res 1994, 4, 169-177.
28. Jafari M., Papp T., Kirchner S., Diener U., Henschler D., Burg G. i inni: Analysis of ras mutations in human melanocytic lesions: activation of the ras gene seems to be associated with the nodular type of human malignant melanoma. J Cancer Res Clin Oncol 1995, 121, 23-30.
29. Platz A., Sevigny P., Norberg T., Ring P., La- gerlöf B., Ringborg U.: Genes involved in cell cycle G1 checkpoint control are frequently mutated in human melanoma metastases. Br J Cancer 1996, 74, 936-941.
30. Jiveskog S., Ragnarsson-Olding B., Platz A., Ringborg U.: N-ras mutations are common in melanomas from sun-exposed skin of humans but rare in mucosal membranes or unexposed skin. J Invest Dermatol 1998, 111, 757-761.
31. Demunter A., Ahmadian M.R., Libbrecht L., Stas M., Baens M., Scheffzek K. i inni: A novel N-ras mutation in malignant melanoma is associated with excellent prognosis. Cancer Res 2001, 61, 4916-4922.
32. Eskandarpour M., Hashemi J., Kanter L., Ringborg U., Platz A., Hansson J.: Frequency of UV-inducible NRAS mutations in melanomas of patients with germline CDKN2A mutations. J Natl Cancer Inst 2003, 95, 790-798.
33. Demunter A., Stas M., Degreef H., De Wolf-Pee- ters C., van den Oord J.J.: Analysis of N- and K-ras mutations in the distinctive tumor progression phases of melanoma. J Invest Dermatol 2001, 117, 1483-1489.
34. Ugurel S., Thirumaran R.K., Bloethner S., Gast A., Sucker A., Mueller-Berghaus J. i inni: B-RAF and N-RAS mutations are preserved during short time in vitro propagation and differentially impact prognosis. PLoS ONE 2007, 2: e236.
35. Reifenberger J., Knobbe C.B., Sterzinger A.A., Blaschke B., Schulte K.W., Ruzicka T. i inni: Frequent alterations of Ras signaling pathway genes in sporadic malignant melanomas. Int J Cancer 2004, 109, 377-384.
36. Bauer J., Curtin J.A., Pinkel D., Bastian B.C.: Congenital melanocytic nevi frequently harbor NRAS mutations but no BRAF mutations. J Invest Dermatol 2007, 127, 179-182.
37. van Dijk M.C., Bernsen M.R., Ruiter D.J.: Analysis of mutations in B-RAF, N-RAS, and H-RAS genes in the differential diagnosis of Spitz nevus and spitzoid melanoma. Am J Surg Pathol 2005, 29, 1145-1151.
38. Tsao H., Zhang X., Fowlkes K., Haluska F.G.: Relative reciprocity of NRAS and PTEN/MMAC1 alterations in cutaneous melanoma cell lines. Cancer Res 2000, 60, 1800-1804.
39. Goel V.K., Lazar A.J., Warneke C.L., Redston M.S., Haluska F.G.: Examination of mutations in BRAF, NRAS, and PTEN in primary cutaneous melanoma. J Invest Dermatol 2006, 126, 154-160.

ADRES DO KORESPONDENCJI:
dr med. Rafał Czajkowski
Katedra Biologii Medycznej,
Zakład Inżynierii Tkankowej
Collegium Medicum
im. Ludwika Rydygiera
w Bydgoszczy
Uniwersytetu
Mikołaja Kopernika
w Toruniu, ul. Karłowicza 24
85-092 Bydgoszcz
tel./faks +48 52 585 37 37

Otrzymano: 29 V 2009 r.
Zaakceptowano: 9 VI 2009 r.